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大家好呀！今天給大家介紹一篇2022年2月發(fā)表在Cancer Cell（IF:31.743）上的文章。一般的癌癥治療是以癌細胞為靶點并沒有考慮腫瘤微環(huán)境，這可能對治療效果有所影響。本研究作者發(fā)現(xiàn)直腸癌患者的炎癥相關纖維細胞（iCAFs）與放療和化療不良反應有關。并對小鼠模型進行實驗，結果表明IL-1α對誘導成纖維細胞轉化為炎癥表型并引起DNA損傷從而導致放療和化療抵抗和疾病進展，此外IL-1受體拮抗劑的血清水平較低與預后不良有關?？偟膩碚f，iCAF在直腸癌治療抵抗中具有重要作用。下面，我們來看看這篇文章的具體內容吧~
結果：
1.炎癥成纖維細胞預測直腸癌患者生存情況
首先，作者對212例接受放療（CRT）治療和手術治療的直腸癌患者進行一致性分子亞型（CMS）分類。然而，不同CMS亞群患者的DFS并沒有顯著差異（圖1A）。其次，為鑒定與預測治療反應有關的標記物和信號通路，作者對CMS2亞群患者的腫瘤細胞進行蛋白質組分析共鑒定到2747種蛋白質，但PCA和聚類分析并沒有將pCR和非pCR患者進行分開（圖1B）。結果表明，可能是腫瘤微環(huán)境中的細胞決定患者對CRT的反應。此外，對接受治療前的活檢樣本進行多重熒光免疫組化分析，其中間充質細胞顯著富集，而T細胞，巨噬細胞，中性粒細胞和上皮細胞沒有顯著差異（圖1C和1D）。轉錄組分析表明在非完全緩解（non-pCR）患者中CAF特征，上皮-間充質轉化（EMT）和炎癥特征顯著富集（圖1E）。結果表明，成纖維細胞與患者治療反應受損有關。最后，對核心蛋白聚糖（DCN）的免疫組化分析表明，DCN是細胞外基質的組成部分，DCN高表達患者的DFS較差（圖1F和1G）。
2.小鼠原位直腸癌模型
為了驗證炎癥型CAFs對直腸癌治療的影響，作者構建小鼠直腸癌模型（圖2A）。APTK類器官移植并表達APTKA，其腫瘤特征是明顯的間質反應具有較強的侵襲性（圖2B）。APTK和APTKA的腫瘤沒有聚到一起（圖2C）。APTKA腫瘤顯示CAF相關基因顯著富集（圖2D）。為了進一步研究這些腫瘤中的CAFs，使用流式細胞儀對細胞進行篩選并進行單細胞RNA測序。這些細胞共聚為5類，其中炎癥型依賴IL-1簇0最為顯著（圖2E）。該簇的DEG包括DCN（圖2F），免疫組化分析表明DCN水平較高（圖2G）。對APTK和APTKA的腫瘤進行放療，其中APTK對放療反應良好（圖2H），腫瘤體積減少（圖2I和2J）。而APTKA放療后，APTKA對放療耐藥（圖2K），侵襲性更強且肝轉移率更高（圖2L-2N），并且DCN+成纖維細胞數(shù)量增加，成纖維細胞形態(tài)改變和膠原蛋白含量增加（圖2O）。此外，對體外APTK和APTKA組織進行放療，結果與之類似（圖2P-2R）。
3.耐藥腫瘤以IL-1α依賴的方式誘導炎癥型CAF極化
為研究APTK和APTKA腫瘤是否會以旁分泌的方式影響腫瘤周圍的成纖維細胞，作者收集兩個腫瘤的上清液并用兩種野生型小鼠腸道成纖維細胞培養(yǎng)24h（圖3A）。轉錄組分析表明兩個組織上清液的成纖維細胞的基因表達模式不同（圖3B）。GSEA分析表明，APTKA的成纖維細胞具有較強的炎癥極化（圖3C）,簇0顯著富集（圖3D）。APTKA成纖維細胞中iCAF顯著富集（圖3E）。此外，用APTKA處理野生型成纖維細胞，會顯著抑制促炎基因（圖3F）。作者的目標是鑒定APTKA分泌的上游因子，其負責激活成纖維細胞的NF-B和p38。因此，作者對APTK和APTKA進行轉錄組測序分析，其中編碼細胞因子的基因差異表達（圖3G）。
4.IL-1與原位腫瘤的治療耐藥有關
為驗證IL-1α阻斷是否會改善體內APTKA對放療的反應，作者采用阿納金拉處理小鼠10天（圖4A），放療后，小鼠的腫瘤大小和侵襲性會顯著降低（圖4B-4D）。DCN+細胞減少，CD8+ T細胞增多，巨噬細胞和中性粒細胞浸潤水平降低（圖4E）。IL-1R缺失的成纖維細胞中可以模擬阿納金拉處理的接受放療小鼠的效果（圖4F-4I）。此外，作者使用CRISPRa/Cas9激活放療的APTK組織中的IL-1α轉錄（圖4J和4K）。IL-1α的增加會使腫瘤對放療產(chǎn)生抵抗力（圖4M）。而APTK-sall1a腫瘤大小沒有變化但侵襲性和轉移性更強（圖4M-4O）。放療后IL-1α依賴性的巨噬細胞和中性粒細胞浸潤水平?jīng)]有增加（圖4P）。
5.IL-1信號轉導導致亞硝酸鹽介導的DNA損傷，進而引起炎癥型CAFs治療性衰老
為了研究APTK和APTKA極化成纖維細胞時是否會受到放療的影響，作者使用APTK和APTKA條件培養(yǎng)基處理原代成纖維細胞并進行放療（圖5A）。不同處理的成纖維細胞形態(tài)具有顯著差異，APTKA極化的成纖維細胞形態(tài)是細長的紡錘形，APTKA和ILr1處理后的細胞接受放療后其形態(tài)有所變化（圖5B）。隨后，作者收集放療前后的APTKA極化成纖維細胞的上清液使用質譜分析ECM組分，其中ECM糖蛋白，膠原和蛋白多糖等顯著增加（圖5C）。對接受放療前后的成纖維細胞的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，結果表明參與細胞周期和細胞周期檢查點的基因顯著下調（圖5D）。免疫印跡分析表明p21，CDK4，細胞周期蛋白D2水平升高而CDC2/CDK1和細胞周期蛋白A水平降低（圖5E）。免疫熒光表明p21積累，Sa-β-gal染色表明放療后成纖維細胞衰老并伴隨DNA損傷（圖5F）。在APTK，APTKA，IL-1α處理72h后，成纖維細胞上清液中的亞硝酸鹽水平顯著升高（圖5G）并且DNA損傷增加（圖5H）。然而，使用Nos2抑制劑W1400或通過anakinra抑制IL-1信號轉導會阻斷亞硝酸鹽的產(chǎn)生，進而防止成纖維細胞的DNA損傷和衰老（圖5H和5I）。
作者鑒定到APTKA腫瘤的間質細胞核中p21顯著增加，放療后SA-β-gal陽性間質細胞顯著增加（圖6A）。隨后，作者將APTKA腫瘤移植到Trp53小鼠體內，結果表明IL-1α條件下對放療處理后的Trp53缺失成纖維細胞具有衰老抗性。因此，在具有Trp53/間質的小鼠中，APTKA腫瘤對放療效果較好，腫瘤體積顯著減小，侵襲性腫瘤生長減弱（圖6B-6H）。此外，用C57BL/6+ venetoclax對腫瘤進行藥物靶向（圖6I）。APTKA腫瘤接受放療后，腫瘤負荷顯著下降（圖6J），還會抑制腫瘤侵襲和肝轉移（圖6K和6L），DCN+細胞減少和CD8+ T細胞浸潤水平增加（圖6M-6O）。
6.低水平IL-1ra會增強直腸癌患者的IL-1信號轉導進而使CAFs更易發(fā)生治療性衰老
最后，作者使用小鼠模型研究IL-1α誘導的腫瘤微環(huán)境變化是否與直腸癌患者治療反應不良有關。作者對治療前血清樣本進行Bio-Plex分析，結果表明IL-1β和其他細胞因子，趨化因子沒有顯著差異（圖7A）。然而，在non-pCR伴隨淋巴結轉移的患者和接受CRT且預后不良的患者中IL-1ra的水平顯著降低（圖7B）。已有研究表明IL-1ra與rs4251961 T/C和rs579543 G/A這兩個SNP有關。作者的結果表明純合子rs4251961 T/T患者中血清IL-1ra水平升高，但IL-1ra與rs579543沒有相關性（圖7C）。在接受CRT治療的患者中，接受治療前IL1RN低表達水平與DFS較差有關（圖7D）。對接受CRT前后的患者進行PCA聚類，可以清晰的聚為兩類（圖7E）。CRT會誘導EMT,ECM和膠原形成（圖7F）。免疫組化結果表明，CRT會誘導基質細胞反應（圖7G和7H）和p21積累（圖7I）。作者從6例接受CRT的患者和手術患者的活體組織中構建PDO，其患者的IL-1ra和IL-1α具有顯著差異（圖7J）。對正常樣本和接受CRT的患者檢測炎癥基因和亞硝酸鹽水平，其患者的炎癥基因和亞硝酸鹽水平具有顯著差異（圖7L和7M）。成纖維細胞的SA-β-gal染色表明，IL-1ra-低處理的成纖維細胞接受放療后，成纖維細胞發(fā)生較強的衰老（圖7N）。
結論：
已有研究表明放療和化療都會對CAF在內的基質成分產(chǎn)生影響，同時CAF同樣會對放療效果產(chǎn)生影響。作者的結果表明腫瘤細胞和CAF之間的相互作用會影響化療對直腸癌的作用。總的來說，作者使用生物信息分析和實驗相結合的方法強調了CAF對直腸癌患者治療反應的影響。
參考文獻：
Nicolas A M , Pesic M , Engel E , et al. Inflammatory fibroblasts mediate resistance to neoadjuvant therapy in rectal cancer. 2022.
