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Cancer Cell ：腫瘤微生物+單細(xì)胞+免疫，最新前沿！
腫瘤微生物與宿主細(xì)胞以及與腫瘤免疫微環(huán)境的互作研究已成為最新科研前沿。2022年6月，Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology發(fā)表了題為The tumour-associated microbiome的評論文章，闡述了腫瘤相關(guān)微生物與腫瘤微環(huán)境的關(guān)系以及對癌癥治療的影響。2022年11月，Nature雜志上共同發(fā)表了題為Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer的文章，揭示了腫瘤微生物與宿主細(xì)胞的相互作用，其中為了揭示兩者在單細(xì)胞層面的關(guān)系，作者用了單細(xì)胞RNA測序技術(shù)去捕獲微生物的轉(zhuǎn)錄本信息。由此可見，腫瘤微生物+單細(xì)胞+免疫，已成為腫瘤研究的最新前沿！
今天小編給大家?guī)?022年10月發(fā)表在Cancer Cell（IF:38.585）上的腫瘤微生物研究，該研究基于單細(xì)胞技術(shù)分析腫瘤微生物與宿主的相互作用，揭示胰腺癌中與腫瘤細(xì)胞特異性配對的微生物，它們的存在與細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)和通路活動有關(guān)，包括細(xì)胞運(yùn)動和免疫信號傳導(dǎo)。同時該研究揭示了腫瘤-微生物組串?dāng)_可能調(diào)節(jié)胰腺癌的腫瘤發(fā)生，對臨床管理具有意義。
前言
研究表明胰腺癌患者的腫瘤中含有多樣化的微生物群，以及與微生物肽具有同源性的腫瘤新抗原。.這些微生物群產(chǎn)物可改變基因調(diào)控，誘導(dǎo)DNA損傷，刺激模式識別受體，增強(qiáng)突變KRAS信號，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生和免疫抑制，與胰腺癌患者的化療耐藥性和預(yù)后顯著相關(guān)。
腫瘤微生物的研究存在以下難題，許多腸道微生物難以培養(yǎng)、個體間的微生物組差異大、少有模型揭示腫瘤-微生物間細(xì)胞層面的相互作用以及術(shù)后樣本污染使數(shù)據(jù)分析復(fù)雜化等。在本研究中，作者使用宿主-微生物組相互作用的單細(xì)胞分析技術(shù)SAHMI，在單細(xì)胞分辨率下檢測胰腺癌中的腫瘤-微生物組關(guān)系。
研究結(jié)果
scRNA-seq數(shù)據(jù)中宏基因組reads的檢測和驗(yàn)證
作者基于開發(fā)的SAHMI技術(shù)在單細(xì)胞分辨率下評估宿主-微生物組之間的相互作用。簡單來說，SAHMI將讀取單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)的reads，并用基于K-mer分類方法的Kraken2Uniq軟件與參考宿主和微生物基因組進(jìn)行比對并降噪，SAHMI通過使用分位數(shù)檢驗(yàn)比較單個分類單元計數(shù)與其在陰性對照樣本中的分布來識別假陽性分類分配和污染，然后，去噪的微生物譜可以與宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組共同分析，可以與共享相同的scRNA-seq cell barcode的單個體細(xì)胞配對。
作者整合了兩個數(shù)據(jù)集scPDA1 和 scPDA2，包括41個胰腺導(dǎo)管腺癌（PDA）腫瘤樣本和14個正常胰腺組織的數(shù)據(jù)，SAHMI將94%的reads比對到宿主，4%為未分類，0.6%被分類為微生物物種，包括1962屬和7236種。作者在去除可能的假陽性分類和污染物物種后，并與其他技術(shù)如16S-rDNA測序的胰腺癌以及其他部位的微生物組數(shù)據(jù)進(jìn)行交叉驗(yàn)證比較。這些基準(zhǔn)和驗(yàn)證分析表明了SAHMI識別PDA 樣本scRNA-seq數(shù)據(jù)中來自微生物組reads的可靠性和準(zhǔn)確性。
PDA中與細(xì)胞特異性相關(guān)的微生物
作者鑒定出19個同時存在于scPDA1和scPDA2中的細(xì)菌屬。該研究中，與正常樣本相比，腫瘤樣本的微生物總數(shù)普遍增加。在腫瘤樣本中，一部分barcode也標(biāo)記了體細(xì)胞RNA（scPDA1,8.7%；scPDA2,8.9%），這提供了這些細(xì)菌與宿主細(xì)胞共定位的證據(jù)。宿主細(xì)胞和細(xì)菌的barcode配對表明，這些微生物與體細(xì)胞有關(guān)，但不能確定它們是細(xì)胞內(nèi)的還是細(xì)胞外的，然而已有研究提供成像數(shù)據(jù)表明在胰腺腫瘤中檢測到的大多數(shù)細(xì)菌都是細(xì)胞內(nèi)的。該研究中作者確定了胰腺癌中獨(dú)特的細(xì)菌相關(guān)的腫瘤狀態(tài)，這與先前的研究報道一致。
作者用UMAP可視化體細(xì)胞數(shù)據(jù)時，觀察到細(xì)菌在不同細(xì)胞類型中的分布并不均勻。同一細(xì)胞亞型內(nèi)，與細(xì)菌相關(guān)的細(xì)胞通常聚集在一起，表現(xiàn)出共享的、廣泛的基因表達(dá)變化。在所有細(xì)胞亞型中，腫瘤細(xì)胞中相關(guān)細(xì)菌總數(shù)最多，而免疫細(xì)胞與腫瘤內(nèi)的細(xì)菌有非特異性的相互作用。這些數(shù)據(jù)表明，胰腺腫瘤樣本具有改變的微生物群，可能對惡性腫瘤細(xì)胞具有細(xì)菌趨向性。
微生物與細(xì)胞類型特異性的多樣性和活動有關(guān)
細(xì)菌相關(guān)宿主細(xì)胞的共聚增加了宿主細(xì)胞因細(xì)菌存在而發(fā)生轉(zhuǎn)錄變化的可能性。在scPDA1和scPDA2中，帶有細(xì)胞相關(guān)細(xì)菌的樣本的腫瘤和髓系細(xì)胞的多樣性顯著增加，而T細(xì)胞群的多樣性顯著減少。
作者進(jìn)一步研究了細(xì)菌的存在是否與宿主細(xì)胞類型特異性的基因的表達(dá)有關(guān)。在細(xì)菌有/無存在的樣本中，共鑒定出571個差異基因，部分基因在scPDA1和scPDA2中具有共同調(diào)控方向，腫瘤細(xì)胞中差異表達(dá)基因的數(shù)量最多。例如，艱難梭菌存在的腫瘤細(xì)胞，EDIL3表達(dá)明顯增加，該基因已被報道涉及多種組織的無菌和微生物誘導(dǎo)的炎癥，同時和胰腺癌的腫瘤生長和不良預(yù)后相關(guān)。與幽門螺桿菌共定位的腫瘤細(xì)胞中CRABP2的表達(dá)顯著增加，該基因已被報道為一種致癌基因，在口腔念珠菌病和癌癥的體內(nèi)模型中表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明SAHMI鑒定的微生物可能與PDA的關(guān)鍵生長和炎癥過程有關(guān)。
作者進(jìn)一步對這些差異基因進(jìn)行了通路富集分析。結(jié)果表明，細(xì)胞相關(guān)細(xì)菌的存在與腫瘤細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞和間質(zhì)中的細(xì)胞運(yùn)動、胞外基質(zhì)相互作用和免疫信號傳導(dǎo)通路相關(guān)。為了驗(yàn)證結(jié)果，作者將scPDA1和scPDA2中的細(xì)菌相關(guān)基因與TCGA胰腺癌隊列中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌相關(guān)基因進(jìn)行了比較，結(jié)果具有高度一致性。
考慮到微生物組成的個體間差異和TCGA數(shù)據(jù)的基因組覆蓋范圍有限。以上這些單細(xì)胞分辨率的觀察結(jié)果一致地將微生物群與腫瘤微環(huán)境中單個細(xì)胞類型中關(guān)鍵的癌變相關(guān)的細(xì)胞過程聯(lián)系起來。
微生物存在的腫瘤具有激活的T細(xì)胞亞型
作者整合了來自scPDA1和scPDA2的T細(xì)胞數(shù)據(jù)，并基于典型亞型標(biāo)記識別了調(diào)節(jié)T細(xì)胞、記憶、效應(yīng)T細(xì)胞和自然殺傷T細(xì)胞。結(jié)果表明具有細(xì)胞相關(guān)細(xì)菌的腫瘤的T細(xì)胞更傾向于具有激活的表型（即自然殺傷T細(xì)胞、效應(yīng)T細(xì)胞）。微生物有/無存在的腫瘤T細(xì)胞具有差異表達(dá)基因，這些差異表達(dá)基因在scPDA1和scPDA2中具有相同的調(diào)控方向，并在PD-1通路以及FOXO介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄和干擾素信號傳導(dǎo)通路中富集。這些結(jié)果與最近的報道一致，即腫瘤內(nèi)細(xì)菌誘導(dǎo)免疫浸潤和抗腫瘤反應(yīng)。
PDA中T細(xì)胞具有與細(xì)菌感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄信號
該研究中，廣泛的細(xì)菌-免疫細(xì)胞共定位和與免疫相關(guān)信號的關(guān)聯(lián)表明，微生物組影響PDA免疫應(yīng)答。為了確定腫瘤微環(huán)境中單個T細(xì)胞的靶點(diǎn)，作者構(gòu)建了一個隨機(jī)森林模型來準(zhǔn)確區(qū)分PDA腫瘤微環(huán)境中單個T細(xì)胞到底受微生物刺激還是受腫瘤刺激。結(jié)果表明兩個PDA隊列中的絕大多數(shù)T細(xì)胞被歸類為具有細(xì)菌感染微環(huán)境模式。這一發(fā)現(xiàn)解釋了為什么胰腺腫瘤有高水平的炎癥，對免疫治療反應(yīng)較差。
微生物組特征與患者生存率相關(guān)
由于缺乏大樣本量的單細(xì)胞PDA隊列生存數(shù)據(jù)，作者開發(fā)了一個梯度增強(qiáng)樹模型，來分類腫瘤有/無細(xì)胞相關(guān)細(xì)菌的表達(dá)，然后使用這個模型來預(yù)測公共數(shù)據(jù)庫（TCGA、ICGC和CPTAC）中胰腺癌樣本的細(xì)菌感染狀態(tài)，并使用單變量Cox比例風(fēng)險模型來檢驗(yàn)其與生存率的關(guān)系。結(jié)果表明，腫瘤微生物特征與胰腺癌患者的預(yù)后具有顯著相關(guān)性。
小編總結(jié)
在該研究中，作者使用SAHMI在獨(dú)立的胰腺癌隊列中分析了單細(xì)胞分辨率下的腫瘤-微生物組相互作用。與宿主細(xì)胞相關(guān)的微生物與在單細(xì)胞分析中確定的大多數(shù)細(xì)胞類型配對，主要定位于腫瘤細(xì)胞。腫瘤微生物的存在與細(xì)胞類型特異性的癌癥相關(guān)過程有關(guān)，包括細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、補(bǔ)體級聯(lián)和PD-1信號傳導(dǎo)。大多數(shù)PDA 中T細(xì)胞具有與感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。同時作者也證實(shí)了腫瘤微生物特征與胰腺癌患者的預(yù)后具有顯著相關(guān)性。
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參考文獻(xiàn)
Bassel Ghaddar,Antara Biswas,Chris Harris, et al. Tumor microbiome links cellular programs and immunity in pancreatic cancer, Cancer Cell (2022). DOI: 10.1016/j.ccell.2022.09.009
