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由于缺乏腦成纖維細(xì)胞，很多人認(rèn)為惡性膠質(zhì)瘤中不存在癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）。今天給大家介紹一篇?jiǎng)倓偘l(fā)表在JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION（IF：19.456）的文章，作者通過(guò)12例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的單細(xì)胞RNA測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，確定了CAF和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的相互作用。
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)是一種侵襲性腦癌，預(yù)后差。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中缺乏纖維母細(xì)胞，因此許多人推測(cè)GBM缺乏CAFs，但一些研究已經(jīng)確定了在GBM中表達(dá)CAF標(biāo)記的細(xì)胞。然而，這些研究未能全面描述這些細(xì)胞及其對(duì)GBM及其微環(huán)境的影響。更重要的是，這些研究依賴于細(xì)胞表面標(biāo)記，而沒(méi)有全面的基因表達(dá)譜，這增加了被識(shí)別的細(xì)胞可能是微環(huán)境中的其他細(xì)胞的可能性，例如周細(xì)胞，毛細(xì)血管壁中的細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共享重疊的細(xì)胞表面標(biāo)記。
作者對(duì)GBM患者樣本進(jìn)行了5周的胰蛋白酶化，去除較少的粘附腫瘤細(xì)胞，從而保留對(duì)胰蛋白酶化具有抗性的細(xì)胞，這些細(xì)胞已被證實(shí)為其他癌癥中的CAFs。開(kāi)發(fā)了一種分類器方法(VAMPIRE)，來(lái)對(duì)這些細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行量化，以分類和比較不規(guī)則的細(xì)胞和核形狀。VAMPIRE區(qū)分GBM細(xì)胞和CAFs的準(zhǔn)確度為91%。相比之下，當(dāng)患者GBM樣本在沒(méi)有連續(xù)胰蛋白酶化的情況下進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，GBM細(xì)胞占主導(dǎo)地位，將具有CAF形態(tài)的細(xì)胞群減少到18%（圖1A，B），這說(shuō)明連續(xù)胰蛋白酶化產(chǎn)生了富含CAFs的細(xì)胞群。
Bulk RNA-Seq顯示，GBM中的這些CAFs樣細(xì)胞表現(xiàn)出與乳腺CAFs相似的轉(zhuǎn)錄組特征，但與周細(xì)胞不同，周細(xì)胞的形態(tài)和表面標(biāo)記物表達(dá)與CAFs重疊(圖1C)。將這些CAFs樣細(xì)胞與來(lái)自8種組織的正常成纖維細(xì)胞進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞與真皮成纖維細(xì)胞最相似(圖1C)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)支持了這些細(xì)胞是GBM CAFs的假設(shè)。
為了嚴(yán)格評(píng)估從患者GBM中分離的這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組譜和純度，作者對(duì)其中4385個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-Seq。從GBM分離出的大多數(shù)細(xì)胞中不存在與CAFs具有某種譜系的細(xì)胞表達(dá)的標(biāo)記，包括上皮細(xì)胞標(biāo)記物EPCAM、平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物SMTN和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物PECAM1。
之后，對(duì)這4,385個(gè)連續(xù)胰蛋白酶化細(xì)胞排除了表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記的非CAF基質(zhì)細(xì)胞，將其定義為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞或免疫細(xì)胞。在其余75.2%的細(xì)胞中，穩(wěn)定表達(dá)CAF標(biāo)記物的轉(zhuǎn)錄物，包括ACTA2和COL1A1。然后，根據(jù)5種非CAF標(biāo)記物的缺失及其上述CAF標(biāo)記物的表達(dá)程度，計(jì)算了通過(guò)對(duì)GBM患者進(jìn)行連續(xù)胰蛋白酶化分離得到的單個(gè)細(xì)胞的CAF評(píng)分(圖1D)。CNV分析顯示，在連續(xù)胰蛋白酶化分離的細(xì)胞中，大多數(shù)具有高CAF評(píng)分的細(xì)胞缺乏染色體改變，而一些具有可變CAF評(píng)分的細(xì)胞表現(xiàn)出7號(hào)染色體的增加和10號(hào)染色體的丟失，這是GBM的標(biāo)志(圖1E)。從CAF評(píng)分高的細(xì)胞中篩選這些顯示7號(hào)染色體增加和10號(hào)染色體丟失的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)通過(guò)連續(xù)胰蛋白酶化分離出的患者GBMs細(xì)胞中52%為CAFs，22%為髓系細(xì)胞，20%為惡性細(xì)胞，6%為少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖1F)。
接著作者進(jìn)行了偽時(shí)序分析，揭示了早期CAF群體進(jìn)化為2種CAF亞型，并計(jì)算了從早期到晚期GBM CAFs的不同表達(dá)譜(圖1G，H)。這些發(fā)現(xiàn)與乳腺癌研究一致，表明表達(dá)ACTA2的CAFs代表了癌癥中分化程度更高的CAF亞型。
為了確定是否可以在患者GBMs的scRNA-Seq中識(shí)別CAFs，作者分析了12例患者GBMs的scRNA-Seq結(jié)果。發(fā)現(xiàn)簇的最佳數(shù)量由簇穩(wěn)定性評(píng)分決定，結(jié)果在每個(gè)患者中看到18個(gè)穩(wěn)健的細(xì)胞簇(圖2A)。
UMAP圖顯示腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞緊密分組(圖2A)，CNV分析顯示腫瘤細(xì)胞顯示7號(hào)染色體增加和10號(hào)染色體丟失，腫瘤相關(guān)基質(zhì)細(xì)胞無(wú)染色體畸變(圖2B)。計(jì)算了單個(gè)細(xì)胞的CAF分?jǐn)?shù)，12例患者中的每一例都存在CAFs。值得注意的是，具有高CAF評(píng)分的細(xì)胞簇沒(méi)有表現(xiàn)出CNV(圖2C)。
然后，確定了鑒定的這些CAFs是否具有與胰蛋白酶化分離的scRNA-seq中分離的細(xì)胞相同的早期和完全分化的亞型。從GBMs患者中鑒定為CAFs的細(xì)胞中提取早期與晚期的偽時(shí)間依賴基因，結(jié)果顯示，雖然通過(guò)連續(xù)胰蛋白酶化分離的細(xì)胞含有早期和完全分化的CAF亞型的混合，但GBMs患者大多含有完全分化的CAF亞型(圖2D)。
在GBM的4種惡性細(xì)胞狀態(tài)中，CAFs與間充質(zhì)樣(MES-like)特征在空間上最相關(guān)(圖2E-G)。CAFs與M2促腫瘤巨噬細(xì)胞距離較近，與小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元基因標(biāo)記距離較遠(yuǎn)(圖2G)。CAF也與表達(dá)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSC)標(biāo)記CD44的細(xì)胞非常接近(圖2H)。由于CAF與表達(dá)CD34或CDH5的內(nèi)皮細(xì)胞的接近，從而在GSC所在的血管周圍壁龕中富含。
由于GBM CAFs位于靠近腫瘤啟動(dòng)GSCs的血管周圍生態(tài)位，作者分析了GBM CAFs對(duì)GSCs的影響。從GBM6細(xì)胞中提取含有GSC的神經(jīng)球，并在GBMpt3CAFs (CAF_CM)的條件培養(yǎng)基（CM）中培養(yǎng)72小時(shí)。利用NanoString nCounter平臺(tái)和770基因多重PanCancer progression panel對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組評(píng)估，并與對(duì)照神經(jīng)球介質(zhì)(NM)中的GBM6神經(jīng)球進(jìn)行比較，分析癌基因的表達(dá)。分析顯示，GBM CAF分泌組上調(diào)了癌癥進(jìn)展途徑，包括HIF-1α、EMT和GSCs中的細(xì)胞增殖(圖3A，B)。
然后，作者進(jìn)行了限制性稀釋神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)與NM相比，GBMpt5CAF CM中GBM6衍生的GSC頻率增加，GBMpt5CAF CM在不同稀釋度下也增加了GBM6神經(jīng)球的產(chǎn)量(圖3C，D)。
為了識(shí)別CAF對(duì)GSC影響的介質(zhì)，使用GBM CAFs和GBM6衍生神經(jīng)球的RNA-Seq結(jié)果，通過(guò)將GSC受體的表達(dá)映射到CAF細(xì)胞表達(dá)的同源配體/激動(dòng)劑的表達(dá)，創(chuàng)建了推斷的交叉對(duì)話資源(圖3E)。在從GSC-CAF受體配體分析中鑒定候選基因時(shí)，選擇骨橋蛋白(OPN)及其受體CD44和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)及其受體c-Met。在抗OPN或抗HGF中和抗體的存在下進(jìn)行了神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)。GBMpt5CAF CM增加了GBM6神經(jīng)球的總面積，這說(shuō)明了神經(jīng)球的數(shù)量和大小，抗HGF或抗OPN減輕了這一影響。聯(lián)合抗HGF和抗OPN抗體也減少了GBM6和GBM43球的形成(圖3G)。這些結(jié)果表明，CAFs誘導(dǎo)的神經(jīng)球形成的增加是通過(guò)OPN-CD44和HGFcMET軸介導(dǎo)的。
根據(jù)空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果(圖2,E-H)，假設(shè)GSCs可能將CAFs招募到GBM的血管周圍生態(tài)位。作者評(píng)估了CAFs對(duì)GSC CM的跨基質(zhì)趨化反應(yīng)(圖4A)。發(fā)現(xiàn)GSC CM吸引的GBMpt1CAFs是NM的5倍(圖4B)。相比于它們?cè)贜M中的缺乏生長(zhǎng)，CAFs在GBM43細(xì)胞或GBM6細(xì)胞衍生的GSC CM中生長(zhǎng)得更多(圖4C)。
然后，為了研究這些GSC對(duì)CAFs影響的潛在介質(zhì)。重點(diǎn)研究了PDGF和TGF-β，因?yàn)樗鼈兌汲霈F(xiàn)在GSC CAF配體-受體分析中(圖4D)。TGF-β中和抗體在2.5 ~ 10 μg/mL時(shí)對(duì)侵襲無(wú)抑制作用(圖4E)。就GSC誘導(dǎo)的CAF增殖的介質(zhì)而言，抗PDGFB的中和抗體和抗TGF-β的中和抗體并沒(méi)有改變GBM43 GSC CM誘導(dǎo)的CAF增殖，而聯(lián)合這些抗體可減少GBM43 GSC CM誘導(dǎo)的CAF增殖(圖4F)。
然后，在非莖貼壁的DBTRG-05MG細(xì)胞中添加GBMpt1CAF CM不改變MES基因表達(dá)。通過(guò)形狀因子評(píng)估，GBMpt1CAF CM也沒(méi)有改變形態(tài)，基質(zhì)腔侵入，或增殖的非莖貼壁GBM6細(xì)胞。這些結(jié)果表明，GBM CAFs對(duì)GSCs的原性作用是特異性的。
RNA-Seq分析顯示，纖維連接蛋白(FN;FN1基因) 在GBM CAFs中相對(duì)于周細(xì)胞有差異表達(dá)，由于FN是GBM中最豐富的ECM蛋白，進(jìn)一步分析了CAF FN1的表達(dá)。GBM的FN1表達(dá)高于非腫瘤腦樣本。GBM也比低級(jí)別膠質(zhì)瘤有更高的FN1表達(dá)。定量PCR顯示相對(duì)于TAM和腫瘤細(xì)胞，CAFs中的總FN增加了32倍，EDA剪接變體增加了16倍，這表明EDA是一種比其他CAFs的細(xì)胞表面受體更特異性的GBM CAF生物標(biāo)志物(圖5A)。轉(zhuǎn)錄組分析還顯示，患者GBM中EDA的表達(dá)與MES亞型基因CHI3LI、TIMP1和SPOCD1的聚集表達(dá)呈正相關(guān)，預(yù)后較差(圖5B)。
當(dāng)在培養(yǎng)的HUVECs中進(jìn)行功能檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)將GBMpt4CAF CM添加到?jīng)]有GBM細(xì)胞的培養(yǎng)的HUVECs中，增加了血管生成3個(gè)階段中的前2個(gè)階段，尖端細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)張和小管形成，而不影響第三階段(圖5C，D)。這表明CAFs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有直接的血管生成作用，而不是由GBM細(xì)胞增強(qiáng)。
然后，作者研究了CAFs對(duì)巨噬細(xì)胞的影。與缺乏EDA剪接變體的血漿FN相比，GBMpt2CAF CM和它們產(chǎn)生的FN的EDA剪接變體導(dǎo)致從外周血分離的人單核細(xì)胞衍生的培養(yǎng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生更多的M2極化(圖5E)。同樣，當(dāng)THP-1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，然后在GBMpt2CAF CM中孵育時(shí)，GBMpt2CAF CM比已知的細(xì)胞因子陽(yáng)性對(duì)照更能驅(qū)動(dòng)M2極化(圖5F)。在循環(huán)人單核細(xì)胞來(lái)源的培養(yǎng)巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)的M2極化GBMpt2CAF CM被抗EDA FN受體TLR4的阻斷抗體逆轉(zhuǎn)(圖5G)。
為了評(píng)估不同腫瘤區(qū)域的CAF水平，作者從患者GBMs的不同區(qū)域獲得了定點(diǎn)活檢。沿側(cè)腦室側(cè)壁發(fā)現(xiàn)的大腦中最大的生發(fā)區(qū)，它容納了神經(jīng)干細(xì)胞，當(dāng)腫瘤累及該區(qū)域時(shí)，該區(qū)域會(huì)產(chǎn)生GSCs(圖6A)。腦室下區(qū)（SVZ）樣本的EDA表達(dá)增加了22倍，F(xiàn)N表達(dá)增加了22倍，但相對(duì)于腫瘤核心，EDB表達(dá)僅增加了5倍(圖6B)。免疫熒光也顯示SVZ GBM富集EDA FN(圖6C)。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)α-SMA的細(xì)胞，SVZ GBM也得到富集，4.9%的腫瘤核心細(xì)胞表達(dá)α-SMA，而SVZ GBM細(xì)胞表達(dá)α-SMA的細(xì)胞為13.4%(圖6D)。在未涉及SVZ的GBM患者尸檢的SVZ樣本中未出現(xiàn)EDA染色(圖6E)。
為了確定CAFs對(duì)GSCs的原作用是否也發(fā)生在體內(nèi)，作者將40,000個(gè)GBM6神經(jīng)球細(xì)胞顱內(nèi)植入，并將35,000個(gè)GBM6神經(jīng)球細(xì)胞與5,000個(gè)GBMpt3CAFs混合植入無(wú)胸腺小鼠。在大多數(shù)小鼠中，含有神經(jīng)球的CAFs能夠使腫瘤生長(zhǎng)達(dá)到終點(diǎn)，而沒(méi)有CAFs則不會(huì)發(fā)生這種情況(圖7A)，這說(shuō)明CAFs對(duì)GSCs的促腫瘤作用也發(fā)生在體內(nèi)。事實(shí)上，向35,000個(gè)GBM6神經(jīng)球細(xì)胞中添加5,000個(gè)GBMpt3CAFs，會(huì)導(dǎo)致?lián)碛?5,000個(gè)GBM6神經(jīng)球細(xì)胞的小鼠與擁有100,000個(gè)GBM6神經(jīng)球細(xì)胞且沒(méi)有CAFs的小鼠在同一時(shí)間點(diǎn)到達(dá)終點(diǎn)，這些結(jié)果揭示了CAFs在體內(nèi)對(duì)GSCs促瘤作用的程度。
在終點(diǎn)分析這些腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的GBM CAFs對(duì)微環(huán)境的原作用也發(fā)生在體內(nèi)。通過(guò)NanoString nCounter平臺(tái)對(duì)體內(nèi)與CAFs一起生長(zhǎng)的GBM6神經(jīng)球衍生的腫瘤進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，與在體內(nèi)未生長(zhǎng)CAFs的GBM6神經(jīng)球相比，顯示HIF-1、EMT和細(xì)胞增殖途徑基因上調(diào)(圖7B-D)。腫瘤血管免疫熒光顯示，CAFs導(dǎo)致GBM6神經(jīng)球來(lái)源的腫瘤表現(xiàn)出總血管面積/高倍場(chǎng)(hpf)增加(圖7E，F(xiàn))。此外，流式細(xì)胞術(shù)顯示，CAFs增加了GBM6神經(jīng)球源性腫瘤中CD206+ M2前巨噬細(xì)胞的百分比(圖7G)。
首先，作者量化了9例新診斷的GBMs中非上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞或免疫細(xì)胞，但在scRNA-Seq中至少表達(dá)5種CAF標(biāo)記之一的細(xì)胞的百分比。平均而言，這些腫瘤中12.3%的細(xì)胞缺乏非CAF基質(zhì)標(biāo)記，但至少表達(dá)5種CAF標(biāo)記中的1種?？紤]年齡和性別的多變量Cox回歸顯示，以這種方式確定的生存與CAF水平之間沒(méi)有相關(guān)性。其次，使用TCGA數(shù)據(jù)集發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腫瘤表現(xiàn)出高表達(dá)的ACTA2，以及其他5種CAF標(biāo)記(FAP、PDPN、DES、THY1或S100A4)中的任何一種高表達(dá)時(shí)，新診斷的GBM患者的生存惡化。
在GBM中缺乏CAFs的主要論點(diǎn)是，除了血管中有少量CAFs外，大腦中沒(méi)有成纖維細(xì)胞。然而，由于有證據(jù)表明，其他腫瘤中的CAFs來(lái)自骨髓來(lái)源的前體，CAFs可能存在于GBM中似乎是合理的。事實(shí)上，研究已經(jīng)確定了在GBM中表達(dá)與CAFs相關(guān)標(biāo)記的細(xì)胞。作者首先對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)胰蛋白酶化處理，得到具有CAF形態(tài)和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組譜的細(xì)胞，這些細(xì)胞缺乏拷貝數(shù)變異(CNVs)。在12例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的單細(xì)胞RNA-Seq中鑒定出無(wú)CNVs和高CAF評(píng)分的細(xì)胞。偽時(shí)間重建顯示，未成熟的CAFs演化為亞型，成熟的CAFs表達(dá)ACTA2?？臻g轉(zhuǎn)錄組證實(shí)CAF接近間充質(zhì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞(GSCs)、內(nèi)皮細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞。CAFs被GSCs趨化吸引，CAFs使GSCs富集。通過(guò)將受體的表達(dá)映射到它們的同源配體，確定PDGF和TGF-β是GSC對(duì)CAFs的影響的介質(zhì)，骨橋蛋白和HGF是CAFs誘導(dǎo)的GSC富集的介質(zhì)。CAFs通過(guò)產(chǎn)生結(jié)合巨噬細(xì)胞TLR4的EDA纖維連接蛋白變體來(lái)誘導(dǎo)M2巨噬細(xì)胞極化。
