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3步？純生信？就這也能發(fā)6+？
哈嘍，大家好，今天小編向大家分享一篇發(fā)表在Journal of Cellular Physiology雜志（IF 6.384/Q2）上的純生信文章，為了保持神秘感，小編先不透露這篇文章的主要研究?jī)?nèi)容哈，不過(guò)友情提醒“老”生信人扶好下巴，小心驚掉哦~同時(shí)呢，小編也想和那些沒(méi)有生信基礎(chǔ)，還在觀(guān)望狀態(tài)準(zhǔn)備上手生信分析的小伙伴說(shuō)，get生信分析技能，發(fā)SCI不是夢(mèng)！言歸正傳，上干貨！
背景介紹
自身免疫性肝炎(AIH)是一種以慢性肝臟炎癥、界面性肝炎、血清免疫球蛋白 γ升高和非器官特異性自身抗體產(chǎn)生為特征的免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷性疾病。非特異性免疫抑制是目前的標(biāo)準(zhǔn)治療方法。AIH的一個(gè)顯著特征是肝臟中存在T輔助細(xì)胞1(Th1)產(chǎn)生的干擾素- γ(IFN-γ)。一些研究表明 BALB/c 具有純合 Tgfb1 缺陷的小鼠自發(fā)地迅速發(fā)展為 Th1 介導(dǎo)的 IFN-γ 依賴(lài)性壞死性炎癥性肝病，從而建立了暴發(fā)性 AIH 模型。
研究方法
1.數(shù)據(jù)來(lái)源
GSE9892：GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)
WT：野生型小鼠
Tko：Tgfb1缺失的小鼠
ITko：Tgfb1和Ifng缺失的小鼠
一個(gè)樣本取自一只小鼠，每個(gè)基因型包含三只小鼠。
(小編理解：“ko”為knockout縮寫(xiě)，T為T(mén)gfb1縮寫(xiě)，IT為T(mén)gfb1和Ifng縮寫(xiě))
2.分析流程
1)差異表達(dá)基因的鑒定：GEO2R在線(xiàn)工具，p <0 .05和|倍數(shù)變化|≥1.5被定義為差異表達(dá)基因(DEGs)
2)功能富集分析：使用Cytoscape與插件CluGO(版本2.5.4)
3)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的評(píng)估：CIBERSORT在線(xiàn)網(wǎng)站
結(jié)果展示
Part 1. 哼！誰(shuí)還不會(huì)基因差異表達(dá)分析呢？
圖1a 小提琴圖展示了這9只小鼠所有基因的表達(dá)分布。
圖1b 展示了這三種基因型兩兩比較后篩選出的上調(diào)DEGs和下調(diào)DEGs。
圖1c-e 可視化每組比較的前50個(gè)DEGs。
Part 2. 這？不就是最簡(jiǎn)單的功能富集分析？
小編絞盡腦汁，思前想后，終于get到了作者的思維邏輯：“總-分”
第一個(gè)“總-分”結(jié)構(gòu)
作者通過(guò)三種基因型兩兩比較后篩選出了一堆兒DEGs，生信分析的套路不就是先篩選出一堆兒的差異基因，然后通過(guò)一系列的手段和方法，不斷縮小選擇范圍，從而獲得幾十個(gè)甚至幾個(gè)自己“最中意”的目標(biāo)基因嗎嗎？其中最常用的一種方法就是“取交集—Veen圖”，聰明如小編的作者同樣采取了這種做法~
1.1“總”：三種基因型共同DEGs的功能富集分析
圖2a 展示了三種基因型兩兩比較后獲得的516個(gè)共同DEGs。
圖2b 通過(guò)和弦圖展示了每組比較之間DEGs的相互關(guān)系。
圖2c GO功能富集分析：這些DEGs在生物過(guò)程中顯著富集，包括對(duì)干擾素-γ的響應(yīng)和先天免疫反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)。相互關(guān)系分析表明，生物過(guò)程可分為幾組，其中細(xì)胞對(duì)細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)、免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)和先天免疫反應(yīng)是富集的前三組。
圖2d KEGG信號(hào)通路富集分析：白細(xì)胞介素-1信號(hào)，免疫應(yīng)答蛋白的磺?；?，通過(guò)ZBP1的放射免疫沉淀介導(dǎo)的核因子κB活化是最顯著富集的途徑之一，相關(guān)性分析顯示CD3和TCR zeta鏈的磷酸化、免疫系統(tǒng)、磷脂在吞噬作用中的作用、白細(xì)胞介素信號(hào)、葡萄糖代謝、與趨化因子受體結(jié)合的趨化因子是顯著富集的途徑。
1.2“分”：與WT組相比，Tko組DEGs的功能富集分析
圖3a Tko組中表達(dá)上調(diào)(2451個(gè))和表達(dá)下調(diào)(2894個(gè))的DEGs。
圖3b 上調(diào)基因的GO功能富集分析：刺激反應(yīng)的正調(diào)控、白細(xì)胞活化、免疫系統(tǒng)過(guò)程的（正)調(diào)控、定位調(diào)節(jié)和先天性免疫反應(yīng)是最豐富的生物過(guò)程。
圖3c 下調(diào)基因的GO功能富集分析：富集的生物過(guò)程主要分為代謝過(guò)程，包括有機(jī)酸代謝過(guò)程、脂質(zhì)代謝過(guò)程和輔助因子代謝過(guò)程。
圖3d 上調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析：PD-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、Toll樣受體級(jí)聯(lián)、免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、干擾素-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)/轉(zhuǎn)錄是分類(lèi)最多的通路。
圖3e 下調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析：大多富集在細(xì)胞周期、免疫系統(tǒng)、脂類(lèi)/甾體代謝和生物氧化等途徑。
1.3“分”：與WT組相比，ITko組DEGs的功能富集分析
圖4a ITko組中表達(dá)上調(diào)(2744個(gè))和表達(dá)下調(diào)(1929個(gè))的DEGs。
圖4b 上調(diào)基因的GO功能富集分析：T細(xì)胞活化、細(xì)胞過(guò)程的正向調(diào)控、白細(xì)胞活化/遷移、細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控、免疫系統(tǒng)過(guò)程的調(diào)控歸為最重要的生物過(guò)程。
圖4c 下調(diào)基因的GO功能富集分析：富集的生物過(guò)程主要分為代謝過(guò)程，包括有機(jī)酸代謝過(guò)程、脂質(zhì)代謝過(guò)程和輔助因子代謝過(guò)程。
圖4d 上調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析：大多富集在Rho GTP酶信號(hào)傳遞、免疫系統(tǒng)、Fc-γ受體依賴(lài)的吞噬作用和免疫系統(tǒng)中細(xì)胞因子信號(hào)傳遞等通路中。
圖4e 下調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析：在脂質(zhì)/甾體/氨基酸的代謝、化合物的一期功能化、生物氧化劑和免疫系統(tǒng)等途徑中顯著富集。
第二個(gè)“總-分”結(jié)構(gòu)
一頓操作猛如虎，細(xì)心的讀者就能發(fā)現(xiàn)，分析了那么多，卻還沒(méi)有真正進(jìn)入正題，那正題是啥呢？不就是“自身免疫性肝炎--AIH”嘛！所以接下來(lái)自然而然的就要圍繞主題開(kāi)展分析了，果不其然，第二個(gè)“總-分”結(jié)構(gòu)踏著輕盈的步伐朝我們走來(lái)了~
2.1“總”：與AIH緩解相關(guān)DEGs的功能富集分析
圖5a 與AIH 緩解相關(guān)的下調(diào)DEGs：Tko vs WT獲得2451個(gè)上調(diào)基因，ITko vs Tko獲得1004個(gè)下調(diào)基因，取交集得472個(gè)共同DEGs。
圖5b 與AIH 緩解相關(guān)的上調(diào)DEGs：Tko vs WT獲得2624個(gè)下調(diào)基因，ITko vs Tko獲得1911個(gè)上調(diào)基因，取交集得586個(gè)共同DEGs。
圖5c 上調(diào)基因的GO功能富集分析：這些基因在免疫反應(yīng)調(diào)控方面顯著富集，可分為對(duì)其他機(jī)體的反應(yīng)、防御反應(yīng)的調(diào)控、免疫系統(tǒng)過(guò)程/免疫反應(yīng)的調(diào)控和對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)/調(diào)控等。
圖5d上調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析：這些基因主要富集在免疫系統(tǒng)通路中，顯著富集的組別包括干擾素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、IFN刺激基因的抗病毒機(jī)制、(適應(yīng)性)免疫系統(tǒng)和葡萄糖代謝。
圖5e 下調(diào)基因的GO功能富集分析：細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、管發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育最顯著富集
圖5f 下調(diào)基因的KEGG信號(hào)通路富集分析：細(xì)胞外基質(zhì)組織、含TSR域蛋白的O-糖基化和跨化學(xué)突觸的傳遞是富集度最高的途徑。
2.2“分”：Tko小鼠和ITko小鼠特異性上調(diào)基因分析
圖6a Tko小鼠和ITko小鼠特異性上調(diào)DEGs：Tko vs WT獲得1141個(gè)上調(diào)基因，ITko vs WT獲得1434個(gè)上調(diào)基因。
圖6b Tko小鼠上調(diào)DEGs的GO功能富集分析：顯著富集在對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)、解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生、防御反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程的調(diào)控和多細(xì)胞機(jī)體過(guò)程的調(diào)控等。
圖6c Tko小鼠上調(diào)DEGs的KEGG信號(hào)通路富集分析：總富集的通路主要可以歸納為免疫系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、白細(xì)胞介素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、止血、趨化因子受體結(jié)合趨化因子。
圖6d ITko小鼠上調(diào)DEGs的GO功能富集分析：這些基因大多參與的途徑主要可歸納為（有絲分裂）細(xì)胞周期過(guò)程、有絲分裂核分裂的負(fù)調(diào)控、（微管）細(xì)胞骨架組織、蛋白質(zhì)定位到染色體、DNA復(fù)制獨(dú)立的核小體組裝。
圖6e ITko小鼠上調(diào)DEGs的KEGG信號(hào)通路富集分析：基因顯著富集在包括細(xì)胞周期、有絲分裂前分裂、核包膜分解、驅(qū)動(dòng)蛋白和Emi 1的磷酸化等通路組中。
2.3“分”：Tko小鼠和ITko小鼠特異性下調(diào)基因分析
圖7a Tko小鼠和ITko小鼠特異性下調(diào)DEGs：Tko vs WT獲得1713個(gè)下調(diào)基因，ITko vs WT獲得748個(gè)下調(diào)基因。
圖7b ITko小鼠下調(diào)DEGs的GO功能富集分析：大多富集在多細(xì)胞生物體發(fā)育、細(xì)胞通信調(diào)節(jié)、細(xì)胞大分子代謝過(guò)程和突觸組織等。
圖7c ITko小鼠下調(diào)DEGs的KEGG信號(hào)通路富集分析：這些基因在免疫系統(tǒng)、GPCR信號(hào)傳遞、線(xiàn)粒體翻譯終止、磷酸肌苷-3激活的AKT信號(hào)傳遞和細(xì)胞對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)等通路組中顯著富集。
圖7d Tko小鼠下調(diào)DEGs的GO功能富集分析：這些基因顯著富集在有機(jī)酸/羧酸/脂質(zhì)代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)化學(xué)刺激的反應(yīng)以及參與與共生體相互作用的宿主細(xì)胞的自噬。
圖7e Tko小鼠下調(diào)DEGs的KEGG信號(hào)通路富集分析：總富集通路主要可分為氨基酸及衍生物代謝、Toll樣受體級(jí)聯(lián)、鉬輔基生物合成、COPII介導(dǎo)的囊泡運(yùn)輸和糖胺聚糖代謝等。
Part 3. 嗐！最終還是避免不了蹭熱點(diǎn)：免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析
看了前兩部分的分析，你是不是和小編一樣心中充滿(mǎn)大寫(xiě)的不服氣，就這？也能發(fā)6+？說(shuō)來(lái)說(shuō)去，看似分析了很多內(nèi)容，其實(shí)不就是選擇不同的對(duì)照組，重復(fù)的進(jìn)行差異表達(dá)基因(DEGs)和GO/KEGG富集分析嗎？技術(shù)含量趨近0。不過(guò)，在文章的末尾，終于看到了已經(jīng)不算是熱點(diǎn)的“熱點(diǎn)”了[笑哭]。
我們姑且信了作者所說(shuō)的，為了深入了解不同條件下免疫細(xì)胞的組成，才進(jìn)行了免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析，用到的還是在線(xiàn)的CIBERSORT分析工具[笑哭]。
免疫細(xì)胞豐度如圖8a所示，Tko組的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞增加，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和B細(xì)胞顯著減少。與Tko組相比，ITko組巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞減少，T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞增加。又如圖8b所示，CD4 T細(xì)胞是T細(xì)胞的主要類(lèi)型。盡管有些變化并不顯著，但觀(guān)察到CD4 T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞的免疫狀態(tài)從幼稚轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃浀内厔?shì)（圖8c）。此外，還觀(guān)察到輔助性T細(xì)胞的亞群轉(zhuǎn)移和巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)移（圖8d）。
結(jié)語(yǔ)
至此，全文結(jié)束。額…說(shuō)實(shí)話(huà)，小編在完整閱讀這篇文獻(xiàn)之前，還想著6+的純生信，純生信哎！沒(méi)有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，總得有新奇的分析思路或者復(fù)雜的分析方法吧？讀完以后才發(fā)覺(jué)，也不過(guò)爾爾哈哈哈哈！所以說(shuō)呢，咱們生信人就要有生信人的樣子，不怕沒(méi)思路，不怕技術(shù)不到家，只要有想法，就要去嘗試，哪怕只是掌握了最簡(jiǎn)單的分析方法，努力去做，發(fā)SCI還不是信手拈來(lái)的事情？
調(diào)侃歸調(diào)侃哈哈，作者利用這么簡(jiǎn)單的分析方法就能夠發(fā)IF 6+的SCI 論文，還是有其值得學(xué)習(xí)的地方的，我們正常情況下都會(huì)選擇人類(lèi)來(lái)源的數(shù)據(jù)，而作者獨(dú)辟蹊徑，選擇AIH小鼠模型的微陣列數(shù)據(jù)，這也為我們以后的數(shù)據(jù)選擇提供了參考。其次，其研究在某些程度上也是具有重要意義的，作者全面揭示了該疾病所涉及的潛在生物學(xué)過(guò)程。發(fā)現(xiàn)AIH的發(fā)展與顯著增加的免疫反應(yīng)和急劇抑制的代謝過(guò)程有關(guān)。通過(guò)估計(jì)免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，發(fā)現(xiàn)了幾種類(lèi)型的免疫細(xì)胞的失調(diào)，為理解AIH的發(fā)展提供了一個(gè)新的視角，這將有利于制定針對(duì)該病的有效治療策略。
參考文獻(xiàn):Yu K, Yang J, Xie W, Wu F, Wang M, Li N. Integrated bioinformatic analysis revealed biological processes and immune cells implicated in autoimmune hepatitis. J Cell Physiol. 2021 Jul;236(7):5411-5420. doi: 10.1002/jcp.30246. Epub 2021 Feb 17. PMID: 33595095.
