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不容錯(cuò)過(guò)的5+鐵死亡生信分析思路
作為一種新的細(xì)胞死亡方式，鐵死亡的發(fā)現(xiàn)為許多疾病的認(rèn)識(shí)和治療提供了新的思路。今天小編和大家分享一篇今年7月份發(fā)表于《Frontiers in Pharmacology》（IF：5.988）雜志上的關(guān)于鐵死亡的生信分析文章。該文章主要以基于鐵死亡的胃癌患者分型和預(yù)后為主線，并在此基礎(chǔ)之上結(jié)合突變、拷貝數(shù)變異、DNA甲基化、免疫相關(guān)特征、藥物反應(yīng)等多個(gè)維度綜合地反映鐵死亡在胃癌中的功能重要性及其廣泛的臨床應(yīng)用。
綜合分析胃癌中鐵死亡的變異和功能重要性
一、研究背景
鐵死亡（Ferroptosis）被描述為一種受脂質(zhì)過(guò)氧化調(diào)節(jié)的鐵依賴性壞死。最近，一些研究提出了鐵死亡在胃癌（GC）中調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)展和耐藥性的關(guān)鍵作用，其中刺激癌癥鐵死亡是一種很有前景的胃癌治療策略。然而，鐵死亡在胃癌中的詳細(xì)特征仍然不為人所知。在此，該研究系統(tǒng)地分析了鐵死亡的調(diào)控子以及刻畫(huà)了基于鐵死亡的治療策略在胃癌中的潛能。
二、結(jié)果
1、胃癌中鐵死亡調(diào)控子的表達(dá)、遺傳突變和DNA甲基化藍(lán)圖
作者收集了60個(gè)鐵死亡調(diào)控子（圖1A），發(fā)現(xiàn)相比于正常組織，大多數(shù)的鐵死亡調(diào)控子普遍在胃癌中表達(dá)上調(diào)（圖1B）以及發(fā)生拷貝數(shù)擴(kuò)增（圖1D）。并且拷貝數(shù)擴(kuò)增與胃癌中鐵死亡調(diào)控子的表達(dá)正相關(guān)（圖1E），而表觀遺傳修飾DNA甲基化與鐵死亡調(diào)控子表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（圖1F）。綜上，結(jié)果表明拷貝數(shù)擴(kuò)增與低甲基化可能導(dǎo)致了鐵死亡調(diào)控子在胃癌中的過(guò)表達(dá)。作者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)鐵死亡調(diào)控子的表達(dá)在胃癌的分子亞型（EBV、MSI、GS、CIN）以及甲基化亞型（CIMP-High、CIMP-Low、CIMP-EBV、non-CIMP）呈現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性，其中鐵死亡調(diào)控子在MSI以及CIMP-Low亞型中普遍高表達(dá)（圖1G-I）。此外，鐵死亡調(diào)控子HMOX1在EBV與CIMP-EBV亞型中具有較高的表達(dá)水平（圖1j-L）。
圖1、胃癌中鐵死亡調(diào)控子的表達(dá)、遺傳突變和DNA甲基化藍(lán)圖
2、胃癌中鐵死亡調(diào)控子的生物學(xué)功能、預(yù)后價(jià)值和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性
KEGG通路富集分析結(jié)果顯示鐵死亡調(diào)控子主要富集了花生四烯酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、鐵死亡和谷胱甘肽代謝相關(guān)通路（圖2A）。GO功能富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因參與脂肪酸衍生物代謝過(guò)程、谷胱甘肽代謝過(guò)程、氧化應(yīng)激反應(yīng)和硫化合物代謝過(guò)程（圖2B-D）。隨后，作者收集并整合了五套胃癌的數(shù)據(jù)集（圖2E，F(xiàn)），在整合數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)15個(gè)鐵死亡調(diào)控子與胃癌預(yù)后顯著相關(guān)（圖2G）。基于額外的胃癌藥物敏感數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)鐵死亡調(diào)控子與多種藥物敏感性顯著相關(guān)（圖2H）。此外，鐵死亡調(diào)控子顯示出與免疫浸潤(rùn)的明顯關(guān)聯(lián)，表明了胃癌中鐵死亡與腫瘤免疫之間的相互作用，例如HMOX1高表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平升高相關(guān)（圖J）。
圖2、胃癌中鐵死亡調(diào)控子的生物學(xué)功能、預(yù)后價(jià)值和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性
3、建立3個(gè)鐵死亡調(diào)控子介導(dǎo)的亞型，其具有不同的預(yù)后與免疫浸潤(rùn)
基于上述整合數(shù)據(jù)中鐵死亡調(diào)控子的表達(dá)，一致性聚類識(shí)別到3個(gè)亞型（亞型A-C）（圖3A-D），并且亞型間鐵死亡調(diào)控子的表達(dá)差異被t-SNE結(jié)果所證實(shí)（圖3E）。其中亞型B具有最差的生存結(jié)果，而亞型C具有顯著的生存優(yōu)勢(shì)。亞型B中大多數(shù)的鐵死亡調(diào)控子都明顯表達(dá)下調(diào)（圖3G），并且hallmarker通路活性結(jié)果顯示一些KRAS信號(hào)、乏氧、Notch信號(hào)以及hedgehog信號(hào)等致癌通路在亞型B中顯著激活，指示了其較差的預(yù)后（圖3H）。免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示亞型B具有較高的先天免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、髓系抑制性細(xì)胞以及漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞）以及適應(yīng)性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（如效應(yīng)記憶CD4+ T細(xì)胞、激活B細(xì)胞、激活CD8+ T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+ T細(xì)胞、中央記憶CD8+ T細(xì)胞以及中央記憶CD4+ T細(xì)胞）（圖3IJ）。
圖3、建立3個(gè)鐵死亡調(diào)控子介導(dǎo)的亞型，其具有不同的預(yù)后與免疫浸潤(rùn)
4、識(shí)別3個(gè)鐵死亡基因組亞型，其具有不同的預(yù)后與腫瘤微環(huán)境特征
作者進(jìn)一步識(shí)別了上述鐵死亡亞型間74個(gè)共享的差異表達(dá)基因（圖4A，B），這些基因主要參與了上皮細(xì)胞調(diào)控與上皮細(xì)胞增殖等基質(zhì)激活相關(guān)過(guò)程以及細(xì)胞因子分泌等免疫相關(guān)過(guò)程（圖4C）?；谏鲜龉蚕聿町惐磉_(dá)基因，無(wú)監(jiān)督聚類將樣本重新劃分為3類（鐵死亡基因組亞型A-C）（圖4D-G），其中基因組亞型C具有最差的預(yù)后，而基因組亞型A具有最好的生存優(yōu)勢(shì)（圖4H）。深入分析發(fā)現(xiàn)基因組亞型C具有較高的先天免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、髓系抑制性細(xì)胞以及漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞）（圖4I），并且高表達(dá)免疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)基因BTLA, CD200, CD200R1,CD28, CD40LG, CD44, CD48,LAIR1, NRP1, PDCD1LG2,TNFRSF14, TNFRSF18與 TNFRSF8（圖J）。
圖4、識(shí)別3個(gè)鐵死亡基因組亞型，其具有不同的預(yù)后與腫瘤微環(huán)境特征
5、鐵死亡指數(shù)得分的建立及其相關(guān)臨床特征的評(píng)估
基于單變量Cox回歸分析，作者識(shí)別到22個(gè)與胃癌預(yù)后相關(guān)的共享差異表達(dá)基因（表1），進(jìn)而基于其表達(dá)水平采用主成分分析方法開(kāi)發(fā)了FPI（Ferroptosis Index）得分來(lái)量化鐵死亡亞型，發(fā)現(xiàn)高PFI得分指示較差的預(yù)后（圖5A）。PFI的臨床特征關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)年齡不滿65歲（vs ≥65）、癌癥等級(jí)G3（vs others）與癌癥分期II-IV（vs I）的患者群體具有更高的PFI得分，而不同性別間PFI不存在差異。這些結(jié)果指示PFI可能預(yù)測(cè)胃癌的惡性程度。此外，胃癌的分子亞型GS（vs EBV、MSI與CIN）、微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)MSS（vs MSI與MSL）以及DNA甲基化亞型non-CIMP（vs CIMP-High、CIMP-Low、CIMP-EBV）具有最高的PFI得分（圖5G-H）。
表1、胃癌預(yù)后相關(guān)的共享差異表達(dá)基因
圖5、鐵死亡指數(shù)得分的建立及其相關(guān)臨床特征的評(píng)估
6、鐵死亡指數(shù)得分與腫瘤免疫的關(guān)聯(lián)
進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)高PFI得分的患者具有較高的先天免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、髓系抑制性細(xì)胞以及漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞）、適應(yīng)性免疫細(xì)胞浸潤(rùn)（如效應(yīng)記憶CD4+ T細(xì)胞、激活B細(xì)胞、激活CD8+ T細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD8+ T細(xì)胞、中央記憶CD8+ T細(xì)胞以及中央記憶CD4+ T細(xì)胞）以及免疫監(jiān)測(cè)點(diǎn)表達(dá)（如CD40LG, CD40, BTLA,CD200R1,TNFSF14, CD27, LAIR1, CD28, HAVCR2, CD86,PDCD1LG2, TNFSF4, CD48, CD44, CD200與NRP1）（圖6A，B）。FPI得分與pan-F-TBRS、血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等基質(zhì)激活通路呈正相關(guān)，而與DNA損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、核苷酸切除修復(fù)、同源重組和錯(cuò)配修復(fù)以及致癌途徑如p53信號(hào)通路、癌癥錯(cuò)配、病毒致癌等呈負(fù)相關(guān)（圖6C）。
圖6、鐵死亡指數(shù)得分與腫瘤免疫的關(guān)聯(lián)
7、鐵死亡指數(shù)得分預(yù)測(cè)免疫反應(yīng)
作者首先在4套額外的數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了高PFI得分指示更差的生存結(jié)果（圖7A-D）。而對(duì)于免疫治療，作者發(fā)現(xiàn)FPI得分高的患者卻更可能對(duì)抗CTLA-4治療產(chǎn)生治療響應(yīng)。另外，在兩個(gè)anti-PD-1治療隊(duì)列中都發(fā)現(xiàn)高PFI得分指示更好的生存（圖7G，I），而且高PFI得分患者相比于低PFI得分患者具有更高的治療響應(yīng)率 (圖7H，J)。
圖7、鐵死亡指數(shù)得分預(yù)測(cè)免疫反應(yīng)
8、基于鐵死亡指數(shù)得分預(yù)測(cè)胃癌潛在的治療藥物
作者進(jìn)一步評(píng)估了化療藥物多西他賽和順鉑的藥物反應(yīng)。結(jié)果表明高PFI得分樣本具有顯著下降的多西他賽和順鉑的IC50值（圖8A，B），表明高PFI指示更高的多西他賽和順鉑的藥物敏感性。此外，作者基于PFI得分與化合物藥物敏感性間的相關(guān)性預(yù)測(cè)了胃癌的潛在藥物，包括6個(gè)CTRP衍生的化合物（圖C）以及13個(gè)PRISM衍生的化合物（圖E），并且FPI得分高的患者更有可能從上述化合物中獲益（圖8D，F(xiàn)）。
圖8、基于鐵死亡指數(shù)得分預(yù)測(cè)胃癌潛在的治療藥物
總結(jié)：
作者首先以鐵死亡調(diào)控子為切入點(diǎn)，刻畫(huà)了鐵死亡在胃癌中的基因組突變、拷貝數(shù)變異以及DNA甲基化藍(lán)圖，隨后重點(diǎn)基于鐵死亡識(shí)別的亞型與患者預(yù)后開(kāi)發(fā)了PFI得分來(lái)定量化鐵死亡亞型，PFI得分與患者生存結(jié)果、hallmarker通路、腫瘤微環(huán)境、化療耐受以及免疫反應(yīng)相關(guān)，并且可以預(yù)測(cè)胃癌潛在的治療藥物。該文章主要從鐵死亡亞型及其預(yù)后指示效能兩種主要維度，從多組學(xué)，多維度以及多層面的角度刻畫(huà)了鐵死亡在胃癌中的關(guān)鍵作用，非常值得借鑒。
