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大家好，今天給大家?guī)?lái)一篇肺癌亞型研究的文章，能不能給大家?guī)?lái)一些思路和創(chuàng)新點(diǎn)呢？這是一篇十一月發(fā)表在《Cancer Cell》上的文章，可見(jiàn)現(xiàn)在癌癥亞型研究多么的熱門(mén)了，那么如何再一些癌癥已有成熟的分子分型之后再次引入我們自己研究的分子分型呢？這篇文章將通過(guò)干濕結(jié)合的方法為研究人員帶來(lái)思路。
小細(xì)胞肺癌(SCLC)是一種侵襲性惡性腫瘤，包括ASCL1、NEUROD1和POU2F3的差異表達(dá)所定義的亞型(分別為SCLC-A、-N和-P)。為了確定不同亞型腫瘤及其相關(guān)微環(huán)境的異質(zhì)性，研究人員對(duì)21個(gè)人類(lèi)標(biāo)本中的155098個(gè)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，其中包括54523個(gè)SCLC轉(zhuǎn)錄組。研究人員觀察到SCLC比肺腺癌更豐富的腫瘤多樣性，由典型亞型、中間亞型和混合亞型驅(qū)動(dòng)。研究人員發(fā)現(xiàn)了一種plcg2高的SCLC表型，具有莖樣、前轉(zhuǎn)移特征，在各個(gè)亞型中復(fù)發(fā)，并預(yù)測(cè)總體生存率較差。與肺腺癌相比，SCLC表現(xiàn)出更大的免疫隔離和更少的免疫浸潤(rùn)，而SCLC-N比SCLC-A表現(xiàn)出更少的免疫浸潤(rùn)和更大的T細(xì)胞功能障礙。研究人員在SCLC腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)促纖維化、免疫抑制的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群體，該群體與復(fù)發(fā)性、plcg2高亞群特別相關(guān)。
大多數(shù)小細(xì)胞肺癌(SCLC)腫瘤共享一個(gè)小PLCG2-high分組人口。
這種PLCG2高的SCLC亞群與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)。
SCLC亞群在促纖維化和免疫抑制的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中富集。
髓樣細(xì)胞的存在與PLCG2高的SCLC亞群有關(guān)。
根據(jù)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá)水平，可將小細(xì)胞肺癌可分為四種分子亞型：SCLC-A型（ASCL1高表達(dá)），SCLC-N型（NeuroD1高表達(dá)），SCLC-Y型（YAP1高表達(dá)）和SCLC-P型（POU2F3高表達(dá)），其中SCLC-A型和SCLC-N型屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，見(jiàn)圖1。
研究人員分析了來(lái)自21個(gè)新鮮SCLC臨床樣本的155,098個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組(圖S1A;)，以及24個(gè)LUAD和4個(gè)癌旁正常肺樣本作為對(duì)照(圖1A和S1B)。SCLC和LUAD隊(duì)列包括治療和未治療的患者(圖1B)。將所有scRNA-seq數(shù)據(jù)合并、歸一化、批量校正和聚類(lèi)以識(shí)別粗細(xì)胞類(lèi)型，包括上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞(圖1A、S1B和S1C)。發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步聚類(lèi)在上皮腔內(nèi)的細(xì)胞包括呼吸上皮細(xì)胞(包括肺泡上皮細(xì)胞1型和2型、纖毛細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和簇狀細(xì)胞)和肝轉(zhuǎn)移細(xì)胞。
14例SCLC樣本的間充質(zhì)干細(xì)胞靶向測(cè)序顯示RB1和TP53頻繁突變或缺失，CREBBP和KMT2B反復(fù)發(fā)生突變(圖S1D和S1E)。這一信息有助于鑒別含有特征變異轉(zhuǎn)錄本的癌細(xì)胞。研究人員檢測(cè)到SCLC中CNV水平高于LUAD(圖S1F)，這與先前驗(yàn)證的SCLC中較高的腫瘤突變負(fù)擔(dān)一致?；趯?duì)細(xì)胞來(lái)源類(lèi)型的研究，研究人員認(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌和肺泡上皮2型樣癌細(xì)胞簇分別代表SCLC和LUAD。根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)注，研究人員在圖譜中描述了腫瘤的異質(zhì)性。在38個(gè)上皮細(xì)胞簇中(N = 64301個(gè)細(xì)胞)，研究人員發(fā)現(xiàn)LUAD和SCLC如預(yù)期的那樣分別聚集;5個(gè)LUAD簇包含24個(gè)腫瘤的7635個(gè)細(xì)胞，25個(gè)SCLC簇包含21個(gè)腫瘤的55815個(gè)細(xì)胞，與LUAD的高基質(zhì)含量一致。為了量化SCLC患者間的異質(zhì)性，研究人員計(jì)算了每個(gè)聚類(lèi)患者的Shannon entropy。低Shannon entropy意味著群集表型很少在患者之間共享，即患者間異質(zhì)性高。惡性SCLC細(xì)胞顯示出明顯高于LUAD細(xì)胞的患者間異質(zhì)性(更低的Shannon entropy)(圖1D)，即使只分析未治療的樣本(圖1E)。研究人員觀察到基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞群體的表型多樣性較低，這與樣本間的批效應(yīng)最小一致，腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)相比的多樣性較高，這與之前的研究一致。研究人員的研究結(jié)果表明，盡管SCLC的組織學(xué)形態(tài)同質(zhì)，但它具有高度的轉(zhuǎn)錄腫瘤異質(zhì)性，超過(guò)LUAD和正常間質(zhì)。
接下來(lái)，研究人員考慮了數(shù)據(jù)集中的54,523個(gè)SCLC細(xì)胞，并在典型SCLC亞型中描述了細(xì)胞狀態(tài)。SCLC亞型通常通過(guò)ASCL1、NEUROD1、POU2F3和YAP1的表達(dá)進(jìn)行分類(lèi)，但考慮到基因缺失的普遍存在，單基因策略對(duì)scRNA-seq是不可靠的。于是，研究人員開(kāi)始質(zhì)疑YAP1單獨(dú)作為亞型標(biāo)志物的價(jià)值。因此，研究人員使用了基于鄰域圖的方法，該方法利用多個(gè)基因來(lái)定義每個(gè)亞型的全部復(fù)雜性，來(lái)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞給定SCLC亞型的概率(圖1F)。研究人員確定最可能的子類(lèi)型的每一個(gè)細(xì)胞(圖1G)和使用這個(gè)分類(lèi)每個(gè)樣本的主要SCLC-A(N=14),SCLC-N(N=6),或SCLC-P(N=1)。但是這個(gè)分類(lèi)沒(méi)有識(shí)別出任何SCLC-Y腫瘤,符合YAP1在SCLC表達(dá)量最小。這一觀察得到了典型轉(zhuǎn)錄因子的相對(duì)表達(dá)(圖1H)、相應(yīng)的MYC家族成員(圖S1G)、以及匹配的免疫組化(IHC)(圖S1H)的支持。與單基因表達(dá)或IHC不同，研究人員的策略可以對(duì)ASCL1和NEUROD1均高表達(dá)的病例(如Ru1231，分類(lèi)為SCLC-N)和兩者均低表達(dá)的病例(如Ru1293，由于NEUROD2和NEUROD4的表達(dá)而分類(lèi)為SCLC-N)進(jìn)行分類(lèi)。研究人員還鑒定了SCLC-A至SCLC-N表達(dá)譜的中間癌細(xì)胞，這些細(xì)胞可以提示過(guò)渡性或非典型表型，以及混合亞型和帶有野生型TP53/RB1的非典型SCLC表型的腫瘤(圖S2A和S2B)。
為了更好地定義SCLC亞型在腫瘤進(jìn)展中的作用，研究人員評(píng)估了不同亞型的細(xì)胞組成和基因表達(dá)差異(圖S2C)。研究人員關(guān)注SCLC-A和-N亞型，因?yàn)檠芯咳藛T的隊(duì)列只包括一個(gè)SCLC-P病例。與小鼠模型一致，SCLC-A在原發(fā)腫瘤中明顯過(guò)多富集，而SCLC-N在淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤中富集(圖S2D)。研究人員還觀察到SCLC-N 腫瘤比SCLC-A患者具有更大的患者間多樣性(圖1D)。這些發(fā)現(xiàn)與臨床前模型一致，表明SCLC-N可以通過(guò)離散進(jìn)化從SCLC-A衍生出來(lái)。
研究人員進(jìn)行了差異表達(dá)和途徑分析，以確定亞型特異性基因程序(圖2A和S2E;表S3 S8)。發(fā)現(xiàn)SCLC- a在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程和DNA修復(fù)的基因表達(dá)中富集，以及參與SCLC細(xì)胞周期調(diào)控的EZH2靶基因(圖S2E)。相比之下，SCLC-N腫瘤表現(xiàn)出一種前轉(zhuǎn)移模式的基因表達(dá)，包括過(guò)表達(dá)的標(biāo)志物(1)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，(2)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子b ，(3)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)信號(hào)，(4)信號(hào)傳感器和轉(zhuǎn)錄激活器，(5)腫瘤壞死因子α促進(jìn)核因子kB信號(hào)(圖2A, 2B和S2E)。
SCLC-N還富集于神經(jīng)元分化和神經(jīng)肽信號(hào)，包括ephrin和信號(hào)素，參與軸突源性信號(hào)傳導(dǎo)的基因家族(圖2A和2B)。此前的研究表明，軸突發(fā)生程序協(xié)調(diào)神經(jīng)元遷移，并與SCLC轉(zhuǎn)移有關(guān)，而ephrin和semaphorin通路成分是NEUROD1的靶標(biāo)或NEUROD1高表型的調(diào)節(jié)因子。
研究人員進(jìn)一步評(píng)估了亞型內(nèi)差異表達(dá)的配體-受體對(duì)(圖2C)，并觀察到SCLC-N與SCLC-A相比，在癌細(xì)胞之間潛在的同型相互作用中顯著富集。雖然在這樣的分析中，人們不能確定任何一個(gè)假設(shè)的配體-受體相互作用，但亞型之間相互作用數(shù)量的差異是驚人的，可能反映了亞型之間相互作用的差異。這種富集與SCLC-A細(xì)胞株的典型生長(zhǎng)方式是松散的浮動(dòng)聚集物和SCLC-N細(xì)胞株生長(zhǎng)方式是一致的。
SCLC的轉(zhuǎn)錄組多樣性與患者一致的不良預(yù)后形成對(duì)比。研究人員分析了多個(gè)患者的表型，以確定是否有共享的細(xì)胞類(lèi)型可以解釋SCLC的普遍侵襲性。SCLC惡性細(xì)胞的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析確定了25個(gè)集群。大多數(shù)簇狀圖對(duì)單個(gè)腫瘤都是特異性的，但22簇狀圖在樣本中顯著地反復(fù)出現(xiàn)(圖3A-3C和S3A)，涵蓋了一系列治療病史、組織部位和主要亞型(圖 3D)。簇22由166個(gè)細(xì)胞組成，21個(gè)腫瘤中有9個(gè)至少占簇的3%。研究人員證實(shí)復(fù)發(fā)簇中的細(xì)胞比正常上皮細(xì)胞有更大的CNV負(fù)擔(dān)，與惡性表型一致(圖S3B)。
復(fù)發(fā)集群的細(xì)胞在亞型分配中明顯高于其他集群的細(xì)胞，并且提示為去分化表型(圖3A)。這些細(xì)胞富含與轉(zhuǎn)移細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)的基因和基因程序(圖3E和3F)。在Cancer cell Line Encyclopedia數(shù)據(jù)庫(kù)中SCLC-A和SCLC-N細(xì)胞株的微陣列數(shù)據(jù)(N = 54)中，研究人員證實(shí)復(fù)發(fā)性群集的基因特征與許多與轉(zhuǎn)移、趨化和干性相關(guān)的相同通路顯著正相關(guān)(圖S3C)。
在聚類(lèi)22中，磷脂酶C gamma 2 (PLCG2)是最高差異上調(diào)基因(圖3F和S3D)。PLCG2此前被認(rèn)為與阿爾茲海默病有關(guān)及其類(lèi)似物PLCG1促進(jìn)轉(zhuǎn)移。研究人員使用了knnDREMI，它非常適合處理數(shù)據(jù)稀疏性和罕見(jiàn)細(xì)胞種群，來(lái)探索與PLCG2共變的全基因程序。研究人員將knnDREMI的結(jié)果分為三個(gè)基因模塊，分別對(duì)應(yīng)于PLCG2低表達(dá)(模塊1)、中表達(dá)(模塊2)和高表達(dá)(模塊3)(圖S3E)。模塊3中的候選基因包括FGFR1(通過(guò)頻繁擴(kuò)增與SCLC有關(guān))和MTRNR2L8和MTRNR2L12(顯示了人蛋白家族基因)抑制細(xì)胞凋亡，在阿爾茨海默病中具有神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)三陰性乳腺癌(TNBC)中的腫瘤進(jìn)展。在與模塊3相關(guān)的前5%的通路中，是那些與干細(xì)胞特性(包括OCT4和SOX2靶點(diǎn))、轉(zhuǎn)移性基因標(biāo)記和前轉(zhuǎn)移性信號(hào)通路(包括Wnt和BMP信號(hào))相關(guān)的通路(圖S3E和S3F)。
在復(fù)發(fā)性SCLC群集中的多個(gè)卵形表達(dá)基因中(圖3F)，研究人員開(kāi)始研究PLCG2作為進(jìn)展的潛在驅(qū)動(dòng)因素的作用。與復(fù)發(fā)集群的轉(zhuǎn)移前表型相一致，與肺相比，PLCG2在轉(zhuǎn)移部位顯著上調(diào)，在SCLC轉(zhuǎn)移最常見(jiàn)的部位肝臟中水平最高(圖3G)。這些觀察結(jié)果促使研究人員通過(guò)在PLCG2表達(dá)相對(duì)較低的SCLC細(xì)胞株，并通過(guò)敲除PLCG2高的SCLC細(xì)胞系。外源性PLCG2過(guò)表達(dá)不影響增殖(數(shù)據(jù)未顯示)，但增加了錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)(圖S3G)。此外，PLCG2表達(dá)與體外更高的遷移和侵襲相關(guān)(圖4A)，并與心內(nèi)注射后更高的體內(nèi)轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)(圖4B和4C)，這與復(fù)發(fā)集群的轉(zhuǎn)移前表達(dá)譜一致。Western blot分析驗(yàn)證了單細(xì)胞數(shù)據(jù)中觀察到的關(guān)鍵表型，包括(1)b-catenin表達(dá)增加，表明Wnt信號(hào)通路更高，這在Wnt報(bào)告基因檢測(cè)中得到了證實(shí)(圖S3H);(2) SMAD1/5磷酸化水平升高，與BMP信號(hào)通路升高一致;(3) EMT/轉(zhuǎn)移標(biāo)志物表達(dá)增加；(4)莖干相關(guān)標(biāo)志物水平升高(圖4D)。這些結(jié)果表明，PLCG2可能部分驅(qū)動(dòng)復(fù)發(fā)簇中的莖樣、前轉(zhuǎn)移表型。
為了確定PLCG2表達(dá)的臨床意義，研究人員在組織微陣列(TMA)上進(jìn)行了MIBI成像，代表了一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的SCLC腫瘤標(biāo)本(N = 37)。研究人員優(yōu)化了細(xì)胞類(lèi)型特異性抗體，結(jié)合細(xì)胞核密度估計(jì)來(lái)識(shí)別SCLC、免疫和基質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型(圖S4A)，這與病理學(xué)家對(duì)鄰近TMA切片的免疫組化檢查(數(shù)據(jù)未顯示)一致。使用單克隆PLCG2抗體，研究人員鑒定了一個(gè)患者腫瘤的子集，該腫瘤的腫瘤細(xì)胞表達(dá)PLCG2的比例很高，如患者M(jìn)IBI 1所示(圖4E和4F)。只考慮曾經(jīng)廣泛分期的腫瘤(無(wú)論是在最初診斷時(shí)還是復(fù)發(fā)時(shí);N = 27個(gè)通過(guò)質(zhì)量控制)，研究人員發(fā)現(xiàn)表達(dá)PLCG2的癌細(xì)胞的存在與總生存率呈負(fù)相關(guān)(圖 4G)。
Kaplan-Meier分析顯示，PLCG2高表達(dá)的腫瘤患者的總生存期較差(7%的SCLC細(xì)胞具有高PLCG2強(qiáng)度;圖4 H)。經(jīng)調(diào)整的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型證實(shí)總生存期降低，并進(jìn)一步表明，PLCG2高陽(yáng)性比治療史、轉(zhuǎn)移性疾病存在或SCLC亞型更能預(yù)測(cè)預(yù)后差(圖S4B)。同樣的模型，使用PLCG2陽(yáng)性SCLC細(xì)胞的比例作為連續(xù)協(xié)變量而不是二分協(xié)變量，也具有顯著的預(yù)測(cè)性，表明該分析不依賴(lài)于選擇PLCG2陽(yáng)性SCLC細(xì)胞的閾值。
PLCG2過(guò)表達(dá)只是復(fù)發(fā)性群集表型的一個(gè)特征。研究人員還評(píng)估了該亞人群的患病率是否具有預(yù)后意義，并發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)群集細(xì)胞的部分代表(每個(gè)腫瘤中所有癌細(xì)胞的對(duì)數(shù)部分)與總生存率呈負(fù)相關(guān)(圖4)。該亞群占總癌細(xì)胞的0.75%的患者與其他患者相比，總生存率顯著降低(圖 4J)。經(jīng)調(diào)整的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型證實(shí)，在MIBI分析中，與PLCG2陽(yáng)性相比，總體生存率更低，風(fēng)險(xiǎn)比更大;PLCG2陽(yáng)性是一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子(圖S4C)。研究人員使用復(fù)發(fā)性聚類(lèi)分?jǐn)?shù)作為連續(xù)協(xié)變量重復(fù)了這個(gè)分析，并證實(shí)了顯著差的生存率。綜上所述，這些數(shù)據(jù)支持一個(gè)小型莖樣、高PLCG2表達(dá)的前轉(zhuǎn)移亞群對(duì)SCLC各亞型有顯著的預(yù)后影響。
SCLC被認(rèn)為是一種特別的免疫冷性癌癥，而在標(biāo)準(zhǔn)化療中添加免疫檢查點(diǎn)封鎖只略微提高了中位生存期。然而，最近的研究結(jié)果表明，免疫原性中存在一些亞型依賴(lài)的異質(zhì)性，包括非炎癥SCLC亞型。了解亞型在形成免疫環(huán)境中的作用將是制定有效干預(yù)措施的關(guān)鍵。
研究人員的目的是評(píng)估SCLC亞型對(duì)免疫微環(huán)境的影響。研究人員的scRNA-seq數(shù)據(jù)集不能用于評(píng)估總免疫細(xì)胞豐度，因?yàn)檠芯咳藛T富集了非免疫細(xì)胞(CD45)。相反，研究人員分析了來(lái)自該隊(duì)列的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)，以及一個(gè)獨(dú)立的SCLC隊(duì)列(N = 11)。針對(duì)SCLC-A和SCLC-N，研究人員證實(shí)CD45+細(xì)胞比LUAD更少，并發(fā)現(xiàn)SCLC-N-和neurod1陽(yáng)性腫瘤進(jìn)一步減少(圖S4D和S4E)，這與之前的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)一致，表明neurod1陽(yáng)性腫瘤表達(dá)較低水平的免疫相關(guān)基因。
接下來(lái)，研究人員試圖通過(guò)MIBI對(duì)一個(gè)獨(dú)立隊(duì)列進(jìn)行NEUROD1染色，來(lái)描述免疫微環(huán)境的空間結(jié)構(gòu)(N = 33)。根據(jù)先前對(duì)免疫熱腫瘤的定義，在800 - 3 - 800毫米視場(chǎng)(FoV)中含有250個(gè)免疫細(xì)胞，研究人員發(fā)現(xiàn)該隊(duì)列中大多數(shù)SCLC腫瘤(33例中有20例)是免疫冷腫瘤。此外，明顯更多的NEUROD1+ SCLC腫瘤是免疫冷(圖5A、5B和S4F)。為了解釋可能的混雜因素，研究人員將免疫浸潤(rùn)(熱vs冷)建模為logistic回歸模型，納入臨床協(xié)變量，包括NEUROD1陽(yáng)性、組織學(xué)(單一vs混合腺癌)、治療(已治療vs未治療)和位置(原發(fā)vs轉(zhuǎn)移)。回歸模型發(fā)現(xiàn)，腫瘤位置分離了免疫浸潤(rùn)的預(yù)測(cè)，所有5個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤和28個(gè)原發(fā)性腫瘤中的15個(gè)代表免疫冷性腫瘤。在調(diào)整了包括腫瘤位置在內(nèi)的所有臨床協(xié)變量后，只有NEUROD1陽(yáng)性是免疫冷狀態(tài)的顯著預(yù)測(cè)因子(圖S4G)。
為了進(jìn)一步了解SCLC中免疫相互作用的程度，研究人員量化了免疫熱腫瘤(250個(gè)免疫細(xì)胞/FoV)中免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的區(qū)隔化程度。將免疫-腫瘤混合評(píng)分定義為免疫-癌癥細(xì)胞相互作用與免疫-基質(zhì)細(xì)胞相互作用的比例(將基質(zhì)定義為所有非癌癥細(xì)胞)，其中比例越大，混合程度越高。為了對(duì)這個(gè)度量進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，研究人員利用了已發(fā)布的TNBC數(shù)據(jù)集，因?yàn)長(zhǎng)UAD中沒(méi)有MIBI比較器可用。發(fā)現(xiàn)免疫熱性SCLC腫瘤(N = 13)中免疫-腫瘤混合評(píng)分的分布顯著低于免疫熱性TNBC腫瘤(N = 34) (圖5A、5C和S4F)?？傊?，研究人員發(fā)現(xiàn):(1)SCLC特別是SCLC-N亞型的免疫浸潤(rùn)降低，(2)含有更多免疫細(xì)胞的SCLC病例的免疫隔離。
接下來(lái)，研究人員想在單細(xì)胞水平上評(píng)估SCLC TME免疫亞群的差異。為此，研究人員使用來(lái)自L(fǎng)UAD (N = 45,535個(gè)細(xì)胞)和正常相鄰肺(N = 10,934個(gè)細(xì)胞)的免疫細(xì)胞作為參考，匯集了研究人員隊(duì)列中21個(gè)SCLC樣本(N = 16,475個(gè)細(xì)胞)的免疫細(xì)胞(圖S5A)。研究人員分別分析了骨髓細(xì)胞和T細(xì)胞室，以便于細(xì)胞類(lèi)型注釋(圖5D, S5A, S6C,S6F, S7C;)。研究人員的隊(duì)列在治療史方面很平衡(7例未經(jīng)治療，6例接受化療，8例接受化療和免疫治療)(圖S1A)。為了評(píng)估SCLC亞型如何影響T細(xì)胞表型，研究人員應(yīng)用了非負(fù)矩陣因子分解，它擅長(zhǎng)于不確定聚類(lèi)邊界的連續(xù)表型設(shè)置，并識(shí)別了30個(gè)有助于細(xì)胞類(lèi)型注釋的因子(圖S6A和S6B)。在這些因子中，有7個(gè)與T細(xì)胞表型相對(duì)應(yīng):CD4+調(diào)節(jié)性、CD4+常規(guī)性、CD8+竭性、CD8+記憶性、CD8+效應(yīng)器和CD8+ gamma delta T細(xì)胞(圖S6C)。一種并行的基于聚類(lèi)的表型方法證實(shí)了離散T細(xì)胞表型的注釋(圖S6D S6F;星方法)。為了評(píng)估T細(xì)胞表型是否因亞型而豐富，研究人員比較了SCLC-A和SCLC-N之間的因子負(fù)荷，同時(shí)調(diào)整了治療和組織。與SCLC-A相比，SCLC-N表現(xiàn)出顯著升高的Treg因子4和CD8+衰竭因子7，以及顯著降低的CD8+效應(yīng)樣因子28和Tgd因子29(圖S6G)。在多種情況下，CD8+效應(yīng)細(xì)胞與Treg細(xì)胞的低比值與癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)。在SCLC-N中，CD8+效應(yīng)體與Treg因子負(fù)荷的比值顯著低于SCLC-A (圖5E)，并且對(duì)多個(gè)因素具有魯棒性(圖S6H)。這種免疫抑制的測(cè)量與平行的基于集群的CD8+效應(yīng)器/Treg比值一致(圖S6I)。研究人員試圖通過(guò)對(duì)獨(dú)立SCLC隊(duì)列(N = 35例通過(guò)質(zhì)量控制)的成像來(lái)驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)?？紤]到SCLC中相對(duì)較低的T細(xì)胞代表性(MIBI- tof估計(jì)，樣本中平均1.7%的細(xì)胞SD為4.2%)，研究人員選擇使用Vectra而不是MIBI成像來(lái)評(píng)估T細(xì)胞豐度，因?yàn)閂ectra(1)有大得多的FoV，(2)對(duì)FOXP3染色更敏感，(3)獲得更多通過(guò)質(zhì)量控制的未經(jīng)治療的腫瘤。作為SCLC亞型的代理，研究人員根據(jù)免疫組化中NEUROD1的陽(yáng)性來(lái)劃分樣本，因?yàn)樵谶@個(gè)隊(duì)列中幾乎沒(méi)有任何ascl1樣本。研究人員發(fā)現(xiàn)，在NEUROD1+樣本中，CD8+ T細(xì)胞與treg細(xì)胞的比例同樣降低(圖5F和5G)。研究人員的發(fā)現(xiàn)確定了SCLC-A和SCLC-N T細(xì)胞群體的組成差異，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞的相對(duì)消耗和SCLC-N中treg細(xì)胞的增加。
為了檢測(cè)髓系間室，研究人員在scna -seq數(shù)據(jù)集(N = 2,951個(gè)細(xì)胞)中重新聚集了SCLC樣本的細(xì)胞，導(dǎo)致7個(gè)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(Mono/M4)， 4個(gè)中性粒細(xì)胞和2個(gè)樹(shù)突狀簇(圖6A;圖S7A和S7B，繪制了SCLC、LUAD和正常肺髓系數(shù)據(jù)集)。SCLC髓系簇1、7、9和12代表THBS1+ VCAN+ Mono/M4細(xì)胞過(guò)表達(dá)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相關(guān)基因的一個(gè)子集，包括VCAN、FCN1、S100A4、S100A6、S100A8和S100A9(圖6A和S7C)。這種表型類(lèi)似于小鼠單核細(xì)胞骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)和人肝癌中MDSCs樣m4表達(dá)THBS1+ S100蛋白。
考慮到1、7、9和12簇屬于已知分泌ecm相關(guān)蛋白的Mono/M4子集，研究人員將其與特發(fā)性肺纖維化(IPF)中的髓系人群進(jìn)行了比較。簇1和簇7與之前定義的IPF相關(guān)的巨噬細(xì)胞群體非常相似(圖6B)。聚類(lèi)1在IPF內(nèi)的前纖維化巨噬細(xì)胞標(biāo)記得分最高，聚類(lèi)7在IPF內(nèi)的單核細(xì)胞標(biāo)記得分最高(圖6C和6D)。
SCLC的無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)的合并粒細(xì)胞,和正常的肺確定單個(gè)集群(結(jié)合集群6),它是由Mono / M4 SCLC集群1和7 (N = 514細(xì)胞從14 SCLC樣本)和從LUAD樣本(N = 467細(xì)胞6 LUAD樣品),但沒(méi)有來(lái)自正常肺(圖S7A和S7B)。研究人員發(fā)現(xiàn)在原發(fā)和轉(zhuǎn)移性SCLC樣本中，所有Mono/M4細(xì)胞中聯(lián)合簇6細(xì)胞的比例明顯高于原發(fā)LUAD，而這些細(xì)胞在正常肺和轉(zhuǎn)移性L(fǎng)UAD中未被檢測(cè)到(圖6E)。SCLC中的富集在未經(jīng)處理的樣品中更為顯著。與原發(fā)SCLC相比，轉(zhuǎn)移性SCLC中合并的簇6細(xì)胞也富集，但不顯著。
研究人員試圖描述SCLC Mono/M4簇1的轉(zhuǎn)錄譜，類(lèi)似于促纖維化ipf相關(guān)巨噬細(xì)胞。差異分析(圖S7D)將聚類(lèi)1確定為CD14+ CD16+ (FCGR3A) CD81+ ITGAX+ CSF1R+亞群，該亞群分泌參與ECM沉積和重塑的特異性前纖維化、前轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子，包括纖維連接蛋白1 (FN1)， cathepins (CTSB and CTSD)和osteopontin (SPP1)。此外，聚類(lèi)1上調(diào)了與免疫抑制相關(guān)的基因，包括(1)SPP1，涉及結(jié)腸癌和NSCLC中的T細(xì)胞抑制和腫瘤免疫逃避;(2) CD74，涉及轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的免疫抑制和遷移抑制因子誘導(dǎo)的肺部炎癥;(3) VSIG4，涉及巨噬細(xì)胞抑制?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)表明，聚類(lèi)1是一個(gè)具有促纖維化和免疫抑制Mono/M4表型的亞群，在SCLC中選擇性增加。需要進(jìn)一步的功能分析來(lái)評(píng)估該人群是否有助于SCLC的腫瘤發(fā)生或轉(zhuǎn)移。
復(fù)發(fā)性plcg2高SCLC人群與促纖維化、免疫抑制的Mono/M4亞群和CD8+ T細(xì)胞衰竭有關(guān)
研究人員假設(shè)，促纖維化、免疫抑制的Mono/M4細(xì)胞亞群可能與特定的腫瘤亞群相互作用，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。我們發(fā)現(xiàn)SCLC-A與Mono/M4簇2和12顯著相關(guān)，而SCLC-N與簇1和9顯著相關(guān)(圖7)。我們?cè)儐?wèn)這些髓系簇是否與SCLC-N相關(guān)的癌癥表型相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)與ipf相關(guān)的Mono/M4(圖6C)最相似的簇1、7和9與SCLC細(xì)胞中的EMT顯著相關(guān)(圖7A)。除了典型SCLC亞型，我們檢測(cè)了與復(fù)發(fā)性plcg2高SCLC亞群的相關(guān)性，并發(fā)現(xiàn)與Mono/M4 1和7簇顯著相關(guān)(圖7A)。另外，我們發(fā)現(xiàn)Mono/M4聚類(lèi)1在具有復(fù)發(fā)SCLC聚類(lèi)的樣本中富集，并且這種富集對(duì)抽樣具有魯棒性(圖S7E和S7F)。我們還證實(shí)，在獨(dú)立的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中，促纖維化的Mono/M4群體與PLCG2和EMT基因簽名顯著相關(guān)(N = 81;圖S7G)。
研究人員還評(píng)估了SCLC表型是否與非髓系免疫亞群相關(guān)。值得注意的是，PLCG2-高亞群是SCLC表型中唯一與耗盡的CD8+ T細(xì)胞顯著相關(guān)的(圖7B)。在發(fā)表的大量RNA-seq數(shù)據(jù)集中，我們證實(shí)CD8+ T細(xì)胞衰竭與促纖維化的Mono/M4和PLCG2之間存在顯著相關(guān)性(N = 81;圖S7G)。
最后，研究人員利用MIBI-TOF在一個(gè)獨(dú)立的SCLC腫瘤隊(duì)列中驗(yàn)證PLCG2陽(yáng)性SCLC細(xì)胞與促纖維化Mono/M4細(xì)胞群的相關(guān)性(N = 37)。使用CD14、CD16和CD81標(biāo)記物特異性結(jié)合，將推測(cè)為纖維化的Mono/M4細(xì)胞與其他髓系細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，發(fā)現(xiàn)在一些患者中，PLCG2陽(yáng)性的SCLC細(xì)胞與這一人群共存。例如，在MIBI 12患者中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)帶有PLCG2陽(yáng)性的NEUROD1+ SCLC細(xì)胞亞群與促纖維化Mono/M4細(xì)胞群相鄰(圖7C和7D)。在MIBI 3患者中，發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的NEUROD1+ SCLC細(xì)胞與PLCG2陽(yáng)性和促纖維化Mono/M4的聯(lián)系(圖S7H和S7I)。MIBI-TOF隊(duì)列,我們發(fā)現(xiàn)髓細(xì)胞CD14 + CD16 +研究+的分?jǐn)?shù)更好的分?jǐn)?shù)與PLCG2 + SCLC比所有其他腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞類(lèi)型和狀態(tài)(圖7E和7F)?？傊芯拷Y(jié)果表明，這種復(fù)發(fā)性SCLC亞群可能存在于以CD8+ T細(xì)胞衰竭為特征的免疫抑制TME和可能與EMT相關(guān)的促纖維化、免疫抑制的Mono/M4人群中。
文章小結(jié)：
到這里文章就結(jié)束了，在小細(xì)胞肺癌已有的分子分型前提下，發(fā)現(xiàn)了一種PLCG2 高的SCLC表型，可以在各個(gè)亞型中復(fù)發(fā)，預(yù)測(cè)總體生存率較差，并在SCLC腫瘤中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)促纖維化、免疫抑制的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞群體，雖然這些結(jié)果證明了PLCG2作為單一預(yù)后標(biāo)志物的效用，在scRNA-seq數(shù)據(jù)中追蹤PLCG2高復(fù)發(fā)亞群的風(fēng)險(xiǎn)比單獨(dú)PLCG2表達(dá)更大，這表明額外的因素決定了復(fù)發(fā)群集的全部表型。盡管復(fù)發(fā)性PLCG2高的SCLC群集構(gòu)成了所研究腫瘤的惡性細(xì)胞的一小部分，但這個(gè)小的亞群與生存有很強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明了其預(yù)后的重要性和單細(xì)胞分析的價(jià)值。從本研究中得出的結(jié)果中，一系列亞型和PLCG2高復(fù)發(fā)人群參與了不同的基因程序來(lái)定義明顯的異質(zhì)性，并促進(jìn)免疫抑制嚴(yán)重的TME的轉(zhuǎn)移。對(duì)設(shè)計(jì)新的靶向治療和免疫治療方法具有潛在的意義。
