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今天給大家?guī)硪黄?a >NATURE REVIEWS CANCER的最新綜述“RNA splicing dysregulation and the hallmarks of cancer”。本文，作者回顧了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的剪接改變特征，剪接失調(diào)對腫瘤發(fā)生和發(fā)展的貢獻(xiàn)，以及現(xiàn)有的和新興的靶向剪接用于癌癥治療的方法。最后，討論了將這些發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床必須解決的問題和挑戰(zhàn)。
RNA剪接是大多數(shù)人類基因表達(dá)的基本步驟。剪接除了在產(chǎn)生成熟的mRNAs方面發(fā)揮重要作用外，還通過無義介導(dǎo)的衰變(NMD)影響基因表達(dá)的其他步驟。幾乎所有人類多外顯子(multi-exon)基因都經(jīng)歷了選擇性剪接。RNA剪接失調(diào)是幾乎所有腫瘤類型的分子特征。腫瘤相關(guān)剪接失調(diào)可通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、減少細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)遷移和轉(zhuǎn)移潛能、抵抗化療和免疫逃逸等。最近的研究已經(jīng)確定了在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化和生長中發(fā)揮關(guān)鍵作用的特定的癌癥相關(guān)異構(gòu)體，并證明了糾正或以其他方式拮抗這種癌癥相關(guān)的mRNA異構(gòu)體的治療益處。調(diào)節(jié)或抑制RNA剪接的臨床級小分子也同樣被開發(fā)為有前途的抗癌治療藥物。
在這篇綜述中，作者概述了RNA剪接的基本生物學(xué)和與癌癥的相關(guān)性。討論了與腫瘤啟動有關(guān)的剪接調(diào)控改變，以及與腫瘤啟動、進(jìn)展和耐藥性相關(guān)的個體剪接事件。描述了如何用小分子來治療剪接失調(diào)，以及需要解決的技術(shù)挑戰(zhàn)和懸而未決的問題。
RNA剪接是一個高度調(diào)控的過程，由剪接蛋白(一個由RNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物)以及調(diào)節(jié)其活性的額外剪接因子蛋白執(zhí)行。剪接體識別pre-mRNA中的核心規(guī)則序列，包括5’和3’剪接位點(diǎn)(5’ss和3’ss)，標(biāo)記內(nèi)含子-外顯子邊界，分支點(diǎn)位點(diǎn)(BPS)和多嘧啶序列。兩個剪接體復(fù)合體進(jìn)行剪接反應(yīng)，U2型(主要剪接體)或U12型(次要剪接體)。主要的U2型剪接體優(yōu)先識別GT-AG剪接位點(diǎn)，負(fù)責(zé)去除~99%的內(nèi)含子；次要或U12型剪接體識別AT-AC和GT-AG位點(diǎn)，移除不到1%的內(nèi)含子。幾個剪接體成分在人類腫瘤中發(fā)生改變，包括通過‘Early’或E complex和pre-spliceosome A complex的反復(fù)熱點(diǎn)突變（圖1a）。
剪接體識別的核心調(diào)控序列在人類中具有巨大的多樣性。這提供了一層額外的調(diào)控。順式作用序列和反式作用剪接因子共同調(diào)節(jié)選擇性剪接，使單個基因能夠編碼多種不同的RNA異構(gòu)體，這些異構(gòu)體可以翻譯成功能不同的蛋白質(zhì)異構(gòu)體(圖1b)。剪接異構(gòu)體可以在其編碼潛力、穩(wěn)定性、定位、翻譯效率和其他分子特征方面有所不同。據(jù)目前估計，每個人類蛋白質(zhì)編碼基因平均編碼7.4種RNA亞型。
調(diào)節(jié)可變剪接的反式作用剪接因子是一類RNA結(jié)合蛋白(RBPs)，它識別和結(jié)合pre-mRNA上的順式調(diào)節(jié)元件，即外顯子/內(nèi)含子剪接增強(qiáng)子(ESE/ISE)或外顯子/內(nèi)含子剪接沉默子(ESS/ISS)序列，并分別促進(jìn)或抑制該外顯子進(jìn)入成熟mRNA(圖1c)。富含絲氨酸/精氨酸(SR)的蛋白質(zhì)和異質(zhì)性核糖核蛋白(HnRNPs)是兩個眾所周知的剪接因子家族。HnRNPs在選擇性剪接、mRNA運(yùn)輸和翻譯中發(fā)揮著不同的作用，并且經(jīng)常作為SR蛋白調(diào)節(jié)的選擇性剪接事件的拮抗劑。
SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2基因重復(fù)性突變常見于血液系統(tǒng)惡性腫瘤，包括骨髓增生異常綜合征(MDS)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)等。這些突變通常被稱為“剪接體突變”。
SF3B1是癌癥中最常突變的剪接體成分，SF3B1突變影響羧基末端HEAT域(HD)內(nèi)的多個hot-spot殘基(圖2a，b)。這些突變導(dǎo)致BPS識別的改變，隨之而來的是廣泛的剪接改變。SF3B1突變的預(yù)后意義取決于特定的突變和適應(yīng)癥，例如MDS中，SF3B1K700E與相對較好的預(yù)后相關(guān)，而SF3B1K666N與疾病進(jìn)展相關(guān)。CLL中，SF3B1G742D與預(yù)后不良相關(guān)。雖然突變的SF3B1如何促進(jìn)疾病表型和腫瘤的發(fā)生仍在積極的研究中，但已經(jīng)涉及到許多細(xì)胞途徑。
在所有MDS和相關(guān)疾病的患者中，有10%的患者觀察到了SRSF2的反復(fù)突變，并MDS的預(yù)后不良有關(guān)。SRSF2是結(jié)構(gòu)性剪接和選擇性剪接所必需的。緊鄰SRSF2’s RRM結(jié)構(gòu)域的雜合突變，主要為錯義突變，普遍影響P95殘基(圖2b)，改變其RNA結(jié)合偏好。突變體SRSF2有利于識別富含C的序列(CCNG基序)，并降低了對GGNG基序的親和力，而野生型SRSF2同時識別兩者。這改變了SRSF2介導(dǎo)的外顯子包涵體的效率，并導(dǎo)致錯誤剪接。
U2AF1在5-15%的MDS、5-17%的慢性粒單核細(xì)胞白血?。–MML）和3%的肺腺癌中發(fā)生突變(圖2a)。U2AF1的兩個鋅指結(jié)構(gòu)域中的S34和R156/Q157受到反復(fù)突變的影響(圖2b)。這兩個熱點(diǎn)的突變導(dǎo)致RNA結(jié)合親和力和3‘SS識別的不同變化，從而導(dǎo)致截然不同的剪接模式。
ZRSR2基因是一種X連鎖基因，在沒有環(huán)狀鐵粒幼紅細(xì)胞的MDS中有1-11%的突變，CMML中有0.8-8%的突變，其他血液病中突變的比例較低(圖2a)，大多數(shù)突變發(fā)生在男性患者中。與上述hot-spot改變相反，ZRSR2突變分布在基因上(圖2b)，優(yōu)先破壞開放閱讀框或關(guān)鍵功能殘基，導(dǎo)致功能喪失，并可與SF3B1、SRSF2或U2AF1突變共存。
Sf3b1K700E/+基因敲除小鼠表現(xiàn)為大細(xì)胞性貧血、紅系發(fā)育異常和長期的造血干細(xì)胞擴(kuò)增；Srsf2P95H/+基因敲除小鼠表現(xiàn)為造血功能受損、髓系和紅系發(fā)育不良、造血干細(xì)胞擴(kuò)增；表達(dá)U2af1S34F的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為造血功能的改變，而U2af1S34F/+敲除小鼠表現(xiàn)為多系細(xì)胞減少、大細(xì)胞性貧血和低度發(fā)育不良；Zrsf2基因敲除小鼠表現(xiàn)為輕度不典型增生造血干細(xì)胞自我更新增加。U12型內(nèi)含子相對于U2型內(nèi)含子的高度保守可能解釋了為什么Zrsr2缺失在小鼠模型中導(dǎo)致競爭優(yōu)勢，由于其在人類疾病中的富集，而其他剪接體突變的小鼠模型則沒有。
遺傳證據(jù)同樣表明，剪接體突變通常是髓系惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制的始動事件。對帶有SF3B1突變的MDS的克隆性研究表明，這些病變正發(fā)生在人類造血干細(xì)胞中并在其髓系后代中持續(xù)存在。最近的一項(xiàng)縱向研究表明，在人類造血系統(tǒng)和克隆造血老化過程中，由不同的體細(xì)胞突變驅(qū)動的克隆擴(kuò)張存在差異。剪切體突變在生命后期驅(qū)動擴(kuò)張，并與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，而具有表觀遺傳調(diào)控突變的克隆在生命早期優(yōu)先擴(kuò)張，并隨著年齡增長表現(xiàn)出較慢的生長。剪接體突變經(jīng)常以等位基因比率表達(dá)，這表明在許多實(shí)體腫瘤中存在顯性克隆，這表明它們可能也是這些惡性腫瘤的早期事件，甚至是起始事件。
編碼其他剪接體成分的基因在血液病和實(shí)體惡性腫瘤中也會發(fā)生突變(圖2)。SF3A1、PRPF8、SF1、HNRNPK、U2AF2、SRSF6、SRSF1、SRSF7、TRA2B和SRRM2突變也已被報道，盡管突變的發(fā)生率相對較低。這種低頻剪接因子突變在癌癥中的功能作用尚不清楚，它們可能是潛在的重要角色。
剪接因子水平和活性通過與NMD結(jié)合的選擇性剪接，在翻譯和翻譯后，包括通過特定激酶的磷酸化，在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后受到嚴(yán)格控制。這些調(diào)控通路中的任何一個的改變都可以導(dǎo)致剪接因子表達(dá)的改變，從而改變剪接因子下游靶標(biāo)的選擇性剪接。盡管反復(fù)發(fā)生的剪接因子突變在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中很常見，但剪接因子水平的改變和拷貝數(shù)的變化在實(shí)體腫瘤中尤為突出(圖2a)。剪接因子調(diào)控失調(diào)與多種癌癥之間的因果聯(lián)系已被確定。在乳腺癌中上調(diào)的幾種剪接因子具有致癌功能。當(dāng)然，剪接因子也可以作為腫瘤抑制因子。
促腫瘤剪接因子的一個典型例子是SR蛋白SRSF1，在乳腺、肺、結(jié)腸和膀胱腫瘤中的上調(diào)。SRSF1的過表達(dá)增強(qiáng)了與減少細(xì)胞死亡、增加細(xì)胞增殖以及抵抗DNA損傷相關(guān)的異構(gòu)體的選擇性剪接，導(dǎo)致體內(nèi)和體外的細(xì)胞轉(zhuǎn)化。SRSF1可以與轉(zhuǎn)錄因子MYC協(xié)同作用，通常導(dǎo)致乳腺癌和肺癌患者病情加重。
另一個SR蛋白家族成員SRSF3在肺、乳腺、卵巢、胃、膀胱、結(jié)腸、骨、肝、腦和口腔腫瘤中過表達(dá)，而在肝細(xì)胞癌中觀察到SRSF3的表達(dá)降低，這表明在腫瘤的發(fā)生中起著復(fù)雜的作用。SRSF3靶基因在細(xì)胞代謝、生長、細(xì)胞骨架組織和選擇性剪接中發(fā)揮作用。
在癌癥中經(jīng)常上調(diào)的其他剪接因子包括SR蛋白家族的其他成員，hnRNP蛋白家族的成員以及其他剪接因子，例如ESPR1、ESPR2、RBM5、RBM6和RBM10(圖2a)。相反，幾個剪接因子在人類腫瘤中下調(diào)，包括hnRNPK、ESRP1、ESRP2、RBFOX2、RBM5或QKI(圖2a)。其中QKI在多種腫瘤中檢測到水平降低，并與不良預(yù)后有關(guān)。除了上面討論的SRSF3，其他剪接因子也可以根據(jù)腫瘤類型而上調(diào)或下調(diào)，這表明上下文相關(guān)的功能既可能促癌也可能抑制癌癥，在調(diào)節(jié)組織特異性剪接中扮演著復(fù)雜的角色。更復(fù)雜的是，在口腔腫瘤中，正常上皮中低水平表達(dá)的ESRP1在癌前病變、原位癌和晚期病變中上調(diào)，但在浸潤性腫瘤前沿下調(diào)。另一個具有雙重功能的剪接因子是RBM5，它通常被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子，在肺癌和前列腺癌中下調(diào)，但在原發(fā)性乳腺癌中上調(diào)。
腫瘤通常比正常組織表現(xiàn)出更復(fù)雜的剪接過程，腫瘤的致瘤性可能與轉(zhuǎn)化過程中出現(xiàn)的癌癥特異性選擇性剪接有關(guān)。在某些情況下，順式作用突變可以破壞剪接以促進(jìn)腫瘤發(fā)生。而其他順式作用突變同樣可以通過誘導(dǎo)特定內(nèi)含子的保留來擾亂基因的表達(dá)。
癌癥特異的選擇性剪接經(jīng)常獨(dú)立于這種順式作用突變或影響剪接因子的反復(fù)突變的存在而出現(xiàn)。這種選擇性剪接開關(guān)影響數(shù)千個基因，通常是特定腫瘤類型或亞型所特有的。盡管如此，許多選擇性剪接異構(gòu)體經(jīng)常在多種腫瘤類型中不受調(diào)控，這表明跨組織類型共享剪接調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
這些失調(diào)的異構(gòu)體經(jīng)常影響所謂的癌癥特征，即在人類腫瘤發(fā)展過程中獲得的一系列生物學(xué)能力。癌癥相關(guān)的選擇性剪接異構(gòu)體可以提供增殖優(yōu)勢，改善細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞能夠逃脫死亡，重新連接細(xì)胞代謝或細(xì)胞信號，促進(jìn)微環(huán)境，改變免疫反應(yīng)或使耐藥(圖3)。這種與癌癥相關(guān)的選擇性剪接開關(guān)可以由剪接因子水平或活性的變化、影響特定剪接位點(diǎn)或外顯子的順式作用突變或其他方式引起。模型系統(tǒng)中的功能研究表明，單一異構(gòu)體的改變可以影響腫瘤的生長，但通常不足以完全概括剪接因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，這表明可能需要多種選擇性剪接異構(gòu)體開關(guān)的組合來促進(jìn)腫瘤發(fā)生的不同步驟。
腫瘤中的差異剪接可以導(dǎo)致異構(gòu)體的表達(dá)，從而增加增殖潛力(圖3)。例如，RPS6KB1基因的剪接與細(xì)胞的持續(xù)增殖和腫瘤的生長有關(guān)。RPS6KB1-2在乳腺癌、肺癌細(xì)胞系和原發(fā)腫瘤中高表達(dá)，敲除該基因可抑制癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長，反之，RPS6KB1-1基因敲除可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化。
PKM基因的剪接可以下調(diào)細(xì)胞代謝(圖3)。PKM1或與癌癥相關(guān)的PKM2亞型相差22個氨基酸，雖然兩者執(zhí)行相同的催化功能，但PKM2可以在活性和非活性狀態(tài)之間切換。人實(shí)體瘤中PKM2水平高與患者生存期短、分期晚、預(yù)后差有關(guān)。
為了生存，癌細(xì)胞需要獲得抵抗細(xì)胞死亡的能力。多個控制細(xì)胞死亡的基因在剪接水平上受到調(diào)控，產(chǎn)生不同的異構(gòu)體，這些異構(gòu)體要么具有抗凋亡功能，要么具有促凋亡功能，包括bcl2家族成員，如BCL2L1、BIM或MCL1(圖3)。BCL2L1產(chǎn)生BCLxL和BCLxS兩種亞型，分別抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
基因組不穩(wěn)定性是腫瘤的標(biāo)志之一，而感知單鏈DNA斷裂并激活DNA損傷反應(yīng)的蛋白質(zhì)之一是絲氨酸/蘇氨酸檢查點(diǎn)激酶CHK1(圖3)。跳過CHK1產(chǎn)生較短的異構(gòu)體CHK1-S抑制全長CHK1。卵巢癌、睪丸癌和肝癌組織中檢測到高水平的CHK1-S。
幾乎所有的癌細(xì)胞都通過上調(diào)端粒酶來重新延長或維持端粒。端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶組分TERT的剪接可以產(chǎn)生至少22種不同的亞型，它們的活性不同；其中許多缺乏端粒酶活性，并具有顯性的負(fù)面影響(圖3)。
一個腫瘤抑制因子逃避例子是轉(zhuǎn)錄因子KLF6，它調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和生存，可抑制腫瘤，通常通過突變或缺失在腫瘤中失活(圖3)。KLF6的選擇性剪接可以產(chǎn)生致癌亞型KLF6-SV1。KLF6剪接受SRSF1、TGFβ1和RAS信號調(diào)節(jié)。在前列腺、肺、卵巢、腦、乳腺、胰腺和肝臟腫瘤中檢測到KLF6-SV1水平升高，并與較差的存活率相關(guān)。KLF6-SV1基因敲除可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并阻止腫瘤生長，而其過表達(dá)則在體內(nèi)外促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活或侵襲。
許多選擇性剪接異構(gòu)體與增加細(xì)胞侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散有關(guān)(圖3)。幾個編碼調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附和遷移的蛋白質(zhì)的基因在細(xì)胞侵襲或EMT過程中表達(dá)不同的剪接異構(gòu)體。其中包括CD44、RAC1、RON或MENA的選擇性剪接，這些剪接產(chǎn)生使細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的亞型。例如，MENA是一種肌動蛋白成核和聚合的調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動，它產(chǎn)生三種主要的異構(gòu)體，在腫瘤進(jìn)展中扮演不同的角色。包含在乳腺和肺腫瘤中表達(dá)的MENA-INV，MENA11a以及MENA?v6亞型。這些剪接事件受許多剪接因子的調(diào)控，包括ESPR1和ESPR2。異構(gòu)體比例在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)生改變，與腫瘤分級和轉(zhuǎn)移相關(guān)的MENA-INV和MENA?V6增加，MENA11a減少。
剪接開關(guān)還可以影響血管生成，促進(jìn)腫瘤生長和向遠(yuǎn)處器官擴(kuò)散(圖3)。VEGFA是一種促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的生長因子，它的選擇性剪接導(dǎo)致在血管生成中具有不同功能的蛋白質(zhì)異構(gòu)體。包含促血管生成的VEGFAxxx亞型，以及抗血管生成的VEGFAxxb亞型。這兩種異構(gòu)體在體外與其受體具有相似的結(jié)合親和力；然而，VEGFAxxb不能刺激血管內(nèi)皮生長因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制血管生成。SRSF6促進(jìn)VEGFAxxb的剪接，而SRSF1和SRSF5使平衡向VEGFAxxx亞型轉(zhuǎn)移?？寡苌苫騐EGFAxxb的表達(dá)通常隨著腫瘤的進(jìn)展而減少，其過表達(dá)可抑制小鼠腫瘤的生長。
通過對間質(zhì)和免疫成分的影響，選擇性剪接與腫瘤微環(huán)境的變化有關(guān)(圖3)。幾種細(xì)胞外基質(zhì)成分在腫瘤進(jìn)展過程中經(jīng)歷了選擇性剪接。包含纖維連接蛋白ED-A會產(chǎn)生在胚胎發(fā)育和惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的亞型。類似地，腫瘤特異性的TnC(TNC)或骨橋蛋白(SPP1)亞型與疾病進(jìn)展有關(guān)。此外，細(xì)胞外基質(zhì)硬度和組成的變化可以導(dǎo)致差異剪接，例如，通過差異磷酸化和剪接因子激活。
最后，選擇性剪接也影響免疫細(xì)胞發(fā)育和功能的多個調(diào)控步驟(圖3)。例如，CD45的選擇性剪接是T細(xì)胞激活過程中的關(guān)鍵步驟，而CD44選擇性剪接參與了淋巴細(xì)胞的激活。選擇性剪接調(diào)控多個介導(dǎo)Toll樣受體信號的基因，并控制TLR信號正調(diào)控因子的產(chǎn)生，包括IRAK1、CD14和IKKβ，以及負(fù)調(diào)節(jié)因子TLR4和RAB7B的產(chǎn)生。同樣，白介素受體的可溶性異構(gòu)體，如IL-4R、IL-5R和IL-6R，是通過免疫細(xì)胞中的選擇性剪接產(chǎn)生的。
選擇性剪接的改變可能通過影響靶向或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而導(dǎo)致靶向治療耐藥(圖4)。BRCA1Δ11q異構(gòu)體促進(jìn)對順鉑的抵抗。對PARP抑制具有抗性的BRCA1野生型結(jié)腸癌細(xì)胞表達(dá)BARD1β。BARD1β的表達(dá)與同源重組受損相關(guān)，其外源性表達(dá)增加了對PARP抑制劑的耐藥性。同樣，由SRSF1調(diào)控的BH3-only促凋亡蛋白BIM的剪接與酪氨酸激酶抑制劑的反應(yīng)和耐藥性有關(guān)。最后，HER2的選擇性剪接產(chǎn)生的Δ16HER2降低了對HER2靶向抗體曲妥珠單抗的敏感性。
針對CD19的免疫療法是治療B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的一個突破。然而，由于免疫排斥和T細(xì)胞衰竭或靶向表位的丟失，50%的患者會復(fù)發(fā)。CD19的選擇性剪接可能導(dǎo)致表位丟失，產(chǎn)生不被CAR T細(xì)胞識別的剪接異構(gòu)體，導(dǎo)致耐藥(圖4)。
鑒于剪接在腫瘤發(fā)生中的關(guān)鍵作用，人們對靶向可變剪接用于癌癥治療產(chǎn)生了濃厚的興趣。從抑制關(guān)鍵剪接體蛋白或調(diào)節(jié)剪接因子到調(diào)節(jié)特定的選擇性剪接事件，正在進(jìn)行臨床前和臨床開發(fā)。下面討論這些方法，從broad-spectrum剪接到特定的異構(gòu)體水平方法，最后討論已顯示出臨床前潛力的新方法(圖5)。
以核心剪接體為目標(biāo)。靶向剪接用于癌癥治療的一種方法是抑制剪接體本身。SF3B1是一種剪接體成分，對BPS和3‘SS選擇至關(guān)重要(圖1)，限制其功能會在剪接體組裝的早期階段擾亂剪接。已確定或開發(fā)了多種以SF3B1為靶點(diǎn)的天然產(chǎn)物和衍生分子，包括FR901464及其衍生物，sudemycin E，Pladienolide B，F(xiàn)D-895及其衍生物，以及Herboxdiene(圖5)。在機(jī)制上，抑制SF3B1阻止了BPS的識別，并導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性剪接和選擇性剪接的廣泛干擾，包括與細(xì)胞增殖和死亡有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。有趣的是，只有一部分內(nèi)含子和選擇性剪接事件受到SF3B1抑制的影響，這表明一些剪接位點(diǎn)比其他剪接位點(diǎn)對剪接體抑制物更敏感。與野生型細(xì)胞相比，攜帶剪接體基因反復(fù)突變的癌細(xì)胞對SF3B1抑制劑特別敏感；然而，還沒有開發(fā)出僅針對突變的SF3B1的化合物。幾種SF3B1抑制劑已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。鑒于SF3B復(fù)合體在正常剪接中的關(guān)鍵作用，目前尚不清楚在臨床環(huán)境中是否有足夠的治療指數(shù)來抑制野生型SF3B1的功能。另一種broad-spectrum剪接體抑制劑是異銀杏黃酮，它導(dǎo)致剪接體前A complex的停滯。在臨床前模型中，異銀杏黃酮治療影響許多與癌癥相關(guān)的途徑，包括細(xì)胞死亡、侵襲和免疫反應(yīng)。
以可變剪接因子為目標(biāo)。針對特定RBPs和剪接因子的抑制劑的開發(fā)一直具有挑戰(zhàn)性，部分原因是缺乏大多數(shù)經(jīng)典小分子抑制劑方法容易靶向的催化活性位點(diǎn)。偶然發(fā)現(xiàn)幾個芳基磺胺類化合物通過先前未知的作用機(jī)制具有抗癌活性，它們作為分子膠通過募集到CUL4-DCAF15泛素連接酶復(fù)合體而導(dǎo)致RBP RBM39的降解(圖5)。鑒于特定剪接因子的高表達(dá)和低表達(dá)是常見的，并可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，開發(fā)糾正剪接因子表達(dá)的方法可能具有治療價值。目前還沒有這種針對單個剪接因子的通用方法。
以上游調(diào)控蛋白為目標(biāo)。剪接因子受到廣泛的翻譯后修飾，這為治療干預(yù)提供了機(jī)會。例如，剪接體蛋白和剪接因子受到廣泛的精氨酸甲基化的影響。PRMT5本身是MYC癌基因的直接靶點(diǎn)，在MYC驅(qū)動的腫瘤和選擇性剪接之間提供了聯(lián)系。已經(jīng)確定了許多抑制I型或II型PRMTs的小分子(圖6)。I型和II型PRMT抑制劑都顯示出良好的臨床前活性。
許多剪接因子，特別是SR蛋白，是高度磷酸化的。這些磷酸化事件改變了剪接因子的活性和定位，并最終是其剪接活性所必需的。因此，抑制調(diào)節(jié)這些磷酸化事件的激酶可能是降低致癌SR蛋白活性的可行策略(圖6)。另一種化合物TG003通過抑制CDC樣激酶1(CLK1)影響SR蛋白的磷酸化，并在前列腺癌和胃癌模型中顯示出抗癌作用。
總之，多種誘導(dǎo)Broad-spectrum剪接調(diào)節(jié)的方法顯示出臨床前的前景，目前正在臨床上進(jìn)行測試。然而，由于所有現(xiàn)有的方法都影響健康和惡性細(xì)胞的剪接，仔細(xì)評估潛在的毒性和治療指數(shù)是至關(guān)重要的。鑒于目前的限制，選擇性靶向或以其他方式拮抗突變剪接體蛋白的新構(gòu)象活性的化合物的未來發(fā)展有可能產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的治療益處和有利的副作用。
以個別亞型為靶標(biāo)的小分子。由于許多疾病相關(guān)的剪接因子目前還不能用小分子藥物治療，靶向下游錯誤剪接RNA可能提供一種有前景的治療方法。然而，到目前為止，只有少數(shù)通過靶向特定RNA轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮作用的化合物顯示出臨床用途。Risplam是FDA批準(zhǔn)的第一個用于治療脊髓性肌萎縮癥的小分子藥物，它通過靶向RNA轉(zhuǎn)錄本發(fā)揮作用。在過去的5年里，識別以特定癌癥相關(guān)RNA為靶點(diǎn)的小分子的研究有所增加。以RNA為靶標(biāo)的小分子配體可以通過考慮每個小分子的首選結(jié)合位置或RNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行合理設(shè)計。小分子可以通過空間位阻誘導(dǎo)RNA的靶向降解、直接切割或剪接調(diào)節(jié)。然而，這種方法在遺傳病方面的發(fā)展比在腫瘤學(xué)方面要先進(jìn)得多。
用寡核苷酸進(jìn)行剪接調(diào)控。基于RNA的療法提供了改變pre-mRNA剪接的可能性。剪接開關(guān)ASOs是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的短RNA寡核苷酸，旨在與靶pre-mRNA中的反向互補(bǔ)序列結(jié)合，從而防止其與剪接機(jī)制的相互作用(圖6)。剪接開關(guān)ASOs可以被設(shè)計成專門針對5‘SS或3’SS，從而阻止其使用；剪接增強(qiáng)子序列；剪接沉默序列；或由于突變而出現(xiàn)的神秘剪接位點(diǎn)，從而恢復(fù)野生型剪接位點(diǎn)。對磷酸骨架、核糖環(huán)的化學(xué)修飾產(chǎn)生了高度穩(wěn)定的ASO，具有高底物專一性、低毒性、低免疫原性和降低核糖核酸酶H的降解率。將ASO輸送到靶組織對其廣泛的治療用途仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，除了向肝臟輸送外，GalNAc偶聯(lián)對其非常有效。目前FDA批準(zhǔn)的剪接開關(guān)ASO可以直接或系統(tǒng)地傳遞到它們的目標(biāo)位置，但傳遞到一些組織，包括腫瘤，仍然具有挑戰(zhàn)性。
盡管在體內(nèi)傳遞存在挑戰(zhàn)，但針對癌癥的ASO已經(jīng)增加。在許多情況下，ASO糾正與癌癥相關(guān)的選擇性剪接事件導(dǎo)致了在細(xì)胞系和動物模型中有希望的抗癌表型(圖5)。例如，編碼BCL-x(BCL2L1)的基因可以被選擇性地剪接，以產(chǎn)生促凋亡的亞型BCLxS或抗凋亡的亞型BCLxL。
針對RNA可變剪接的新策略。已經(jīng)有針對剪接因子或特定選擇性剪接事件的新方法。一個例子是誘騙寡核苷酸，它可以誘導(dǎo)類似于靶剪接因子被敲除的轉(zhuǎn)錄改變，而SRSF1誘騙可以限制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。另一種方法是使用經(jīng)過改造的U7SnRNA來糾正特定的選擇性剪接事件，可以有效地發(fā)揮反義分子的作用。這些結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定表達(dá)可能會克服傳統(tǒng)反義治療的局限性，因?yàn)樗鼈儾恍枰啻谓o藥。到目前為止，這種方法已經(jīng)用于強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良癥、杜氏肌營養(yǎng)不良癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、β地中海貧血、艾滋病毒感染和脊髓性肌萎縮的模型。
在CRISPR時代，RNA靶向Cas13(CasRx)已被用于堿基編輯靶RNA或改變Pre-mRNA的剪接。在Cas13 RNA靶向能力的基礎(chǔ)上，開發(fā)了CRISPR人工剪接因子，利用guide RNAs (gRNAs)靶向，將單個剪接因子的剪接活性定向到目標(biāo)pre-RNA(圖6)。通過基于CRISPR的方法進(jìn)行基因編輯，可以針對特定的選擇性剪接事件。通過設(shè)計特定的突變，人們可以加強(qiáng)或取消感興趣目標(biāo)中的特定剪接位點(diǎn)序列，從而促進(jìn)外顯子的包含或跳過。
變異的、癌癥相關(guān)的RNA亞型翻譯的多肽是免疫治療的有潛力的靶點(diǎn)。這些癌癥特異的新抗原可能源于影響剪接的突變以及異常剪接連接、內(nèi)含子保留和其他癌癥特異性替代剪接的非突變使用。例如，在B細(xì)胞淋巴瘤中，CD20的選擇性剪接可以產(chǎn)生T輔助細(xì)胞反應(yīng)，這種反應(yīng)可以選擇性地殺死惡性B細(xì)胞克隆，而用CD20剪接異構(gòu)體的相應(yīng)肽免疫人源化小鼠可以產(chǎn)生強(qiáng)大的T細(xì)胞反應(yīng)。
在這種情況下，腫瘤突變負(fù)擔(dān)是一種新的抗原性潛力的常見指數(shù)，并不總是與個體患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)相關(guān)。選擇性剪接衍生新抗原的發(fā)現(xiàn)可能是對基因組分析的補(bǔ)充，以確定哪些患者將對免疫檢查點(diǎn)治療產(chǎn)生反應(yīng)，此外，還代表了免疫治療潛在靶點(diǎn)的豐富來源，特別是如果可以識別許多患者共享的腫瘤特異性靶點(diǎn)。
另一種方法是剪接調(diào)節(jié)藥物和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的協(xié)同治療。RBM39降解或PRMT抑制對同基因小鼠腫瘤模型中選擇性剪接的治療調(diào)節(jié)作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞錯誤剪接衍生的新抗原遞呈，刺激強(qiáng)大的抗腫瘤免疫反應(yīng)并增強(qiáng)對檢查點(diǎn)抑制的反應(yīng)。在這種臨床前環(huán)境中，沒有觀察到健康組織的毒性或免疫滲透增加的證據(jù)，但在臨床移植之前，有必要進(jìn)一步工作以確定安全性。
到目前為止，大多數(shù)研究都依賴于short-read RNA-seq來表征人類腫瘤中的選擇性剪接譜系(圖7)。這些方法揭示了癌癥轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性，以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中選擇性剪接開關(guān)的規(guī)模。然而，short-read RNA-seq不能可靠地檢測所有異構(gòu)體。LR-seq方法將提供對腫瘤和正常組織選擇性剪接構(gòu)成的更全面的看法。獲得準(zhǔn)確的全長剪接異構(gòu)體序列對于識別私有或共享的新抗原以及針對剪接衍生多肽的免疫療法的發(fā)展至關(guān)重要。單細(xì)胞LR-seq將是一個非常有效的策略來確定選擇性剪接如何有助于腫瘤的進(jìn)化和藥物反應(yīng)，并識別與耐藥相關(guān)的腫瘤群體。最后，單細(xì)胞LR-seq與空間轉(zhuǎn)錄學(xué)相結(jié)合，揭示了選擇性剪接如何促進(jìn)組織發(fā)育和疾病。這種方法對研究腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有潛在的實(shí)用價值，而腫瘤的發(fā)生和發(fā)展已經(jīng)與選擇性剪接的改變有關(guān)。
許多工作已經(jīng)確定了數(shù)千種與癌癥相關(guān)的選擇性剪接異構(gòu)體。然而，缺乏高通量的方法來大規(guī)模查詢剪接異構(gòu)體的功能，阻礙了臨床上相關(guān)和可操作的替代剪接改變的發(fā)現(xiàn)。最近，基于CRISPR的方法已經(jīng)證明，可以使用成對的gRNA篩選它們對腫瘤細(xì)胞生長的影響。然而，這些方法以DNA序列為目標(biāo)，因此也可能潛在地影響基因組和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄和其他調(diào)節(jié)元件。雖然還需要進(jìn)一步發(fā)展，但在這方面，以RNA為目標(biāo)的CRISPR方法可能特別有用。最后，需要更好的模型系統(tǒng)來測試惡性腫瘤中選擇性剪接改變的功能后果，并對剪接靶向治療進(jìn)行臨床前評估。其中包括概括腫瘤復(fù)雜性的體外模型(例如，有機(jī)物和共培養(yǎng)模型)。帶有突變剪接因子的同基因小鼠癌癥模型也可以提供新的機(jī)制見解，并用于測試剪接調(diào)節(jié)藥物的療效。人源化的小鼠模型將進(jìn)一步測試針對人類免疫細(xì)胞的治療效果。
在過去的十年中，已經(jīng)揭示了癌癥中選擇性剪接異構(gòu)體和剪接因子的變化程度，但仍然缺乏對這些變化的功能后果的全面了解。腫瘤特異性亞型的相對作用在很大程度上仍不清楚。
此外，腫瘤中大多數(shù)剪接異常的機(jī)制起源尚不清楚。很大一部分實(shí)體腫瘤在選擇性剪接或剪接因子水平上顯示出顯著的變化，但不存在直接影響任何剪接因子的基因組改變。因此，了解剪接因子在健康組織和腫瘤中的表達(dá)調(diào)控將有助于針對剪接的治療方法的繼續(xù)發(fā)展。選擇性剪接與其他分子過程密切相關(guān)，包括表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控機(jī)制。這些機(jī)制中任何一種由癌癥驅(qū)動的變化反過來都可以影響剪接結(jié)果，反之亦然。最后，許多非遺傳因素影響癌癥的易感性。這包括年齡以及環(huán)境和生活方式的差異，如飲食或吸煙。
總而言之，過去十年的研究表明，選擇性剪接失調(diào)不僅是癌癥的偶爾相關(guān)因素，而且是一種幾乎無處不在的基本分子特征，經(jīng)常在腫瘤發(fā)生中起到致病甚至啟動作用。持續(xù)的研究會揭示普遍的癌癥特異性剪接失調(diào)的機(jī)制起源和功能后果的新見解，并能夠創(chuàng)造出通過調(diào)節(jié)RNA剪接發(fā)揮作用的新癌癥療法。
