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Title：結(jié)直腸癌和胰腺癌放療對(duì)免疫治療的影響
難治性結(jié)直腸癌和胰腺癌放射誘導(dǎo)的檢查點(diǎn)免疫治療反應(yīng)
大家好，今天給大家分享的是去年9月的一篇文章。免疫檢查點(diǎn)阻斷在微衛(wèi)星穩(wěn)定(MSS)結(jié)直腸癌(CRC)和胰腺癌(PDAC)中的療效有限，這項(xiàng)研究主要描述了在MSS CRC和PDAC中聯(lián)合抗CTLA4和抗PD1抗體的放射治療2期試驗(yàn)，該研究為放射和聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷治療在其他免疫療法抗性癌癥中的概念提供了基本的證據(jù)。
方法部分
病人選擇
本研究共納入40例CRC患者和25例PDAC病患者(圖1)。所有患者都被確認(rèn)為MSS，并且在入院時(shí)有轉(zhuǎn)移性疾病。
全外顯子組測(cè)序(WES)分析
WES共分析了來(lái)自每個(gè)方案隊(duì)列17名患者的41例具有配對(duì)胚系DNA的腫瘤樣本，在HiSeqX上使用雙末端讀長(zhǎng)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序。研究者從雙末端wes讀長(zhǎng)檢測(cè)獲得了SNV和indel突變，其read長(zhǎng)度為150個(gè)堿基對(duì)，并根據(jù)GATK最優(yōu)流程對(duì)測(cè)序讀長(zhǎng)進(jìn)行了預(yù)處理。具體來(lái)說(shuō)，首先使用bwa和samtools將測(cè)序讀長(zhǎng)與人類(lèi)參考基因組(GRCh37)進(jìn)行比對(duì)，并使用picard的"MarkDuplicates"來(lái)標(biāo)記重復(fù)。使用GenomeAnalysisTK工具進(jìn)行indel重比對(duì)，使用BaseRecalibrator和dbSNP重新校準(zhǔn)了堿基質(zhì)量。最后，基于預(yù)處理之后的序列數(shù)據(jù)，研究者使用MuTect和Strelka檢測(cè)SNV和indel。然后，使用bam-readcount軟件執(zhí)行每個(gè)SNV和indel的檢測(cè)以獲取正常/腫瘤讀長(zhǎng)count值。除了可能的KRAS突變之外，其余突變也都使用了最小堿基質(zhì)量過(guò)濾閾值"-b 15"，這是為了捕捉所有可能的司機(jī)KRAS突變。檢測(cè)出來(lái)的所有突變使用snpEff進(jìn)行注釋。研究者對(duì)所有突變，非同義SNV突變和錯(cuò)義突變分別計(jì)算了腫瘤突變負(fù)荷(TMB)。變異等位基因頻率大于10%的編碼突變被視為"高質(zhì)量"的突變。
RNA-seq計(jì)算分析
在Illumina NextSeq 500平臺(tái)上進(jìn)行雙末端測(cè)序，原始Illumina讀長(zhǎng)經(jīng)過(guò)如下步驟質(zhì)控。首先，對(duì)讀長(zhǎng)的末端進(jìn)行修剪，去除質(zhì)量小于20的N和堿基。這之后，對(duì)剩余堿基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行排序，并計(jì)算第20百分位的質(zhì)量，如果第20百分位的質(zhì)量小于15，則整個(gè)讀長(zhǎng)被丟棄。此外，修剪后少于40個(gè)堿基的讀長(zhǎng)被舍棄。如果這一對(duì)中至少有一個(gè)讀長(zhǎng)沒(méi)有通過(guò)質(zhì)控，其配對(duì)的讀長(zhǎng)同時(shí)被丟棄。使用STAR將經(jīng)過(guò)質(zhì)控的讀長(zhǎng)比對(duì)到人類(lèi)基因組，隨后使用Rsubread軟件包的featureCounts工具將比對(duì)上的讀長(zhǎng)映射給基因，這就產(chǎn)生了每個(gè)基因的原始read count值。使用R中的DESeq2包進(jìn)行差異表達(dá)和統(tǒng)計(jì)分析，以未標(biāo)準(zhǔn)化的原始read count值作為輸入，使用FDR校正的p值<0.05來(lái)選擇差異表達(dá)基因，通過(guò)Kaplan-Meier方法來(lái)可視化OS和PFS曲線(xiàn)。
結(jié)果部分
免疫檢查點(diǎn)抑制和放射聯(lián)合治療的療效
在CRC隊(duì)列中，大多數(shù)患者(N=23，58%)在診斷時(shí)是轉(zhuǎn)移性的，從診斷到第1周期第1天的中位時(shí)間是44.9個(gè)月(表1)。在PDAC隊(duì)列中，大多數(shù)患者(N=18，72%)在診斷時(shí)為局部晚期或轉(zhuǎn)移性，從診斷到第1周期第1天的中位時(shí)間為16.9個(gè)月(表1)。
表1 基線(xiàn)患者和疾病的特征
在入組并開(kāi)始治療的40名CRC患者中，疾病控制率(DCR)為25%，通過(guò)意向性治療(ITT)分析，客觀緩解率(ORR)為10%。CRC隊(duì)列的中位PFS為2.4個(gè)月，中位OS為7.1個(gè)月(圖3a,b)。同樣，根據(jù)ITT分析，25名PDAC患者的DCR為20%，ORR為12%。中位PFS為2.5個(gè)月，中位OS為4.2個(gè)月(圖3a,b)。共有34名患者接受了光子治療，12名患者接受了質(zhì)子治療。在這兩個(gè)隊(duì)列中，32%的患者(CRC13/40；PDAC8/25)因自身免疫毒性導(dǎo)致臨床衰退(N=4)、臨床進(jìn)展(N=7)而在放射治療前停藥(表2)。
表2 最佳總體反應(yīng)的療效
在CRC隊(duì)列中，83%的患者出現(xiàn)了≥3級(jí)的不良事件(AE)，60%為3級(jí)，20%為4級(jí)，3%為5級(jí)。最常見(jiàn)的≥3級(jí)AE是淋巴細(xì)胞減少癥、脂肪酶或淀粉酶升高、貧血、腹瀉、結(jié)腸炎、低鈉血癥和疲勞，5級(jí)毒性是肺炎(表3)。在PDAC隊(duì)列中，60%的患者出現(xiàn)了AE≥3級(jí)，44%為3級(jí)，12%為4級(jí)，4%為5級(jí)。最常見(jiàn)的3級(jí)AE是淋巴細(xì)胞減少癥、疲勞、高血糖和肝功能測(cè)試升高，5級(jí)毒性是肝性腦病，可能與治療有關(guān)(表3)。
表3 與治療相關(guān)的不良事件
在對(duì)接受放療的患者進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)方案分析中顯示，CRC隊(duì)列的DCR為37%，ORR為15%；PDAC隊(duì)列的DCR為29%，ORR為18%。圖2顯示了CRC和PDAC的最優(yōu)客觀緩解，如瀑布圖所示。一個(gè)CRC和一個(gè)PDAC病例的完全緩解(CR)非常明顯。癌癥患者隊(duì)列的中位PFS為2.5個(gè)月，中位OS為10.9個(gè)月(圖3c，d)。10名疾病控制為最佳總療效的患者的中位PFS為5.2個(gè)月，而17名沒(méi)有疾病控制的患者的PFS為2.4個(gè)月。相比疾病未控制者的中位OS為7.7個(gè)月，疾病控制者的中位OS為20.9個(gè)月。在PDAC隊(duì)列中，中位PFS為2.7個(gè)月，中位OS為6.1個(gè)月。5名疾病控制為最佳總療效的患者的中位PFS為5.5個(gè)月，而12名疾病未控制患者的PFS為2.5個(gè)月。
腫瘤突變負(fù)荷及編碼基因突變分析
通過(guò)WES分析了來(lái)自每個(gè)實(shí)驗(yàn)方案隊(duì)列17名患者的總共41例腫瘤樣本。所有患者的TMB都很低(圖4a)，無(wú)緩解的患者(疾病進(jìn)展=PD)與緩解的患者(疾病穩(wěn)定=SD，部分反應(yīng)=PR，完全反應(yīng)=CR)相比沒(méi)有區(qū)別。此外，TMB在治療前、治療中和治療后都沒(méi)有變化(圖4a)。對(duì)非同義基因突變的分析確定了突變的常見(jiàn)基因，包括CRC和PDAC的KRAS和TP53突變，以及CRC的常見(jiàn)APC突變(圖4b)。此外，DNA損傷和修復(fù)通路基因也存在顯著突變。沒(méi)有特異的DNA損傷和修復(fù)通路基因突變?cè)谟蟹磻?yīng)或疾病穩(wěn)定的患者中出現(xiàn)。值得注意的是，4號(hào)患者(CRC PR)和41號(hào)患者(PDAC CR)有6個(gè)DNA損傷和修復(fù)基因的突變，這表明這些基因在預(yù)測(cè)反應(yīng)方面有潛在的重要性。
與疾病控制相關(guān)的重復(fù)RNA表達(dá)和干擾素反應(yīng)基因
對(duì)13例接受放射治療患者的32份樣本進(jìn)行了RNA測(cè)序分析?；顧z分析顯示，與無(wú)緩解的患者相比，緩解的患者中有467個(gè)差異表達(dá)基因，其中315個(gè)上調(diào)，152個(gè)下調(diào)(圖5a)。緩解者中上調(diào)基因的基因集富集到HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE中。放療前和放療后樣本的配對(duì)分析顯示，所有患者中有372個(gè)基因上調(diào)，209個(gè)基因下調(diào)。有趣的是，最顯著富集的基因基還是HALLMARK_INTERFERON_GAMMA_RESPONSE，這表明干擾素γ應(yīng)答基因在放療誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)生物活性中的重要性。放射誘導(dǎo)的顯著基因包括多種MHC I類(lèi)、MHC II類(lèi)和重要的炎性細(xì)胞因子，這表明放射腫瘤中抗原呈遞增強(qiáng)(圖5b)。使用免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄特征對(duì)RNA-seq數(shù)據(jù)中的免疫亞群進(jìn)行去卷積，發(fā)現(xiàn)M2巨噬細(xì)胞占主導(dǎo)地位，而CD8 T細(xì)胞卻很少。放療前緩解者的樣本中樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的豐度高于無(wú)緩解者，并且放療后樹(shù)突狀細(xì)胞的總體豐度增加，這在無(wú)緩解者中更明顯。此外，與放射后相比，所有患者在治療前都觀察到NK和CD8細(xì)胞豐度的增加，且在緩解者和無(wú)緩解者中，放射前和放射后的初始和記憶CD4 T細(xì)胞的比例可能發(fā)生變化?？紤]到緩解者先天免疫應(yīng)答較高的指征，研究者分析了RNA-seq的重復(fù)元件RNA表達(dá)水平，緩解者與無(wú)緩解者相比，147種重復(fù)RNA的水平異常地高，只有9個(gè)重復(fù)RNA的水平較低(圖5c)。對(duì)主要重復(fù)元件的分析發(fā)現(xiàn)，與進(jìn)展者相比，疾病控制患者的HERV-K內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)明顯較高(圖5d)?？偟膩?lái)說(shuō)，干擾素應(yīng)答失調(diào)相關(guān)重復(fù)元件的去抑制與接受放射聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)阻斷患者的疾病控制和應(yīng)答相關(guān)。
參考文獻(xiàn)：Radiation Induced Checkpoint Immunotherapy Response in Refractory Colorectal and Pancreatic Adenocarcinoma
