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鼠標(biāo)點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)就能發(fā)27+，檸檬樹上檸檬果，檸檬樹下你和我！
哈嘍，大家好!你們見過全文只有2張圖的SCI嗎？還是IF 27+的那種！今天小編為大家?guī)硪黄衲?1月發(fā)表在Molecular Cancer的單基因泛癌分析，題目為Hiding in the dark: pan-cancer characterization of expression and clinical relevance of CD40 to immune checkpoint blockade therapy，影響因子27分+！總以為純生信不好發(fā)了，單基因也沒有多大研究意義，泛癌分析好像也爛大街了……哎，眼瞅著別人純生信單基因泛癌分析又發(fā)27+，真的是檸檬樹上檸檬果，檸檬樹下你和我！
數(shù)據(jù)來源
老規(guī)矩，先看數(shù)據(jù)來源~不過這篇文章的數(shù)據(jù)來源好像有點(diǎn)獨(dú)樹一幟的風(fēng)格，本文采用的是TCGA / TARGET / GTEx RNA-Seq聯(lián)合數(shù)據(jù)集，包括3個(gè)單獨(dú)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，如下：
1）TCGA：眾所周知，TCGA數(shù)據(jù)庫是目前最綜合最全面的腫瘤數(shù)據(jù)庫，收錄了來自20000個(gè)病人，33個(gè)癌癥的數(shù)據(jù)。包括患者的臨床樣本信息以及測(cè)序數(shù)據(jù)(包括基因組，轉(zhuǎn)錄組，表觀遺傳，蛋白組等各個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù))。
2）TARGET：2018年上線的新腫瘤數(shù)據(jù)庫，主要針對(duì)兒童腫瘤，包含RNA、WGS、WES、CNV、甲基化等測(cè)序結(jié)果，同時(shí)具有比較完整的臨床信息。
3）GTEX：第一個(gè)收集了多個(gè)人體器官mRNA測(cè)序的數(shù)據(jù)庫，包括來自449名生前健康的遺體捐贈(zèng)者44個(gè)不同器官的測(cè)序數(shù)據(jù)，覆蓋面非常廣。
TCGA數(shù)據(jù)庫綜合全面、權(quán)威，但是缺點(diǎn)就是正常組織樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)非常少；而GTEx可以非常好地彌補(bǔ)這個(gè)缺點(diǎn)，GTEx的最大優(yōu)勢(shì)就在于正常組織樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)非常多。相比于TCGA，TARGET針對(duì)的面窄了一些，但同時(shí)也意味著，它的內(nèi)容更具針對(duì)性，同時(shí)也是一個(gè)比較新的數(shù)據(jù)庫，可以在一定程度上為文章注入新的血液，畢竟老生常談的那些常見生信數(shù)據(jù)庫也被挖掘的差不多了，如果這個(gè)時(shí)候在文章中增加一個(gè)新的數(shù)據(jù)庫，會(huì)讓讀者眼前一亮。本文的一大特色之處就是聯(lián)合使用這3個(gè)數(shù)據(jù)庫，兩兩互補(bǔ)，在經(jīng)典的基礎(chǔ)上進(jìn)行了創(chuàng)新。
結(jié)果解讀
本文雖然是27+的水平，但是它的結(jié)果部分卻非常簡單，僅僅只有2張組圖而已，小編今天就帶大家“看圖說話”。
1.CD40與1型抗腫瘤反應(yīng)和良好預(yù)后有關(guān)
第一張組圖分3個(gè)小圖，主要講述了CD40的表達(dá)與I型抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)和生存率呈正相關(guān)。
圖1A是通過UCSC Xena網(wǎng)站獲取了TCGA/TARGET/GTEx這3個(gè)數(shù)據(jù)庫中正常和腫瘤組織中指定基因（下文會(huì)提到的一些與CD40相關(guān)的markers）的表達(dá)數(shù)據(jù)，并繪制了熱圖。這里有必要講一下“UCSC Xena”這個(gè)在線網(wǎng)站:它是一個(gè)對(duì)多種常用的生信數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次開發(fā)的衍生網(wǎng)站，收錄了TCGA、ICGC、TARGET、GTEx等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的公共數(shù)據(jù)。相信對(duì)于很多做生信分析的小伙伴來說，并不是專業(yè)的“碼農(nóng)”，所以無論是數(shù)據(jù)下載還是后期的數(shù)據(jù)處理，都是我們的一大痛點(diǎn)。而UCSC Xena正好解決了我們這個(gè)難題，這個(gè)在線網(wǎng)站基本上保留了原有數(shù)據(jù)庫的所有數(shù)據(jù)，還對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了整理，我們可以直接下載使用，基本上能滿足我們做生信的大多數(shù)需求。在本文中作者就是通過UCSC Xena下載數(shù)據(jù)，并利用聯(lián)合數(shù)據(jù)庫中可用的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相應(yīng)的正常組織數(shù)據(jù)一共確定了23種癌癥類型，用于以下的研究。
圖1B分析了CD40 mRNA表達(dá)與其配體（CD40LG）以及一些markers的相關(guān)性，并繪制了秩相關(guān)矩陣，主要目的是為了分析CD40的表達(dá)與I型抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)系，這些markers主要是腫瘤中的一些免疫細(xì)胞、可能發(fā)生的反應(yīng)以及細(xì)胞增殖與死亡的生物標(biāo)記物。貼心的小編猜測(cè)你可能并不關(guān)心具體是哪些makers以及最終的結(jié)果，所以小編就用“需要用放大鏡才能看到的”字體展示了。
markers包括MHC（HLA-DRA），樹突狀細(xì)胞（BATF3），B細(xì)胞（PAX5），巨噬細(xì)胞（CD68），粒細(xì)胞（主要是嗜中性粒細(xì)胞，CD177），T細(xì)胞（CD4和CD8A），I型抗腫瘤反應(yīng)（IFNG和GZMB），細(xì)胞增殖（MKI67），細(xì)胞死亡（BAX），細(xì)胞活力（正常（n = 8152）和癌癥（n = 10137）組織中的BCL2）和II型促腫瘤反應(yīng)（IL5）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD40在正常組織和腫瘤微環(huán)境中均與CD40LG適度共表達(dá)。在正常組織中，CD40與I型反應(yīng)（IFNG，r= 0.33;GZMB，r= 0.37）和抗原呈遞（HLA-DRA，r = 0.53），T輔助細(xì)胞Th（CD4，r= 0.41）呈正相關(guān)，而與細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CD8A，r= 0.19）相關(guān)性不明顯。與細(xì)胞增殖（MKI67）最相關(guān)的是CD40LG（r = 0.61）和促凋亡標(biāo)志物BAX（r = 0.56），這表明CD40/CD40LG軸在免疫細(xì)胞更新和體內(nèi)平衡過程中具有重要作用。CD68（巨噬細(xì)胞）而不是CD177（嗜中性粒細(xì)胞），在正常（r = 0.42）和腫瘤（r = 0.38）組織中與CD40呈正相關(guān)。此外，CD68（巨噬細(xì)胞）與抗原呈遞反應(yīng)高度相關(guān)（HLA-DRA，正常和腫瘤組織中的r = 0.71和0.60），并且與GZMB適度相關(guān)（在正常和腫瘤組織中分別為0.54和0.47）。在TME中，發(fā)現(xiàn)CD40表達(dá)與I型反應(yīng)（HLA-DRA,r = 0.46），T細(xì)胞(CD4,r = 0.44;CD8A,r = 0.48)和APC反應(yīng)(IFNG,r = 0.40;GZMB,r = 0.45)呈中度相關(guān)。此外，CD40與正常（r = 0.30）和腫瘤（r = 0.36）組織中的BATF3（樹突狀細(xì)胞）呈中度相關(guān)。相比之下，CD40LG與PAX5（B細(xì)胞，正常和腫瘤組織中的r = 0.45和0.46分別）適度相關(guān)，但與BATF3（樹突狀細(xì)胞）無關(guān)。在腫瘤中，APC標(biāo)志物HLA-DRA（MHC分子），BATF3（樹突狀細(xì)胞），PAX5（B細(xì)胞）和CD68（巨噬細(xì)胞）與CD8A，IFNG和GZMB呈正相關(guān)（r>0.3）?？傊?，這些結(jié)果表明，雖然CD40 / CD40LG信號(hào)可能由APCs以上下文依賴性的方式介導(dǎo)的，但它與T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（CD8A，IFNG和GZMB）有關(guān)。觀察到的CD40表達(dá)與I型抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)可能部分由TME中的CD40、CD8 T細(xì)胞引起，因?yàn)镃D40激活是其記憶生成的基礎(chǔ)。CD40/C40LG與TME中的細(xì)胞死亡（BAX）或細(xì)胞存活（BCL2）標(biāo)志物之間沒有相關(guān)性。此外，CD40/CD40LG軸與正常或癌組織中的II型促腫瘤反應(yīng)（IL5）沒有相關(guān)性。
圖1C通過Xena平臺(tái)構(gòu)建了以CD40四分位數(shù)分層的總生存Kaplan-Meier圖。
結(jié)果顯示，腫瘤中的高CD40表達(dá)與癌癥患者更好的生存率有關(guān)。
2.CD40靶向RAS/RAF/PI3K，與免疫治療相關(guān)
第二張主圖分5張小圖，主要描述了CD4在不同癌癥中的表達(dá)水平和相關(guān)的通路及其在免疫檢查點(diǎn)阻斷治療反應(yīng)中的預(yù)測(cè)價(jià)值。
圖2A是在23種癌癥類型中分析了CD40的表達(dá)水平。
結(jié)果顯示，與相應(yīng)的正常組織相比，CD40在11種惡性腫瘤中下調(diào)，包括腦癌，乳腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，卵巢癌，食道癌，皮膚癌，前列腺癌，子宮癌，子宮內(nèi)膜癌和血癌。而在5種惡性腫瘤（甲狀腺，睪丸，頭頸，腎上腺和腎臟）中CD40表達(dá)升高。
圖2B驗(yàn)證了CD40在黑素細(xì)胞痣（簡稱“痣”）樣本中的表達(dá)，并使用NCBI-GSE112509據(jù)集將其與黑色素瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了比較。
結(jié)果顯示，在NRASwt/BRAFwt 痣, NRASwt/BRAFmut 痣和 NRASwt/BRAFwt 黑色素瘤中，CD40的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。但是，發(fā)現(xiàn)了CD40在具有致癌NRAS和BRAF突變的黑色素瘤組織中的表達(dá)異質(zhì)性，與NRASwt/BRAFmut痣組織相比，CD40在NRASwt/BRAFmut黑色素瘤中表達(dá)減少。此外，與NRASwt/BRAFwt痣、NRASwt/BRAFmut痣或NRASwt/BRAFwt黑色素瘤組織相比，NRASmut黑色素瘤中CD40表達(dá)降低。
圖2C在TCGA數(shù)據(jù)庫中的Firehose Legacy黑色素瘤數(shù)據(jù)集(n=479)進(jìn)一步分析了CD40在不同突變類型黑色素瘤中的表達(dá)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RAS (N/H/K)突變單獨(dú)(p=0.058)或與NF1突變聯(lián)合(p=0.038)，與黑素瘤中CD40表達(dá)減少相關(guān)。這些結(jié)果與先前報(bào)道的“抑制RAS/RAF/PI3K通路增加黑色素瘤細(xì)胞中CD40表達(dá)”的結(jié)果非常吻合。
圖2D通過NCI數(shù)據(jù)庫(一個(gè)經(jīng)過校對(duì)的權(quán)威通路互作數(shù)據(jù)庫，http://www.ndexbio.org/)分析了CD40的互作通路。
結(jié)果顯示，CD40/CD40LG軸可能導(dǎo)致MAPK，PI3K / AKT，NF-κB和JAK3 / STAT5途徑的激活。
圖2E通過TIDE數(shù)據(jù)庫評(píng)估了CD40預(yù)測(cè)不同腫瘤免疫治療效果的價(jià)值。作者分析了CD40表達(dá)的ROC曲線下面積(AUC)，并將其與現(xiàn)有的生物標(biāo)志物(包括腫瘤突變負(fù)荷(TMB)、CD274 (PD-L1)和CD8)進(jìn)行比較，判斷其作為預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)工具的潛力。TIDE數(shù)據(jù)庫全稱是Tumor Immune Dysfunction and Exclusion，翻譯為中文就是腫瘤免疫功能障礙和排斥，網(wǎng)址為http://tide.dfci.harvard.edu/，主要用來推測(cè)調(diào)節(jié)腫瘤免疫基因的功能，綜合分析免疫功能障礙和排斥對(duì)腫瘤的免疫逃逸機(jī)制，從而來有效預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制治療的效果
結(jié)果顯示，在≥50%的黑色素瘤隊(duì)列和一個(gè)胃癌隊(duì)列中，CD40的預(yù)測(cè)性能與CD8相當(dāng)，這兩個(gè)生物標(biāo)志物的AUC >0.7，預(yù)測(cè)免疫治療陽性反應(yīng)的可能性很強(qiáng)。值得注意的是，CD40 是唯一在預(yù)測(cè)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 ICB 反應(yīng)方面取得良好性能的生物標(biāo)志物（AUC = 0.83）。 TMB (AUC = 0.73) 和 CD274 (AUC = 0.7) 分別在一個(gè)膀胱癌隊(duì)列和一個(gè) HNSC 隊(duì)列中可以預(yù)測(cè) ICB（免疫檢查點(diǎn)阻斷）反應(yīng)。值得注意的是，在用α-CTLA4或α-PD1治療的兩個(gè)黑色素瘤患者隊(duì)列中，高CD40與更好的總生存期（OS）相關(guān)。然而，接受α-PD-L1治療的膀胱癌患者或接受α-PD1治療的腎癌患者中，CD40與OS沒有特別顯著的相關(guān)性。
結(jié)語
好了，到這里“看圖說話”就結(jié)束了，我們回頭總結(jié)以下，為什么這篇文章的圖文這么簡單，卻還能發(fā)27+呢？小編認(rèn)為有以下2點(diǎn)：
（1）選題非常好，貼近熱點(diǎn)，具有較高的臨床意義：免疫檢查點(diǎn)抑制劑 (ICB)的腫瘤治療只有一部分人可以長期獲益，如果能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)具體哪些患者可以獲益，將會(huì)推動(dòng)醫(yī)學(xué)發(fā)展的巨大進(jìn)步。
（2）聯(lián)合多種數(shù)據(jù)庫，內(nèi)容更全面:作者不僅采用TCGA等常見的數(shù)據(jù)庫，還利用一些比較新的數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)庫之間相互彌補(bǔ)，相互印證，結(jié)果更可靠。
參考文獻(xiàn):
Yan, C., Richmond, A. Hiding in the dark: pan-cancer characterization of expression and clinical relevance of CD40 to immune checkpoint blockade therapy. Mol Cancer 20, 146 (2021). https://doi.org/10.1186/s12943-021-01442-3
