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癌癥已經(jīng)成為威脅人類生命健康的關(guān)鍵因素，探尋治療癌癥的腳步從未停止。近些年，免疫治療已成為癌癥治療研究的新熱點(diǎn)，生信人在各大平臺(tái)上推出了很多相關(guān)報(bào)道。然而，以往大多數(shù)研究都是以T細(xì)胞作為預(yù)測(cè)PD1/PD-L1的標(biāo)志物，今天給大家分享一篇2022年3月14日發(fā)表在Cancer Cell（IF:31.743）上，利用腫瘤內(nèi)漿細(xì)胞預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌中PD-L1阻斷劑治療療效的文章。接下來讓我們一起看看如何使用漿細(xì)胞預(yù)測(cè)治療療效以及預(yù)測(cè)效能是怎樣的呢？
Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer
瘤內(nèi)漿細(xì)胞預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌中PD-L1阻斷劑的治療療效
一．研究背景
肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。80%至85%的肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）亞型。NSCLC的PD1/PD-L1阻斷具有比較良好和持久的療效，可顯著提高患者生存率。然而，大多數(shù)NSCLC患者對(duì)PD1/PD-L1阻斷的單一藥物治療沒有反應(yīng)。阿替唑珠單抗（Atezolizumab）是一種針對(duì)PD-L1的單克隆抗體，可破壞PD-L1:PD-1和PD-L1:B7-1的相互作用進(jìn)而達(dá)到治療的作用。在PD-L1高表達(dá)、T效應(yīng)細(xì)胞激活、IFN-γ相關(guān)基因高表達(dá)和高腫瘤突變負(fù)荷（TMB）的腫瘤中觀察到Atezolizumab的具有更好的治療效果。然而，仍然需要了解應(yīng)答和非應(yīng)答患者中的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的不同作用以及其他的生物學(xué)差異。在多個(gè)研究工作中，已經(jīng)清楚地闡述了浸潤(rùn)的CD8+ T細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的反應(yīng)之間的關(guān)系。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在黑色素瘤、軟組織肉瘤和腎細(xì)胞癌患者的腫瘤中，B細(xì)胞浸潤(rùn)增加、三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的存在與免疫治療反應(yīng)改善之間也存在著比較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。重要的是，這些研究發(fā)現(xiàn)，無論采用何種治療方式，表現(xiàn)出高表達(dá)B細(xì)胞基因特征的腫瘤患者均顯示出良好的預(yù)后。因此，目前尚不清楚腫瘤內(nèi)B細(xì)胞是否在PD1/PD-L1阻斷治療的情況下可以改善預(yù)后，或者是否可以成為轉(zhuǎn)移性NSCLC PD1/PD-L1治療的預(yù)后的預(yù)測(cè)標(biāo)志物。
二．研究方法
該工作分析了來自POPLAR（phase 2）和OAK（phase 3）的891例治療前腫瘤的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，這兩項(xiàng)隨機(jī)臨床試驗(yàn)分別是在NSCLC中進(jìn)行了Atezolizumab免疫治療與Docetaxel化療的療效比較。在這兩項(xiàng)試驗(yàn)中，首先確定了與Atezolizumab治療的患者總體生存（OS）益處相關(guān)的顯著的B細(xì)胞和漿細(xì)胞特征。然后，利用NSCLC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)集來識(shí)別腫瘤內(nèi)濾泡B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和漿細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，并通過質(zhì)譜流式檢測(cè)技術(shù)（CyTOF）在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行驗(yàn)證。在bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中，對(duì)這些B細(xì)胞特征的反卷積強(qiáng)調(diào)了在Atezolizumab治療中，漿細(xì)胞可獨(dú)立于CD8+ T細(xì)胞信號(hào)而改善OS。最后，腫瘤內(nèi)漿細(xì)胞的富集與TLS聚集的存在顯著相關(guān)性，并且具有TLS和/或LAs的腫瘤患者具有更好的預(yù)后。該研究揭示了在PD-L1檢查點(diǎn)阻斷治療中具有較好預(yù)后的 NSCLC患者中，存在比較強(qiáng)的腫瘤內(nèi)B細(xì)胞和漿細(xì)胞的信號(hào)，并且獨(dú)立于CD8+ T細(xì)胞的存在。
三．研究結(jié)果
1、Atezolizumab治療患者的B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征與改善的OS相關(guān)
在OAK隊(duì)列中，對(duì)Atezolizumab治療有OS改善和無OS改善的患者進(jìn)行差異表達(dá)基因分析。 受益患者中高表達(dá)的基因主要是與B細(xì)胞和漿細(xì)胞相關(guān)的基因，例如CD19、 D79A、 ANK1、 CHAIN、 ZB1和TNFRSF17（圖1A），與細(xì)胞毒性T細(xì)胞和干擾素（IFN）相關(guān)的基因，例如CD3E、CD3D、CD3G、CD8A、GZMA-B、IFNG和CXCL9-10，然而，這些基因在Docetaxel化療組中均不顯著（圖1B），表明這些B細(xì)胞和漿細(xì)胞基因?qū)tezolizumab治療的應(yīng)答具有預(yù)測(cè)價(jià)值。然后，在OAK隊(duì)列中進(jìn)行生存分析，用三分位數(shù)對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分類，并比較高表達(dá)（T3）和低/中表達(dá)（T1-T2）組中的生存曲線。B細(xì)胞標(biāo)記物CD79A和CD19的高表達(dá)比IFNG或IFN誘導(dǎo)的趨化因子CXCL10更多地改善了OS（圖1C-F）。該研究還在蛋白質(zhì)水平上確認(rèn)這些轉(zhuǎn)錄組水平的研究結(jié)果，使用多重免疫熒光（IF）對(duì)Atezolizumab的兩名應(yīng)答者和兩名無應(yīng)答者的腫瘤樣本進(jìn)行CD8、CD79和Ki67染色評(píng)估。與無應(yīng)答的患者相比，在有應(yīng)答的患者的腫瘤中檢測(cè)到大量CD79+ B細(xì)胞。
2. 在scRNA-seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定B細(xì)胞亞群
為了進(jìn)一步研究與Atezolizumab應(yīng)答相關(guān)的B細(xì)胞，該工作分析了從44例NSCLC患者的肺和外周組織收集208506個(gè)細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù)集。確定了三個(gè)主要CD79A+ B細(xì)胞亞群，包括濾泡B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖2A）。雖然發(fā)現(xiàn)與正常鄰近組織相比，腫瘤組織中的B細(xì)胞和漿細(xì)胞數(shù)量增加，但這些B細(xì)胞群中的生發(fā)中心B細(xì)胞、濾泡B細(xì)胞和漿細(xì)胞的組成在同一患者的腫瘤和癌旁組織之間是相似的（圖2B）。濾泡B細(xì)胞高表達(dá)CD83、CD69、SELL和BANK1。漿細(xì)胞高表達(dá)多種免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄物（IGHG2、IGHGP和IGHA2）、MZB1、DERL3和XBP1。生發(fā)中心B細(xì)胞高表達(dá)HMGA1、AICDA和RGS13（圖2C）。并且在兩個(gè)獨(dú)立的NSCLC scRNA-seq數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證了濾泡B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞和漿細(xì)胞的存在（圖2D和2E）。并進(jìn)一步使用CyTOF在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步證實(shí)了這三個(gè)B細(xì)胞亞群的存在。
3. 將scRNA-seq衍生的特征用于bulk RNA-seq分析
探究從scRNA-seq分析中確定的B細(xì)胞特征是否可以預(yù)測(cè)Atezolizumab治療或Docetaxel化療后的患者生存率。首先通過測(cè)量基因共表達(dá)并對(duì)這些共表達(dá)模式進(jìn)行分層聚類，驗(yàn)證了來自scRNA-seq的B細(xì)胞特征可以應(yīng)用于bulk RNA-seq數(shù)據(jù)（圖3A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證特征，在23例NSCLC腫瘤上進(jìn)行了配對(duì)bulk RNA-seq和多重IF（mIF）（圖3B）?？偟膩碚f，mIF或RNA-seq對(duì)漿細(xì)胞的定量具有高度相關(guān)性（圖3C）。重要的是，通過最高三分位數(shù)（T3）與底部?jī)蓚€(gè)三分位數(shù)（T1-T2）對(duì)樣本進(jìn)行二分，產(chǎn)生了高度相似的分層（圖3D）。此外，漿細(xì)胞RNA-seq標(biāo)記基因單獨(dú)與mIF漿細(xì)胞定量相關(guān)，而與濾泡B細(xì)胞和生發(fā)中心B細(xì)胞標(biāo)記基因則不相關(guān)，突出了漿細(xì)胞特征的特異性（圖3E）?？傊?，證明了scRNA-seq衍生的特征對(duì)漿細(xì)胞具有高度特異性，足以應(yīng)用于bulk RNA-seq對(duì)樣本進(jìn)一步進(jìn)行分層。
4. 高漿細(xì)胞特征預(yù)測(cè)Atezolizumab治療后的患者生存率
使用三分位數(shù)對(duì)患者進(jìn)行二分類，并比較T3和T1/2組。Kaplan-Meier分析顯示，雖然Atezolizumab在三個(gè)B細(xì)胞特征中觀察到OS改善的趨勢(shì)，但只有漿細(xì)胞信號(hào)顯著（圖4A-4D）。重要的是，無論是生發(fā)中心B細(xì)胞、濾泡B細(xì)胞，還是tGE8特征（IFNG、 CXCL9、CD8A、GZMA、GZMB、CXCL10、PRF1和TBX21）在這些模型中都不顯著（圖4E）。在研究隊(duì)列中，207名患者（Atezolizumab n=99；Docetaxel n=108）采用PDL1 IHC、RNA seq和組織TMB（FMI tTMB）進(jìn)行了全面的生物標(biāo)記物分析。為了評(píng)估漿細(xì)胞特征與免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療反應(yīng)已知生物標(biāo)志物相比的預(yù)測(cè)價(jià)值和獨(dú)立性，將這些特征結(jié)合在多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析中，發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞特征對(duì)Atezolizumab治療組中的OS有最強(qiáng)的影響。在Docetaxel化療組中沒有這些相關(guān)性，這突出了漿細(xì)胞特征的特異性，對(duì)Atezolizumab治療患者有益，但對(duì)化療無效（圖4F）。并且，漿細(xì)胞特征高的腫瘤患者僅在Atezolizumab治療組中臨床獲益率顯著增加（圖4H）。在OAK中分離鱗狀和非鱗狀NSCLC患者時(shí)，兩種組織學(xué)中漿細(xì)胞特征得分最高的三分位患者顯示Atezolizumab治療比Docetaxel化療具有更長(zhǎng)的OS（圖4G）。
5. 漿細(xì)胞特征在具有三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(TLS)和/或淋巴聚集（LAs）的腫瘤中富集
研究發(fā)現(xiàn)H&E定義的TLS以CD20+ B細(xì)胞為主的獨(dú)特生發(fā)中心為標(biāo)志。生發(fā)中心被CD20+ B細(xì)胞和CD3+ T細(xì)胞的混合物包圍，其中的CD3+T 細(xì)胞主要由CD8-（CD4+ T細(xì)胞）和CD8+ T細(xì)胞兩種細(xì)胞構(gòu)成（圖5A）。此外，所有已識(shí)別的TLS都由鄰近的漿細(xì)胞標(biāo)記（圖5A）。LAs有更多的混合特征，沒有明顯的CD20+ 特征，富集更多的CD3+ T細(xì)胞而不是CD20+ B細(xì)胞（圖5A）。在LAs內(nèi)或周圍也發(fā)現(xiàn)了漿細(xì)胞（圖5A）。通過mIF實(shí)驗(yàn)證實(shí)了漿細(xì)胞與T細(xì)胞浸潤(rùn)具有比較強(qiáng)的相關(guān)性?？傊@些數(shù)據(jù)表明，在TLS和/或LAs中，漿細(xì)胞浸潤(rùn)可能與T細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。因此，在POPLAR隊(duì)列中評(píng)估了腫瘤的H&E是否存在TLS和/或LAs。在分析的254例患者樣本中，9%的患者有TLS樣結(jié)構(gòu)伴有生發(fā)中心，21%的患者有LAs，但未觀察到生發(fā)中心，其余70%的患者未檢測(cè)到TLS或LAs。Atezolizumab治療或Docetaxel化療組樣本之間的TLS或LAs分布沒有差異（圖5B）。含有TLS和/或LAs的腫瘤患者在使用Atezolizumab治療時(shí)，OS有顯著增加，但使用Docetaxel化療時(shí)沒有顯著區(qū)別（圖5C）。與漿細(xì)胞特征相似，這些數(shù)據(jù)表明TLS和/或LAs的存在與Atezolizumab治療（而非Docetaxel化療）患者的OS獲益密切相關(guān)。含有TLS和/或LAs的腫瘤中三種瘤內(nèi)B細(xì)胞亞群的基因高度富集，尤其是漿細(xì)胞基因，包括MZB1、TNFRSF17（BCMA）和免疫球蛋白（圖6A和6B）。對(duì)三種B細(xì)胞特征的定量分析證實(shí)了TLS和/或LAs的腫瘤中漿細(xì)胞的增加。并且，含有TLS和/或LAs的腫瘤中的生發(fā)中心B細(xì)胞和濾泡B細(xì)胞特征也增加（圖6C）。
四、總結(jié)
總的來說，該研究整合了Atezolizumab免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療與Docetaxel化療兩個(gè)大型隨機(jī)臨床試驗(yàn)的bulk RNA-seq隊(duì)列，以及scRNA-seq和蛋白質(zhì)測(cè)量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，NSCLC中高水平的瘤內(nèi)漿細(xì)胞與接受Atezolizumab治療的患者更長(zhǎng)的OS密切相關(guān)。隨著單細(xì)胞技術(shù)的興起，公開的單細(xì)胞數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)爆炸式增長(zhǎng)，這為科研人員的研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，公共大隊(duì)列數(shù)據(jù)，多組學(xué)整合以及新角度也可以發(fā)Cancer Cell！
