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膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)美國腦腫瘤注冊中心統(tǒng)計，膠質(zhì)瘤約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的80%。這是一篇來自中南大學(xué)湘雅醫(yī)院研究人員今年8月發(fā)表在Computational and Structural Biotec（IF：7.272）上的一篇關(guān)于膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞的分子特征的文章。
膠質(zhì)瘤患者腫瘤免疫微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的分子特征
研究背景
膠質(zhì)瘤按照腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)劃分可分為星形細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤和室管膜瘤等。按腫瘤細(xì)胞在病理學(xué)上的惡性程度來區(qū)分的話，膠質(zhì)瘤目前最常用的分級是WHO分級，從低到高分為1-4級，1級惡性程度最低，預(yù)后最好，4級惡性程度最高，預(yù)后最差。
巨噬細(xì)胞的活化在炎癥和疾病進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)其功能和活化作用對巨噬細(xì)胞進(jìn)行分類的話，一般可以分為兩種亞型：經(jīng)典活化的M1巨噬細(xì)胞和替代活化的M2巨噬細(xì)胞。M1巨噬細(xì)胞由脂多糖和干擾素γ等誘導(dǎo)，其抗原遞呈活性強，分泌促炎細(xì)胞因子多。M2巨噬細(xì)胞常被IL-4,IL-10,IL-13,CSF-1和TGF-β激活，與組織重塑、血管生成和過敏反應(yīng)有關(guān)。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）是腫瘤微環(huán)境（TME）的組成部分，占膠質(zhì)瘤非癌細(xì)胞的50%，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。從嚴(yán)格意義上說，TAM并不被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞中的一個亞群，因為這些細(xì)胞不是在穩(wěn)態(tài)條件下存在，而是在許多腫瘤中被觀察到的。此外，巨噬細(xì)胞可以穿過血腦屏障，可以用于抗癌藥物的載體。
數(shù)據(jù)隊列
TCGA隊列：672個LGG和GBM 的RNA-seq數(shù)據(jù)和對應(yīng)的臨床信息
CGGA隊列：兩個RNA-seq隊列（CGGA325和CGGA693）和一個微陣列隊列（CGGAarray）
單細(xì)胞隊列：GSE138794
其他：15個確診為膠質(zhì)瘤的患者樣本
研究流程圖
結(jié)果
1.將巨噬細(xì)胞密度確定為潛在的預(yù)后標(biāo)志
研究人員首先想通過利用WGCNA分析來篩選與巨噬細(xì)胞相關(guān)的基因以確定膠質(zhì)瘤中巨噬細(xì)胞的預(yù)后價值。他們提取了TCGA隊列中的表達(dá)量前5000個基因用于WGCNA分析，得到了七個模塊，從中提取出945個與巨噬細(xì)胞模塊相關(guān)的基因用于后續(xù)分析。利用聚類分析算法——PAM算法，可以將TCGA隊列中具有相應(yīng)基因表達(dá)特征的膠質(zhì)瘤患者分為兩類（圖1A）。同時，利用PCA可以將TCGA數(shù)據(jù)集區(qū)分開來（圖1B）。在圖1C中的生存分析可以發(fā)現(xiàn)cluster1比cluster2的生存明顯差。之后在CGGA隊列中分析表達(dá)譜，從這些基因中驗證鑒定出434個基因（圖1D）。然后選取最佳閾值（圖1E），篩選出13個基因可以很好的區(qū)分樣本（圖1F）。這些基因已被報道在腫瘤中起重要作用，如TIMP1和EMP3與腫瘤中的巨噬細(xì)胞招募有關(guān)。因此，推測這13個基因可以被作為巨噬細(xì)胞特征的可靠鑒別標(biāo)記。
圖1. M2巨噬細(xì)胞相關(guān)簇的構(gòu)建與驗證
2.基于巨噬細(xì)胞分類的集群的臨床特征和 TME 特征
研究人員接著研究了上述分類中的兩個集群的TME特征。在圖2A中展示了64種類型細(xì)胞在兩個集群的表達(dá)差異，可以發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞等在cluster1中明顯增多，其生存也更差。通過TCGA隊列分析發(fā)現(xiàn)cluster1中的ESTIMATEScores, ImuneScores 和 StromalScores都高于cluster2（圖2B）。同時還比較了兩個集群的與抗原遞呈、細(xì)胞表面受體等相關(guān)的一些免疫檢查點分子水平，發(fā)現(xiàn)大部分分子都是在cluster1中高表達(dá)（圖2C）。同時在TCGA隊列中發(fā)現(xiàn)cluster1的病理分級要高，IDH突變比例也明顯高于cluster2，由此說明cluster1惡性程度更高。
圖2.兩個集群的特征
3.巨噬細(xì)胞分組集群的基因組特征
圖3A和3B中展示了兩個集群的全基因組CNV圖譜，根據(jù)體細(xì)胞突變分析發(fā)現(xiàn)，EGFR (29%), TP53 (27%), PTEN (23%) 以及TTN (23%)的突變更多的富集在cluster1中；相比之下，cluster2中IDH1 (93%), TP53 (52%), ARTX (38%) and CIC (25%)的突變更多（圖3C）。
圖3.兩個集群的基因組特征
4.富含巨噬細(xì)胞的膠質(zhì)瘤中的 DMP 與腫瘤進(jìn)展相關(guān)
通過設(shè)置cutoff（Δbeta value >0.4 和p value <0.05），共鑒定出8359個DMP，其中8301個上調(diào)，58個下調(diào)。圖4A熱圖中展示了鑒定出的DMP在兩組中情況。Cluster1的基因組表現(xiàn)出整體低甲基化趨勢，84.2% 的 DMP 處于低甲基化狀態(tài)（圖4B），在基因組的分布中，DMP主要集中在IGRs和TSS區(qū)域。圖4C中是DMP在染色體上的分布情況。對DMP相關(guān)的基因進(jìn)行GSEA分析發(fā)現(xiàn)，高甲基化基因?qū)δ[瘤相關(guān)的生物過程有更關(guān)鍵的作用，如 TGFβ、腫瘤壞死因子 α (TNFα) 和白細(xì)胞增生（IL-2）等（圖4D）。GO 富集（圖4E）分析還發(fā)現(xiàn)T 細(xì)胞活化、增殖和分化活動增加。同時還計算并比較了兩個集群中主要免疫細(xì)胞類型的富集分?jǐn)?shù)，Cluster1中的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞水平高于Cluster2，而Cluster2中的B細(xì)胞、NK細(xì)胞和CD4+ T細(xì)胞水平更高（圖4F）。
圖4.兩個集群的甲基化特征
5.MScore的構(gòu)建及其功能注釋
彈性回歸和PCA分析用于構(gòu)建風(fēng)險評分，也就是MScore。評估了64種細(xì)胞類型的表達(dá)水平與 MScores 的相關(guān)性，與成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞水平呈正相關(guān)（圖5A）。生存分析發(fā)現(xiàn)high-MScores和low-MScores的生存具有顯著差異（圖5C）。與巨噬細(xì)胞的激活和遷移、樹突狀細(xì)胞分化和 T 細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控相關(guān)的通路在high-MScores分組的樣本中富集更多。同時，研究人員還在另外15個膠質(zhì)瘤數(shù)據(jù)集中驗證發(fā)現(xiàn)MScores可以很好的區(qū)分患者的不同生存情況（圖6）。此外，還探究了其在其他癌癥中的作用，發(fā)現(xiàn)在嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、腎嫌色細(xì)胞和葡萄膜黑色素瘤等是不利因素，對彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤、前列腺腺癌和甲狀腺癌有促進(jìn)作用（圖 5D），這也說明了腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性。MScores的GO富集功能分析還表明，MScores 與巨噬細(xì)胞活化、成纖維細(xì)胞增殖、肥大細(xì)胞活化調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞分化呈正相關(guān)，表明存在免疫抑制微環(huán)境（圖5E）。生存分析發(fā)現(xiàn)high-MScores組的患者生存情況更差（圖5F）。圖5G中的IHC染色結(jié)果表明high-MScores的樣品的CD163表達(dá)更高。
圖5. MScore特征
圖6.基于MScores分組的生存分析
6.基于MScores的預(yù)后模型的構(gòu)建
在TCGA和CGGA膠質(zhì)瘤隊列中MScores被確定為危險因素，然后結(jié)合患者年齡、腫瘤等級、IDH突變和染色體1p/19q編碼缺失等因素構(gòu)建預(yù)后模型，并在CGGA隊列中的693個樣本中得到驗證。
7.基于巨噬細(xì)胞分組的患者對免疫療法的反應(yīng)的預(yù)測
研究人員首先評估了MScores是否能預(yù)測免疫阻斷治療對膠質(zhì)瘤患者的治療效果，發(fā)現(xiàn)并不能很好的區(qū)分不同的生存情況（圖7A）。然而，當(dāng)根據(jù)免疫治療反應(yīng)類型進(jìn)一步對患者進(jìn)行分組時，疾病進(jìn)展組、疾病穩(wěn)定組和部分反應(yīng)組顯示出不同的MScore，部分反應(yīng)和完全反應(yīng)組呈現(xiàn)出較低的 MScore（圖7B）。與部分緩解組和完全緩解組相比，疾病進(jìn)展組和疾病穩(wěn)定組顯示出更高的MScore百分比（圖7C和7D）。同時還以二元模式對治療反應(yīng)樣本進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)完全/部分反應(yīng)組的高M(jìn)Score百分比高于穩(wěn)定/進(jìn)展疾病組（圖7E）。同時高M(jìn)Score組的PD-L1水平也比較高（圖7F）。最后MScore的預(yù)后價值也在GSE78220中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗證（圖7G-I）。
圖7. MScore對免疫的預(yù)測價值
討論
本研究首次通過WGCNA分析巨噬細(xì)胞密度作為膠質(zhì)瘤預(yù)后標(biāo)志的可靠性，利用提取的基因?qū)颊哌M(jìn)行分組，并通過多種方法機器學(xué)習(xí)方法進(jìn)行驗證。為了驗證巨噬細(xì)胞的預(yù)后價值，評估了基于巨噬細(xì)胞密度分組的膠質(zhì)瘤患者的腫瘤基因組學(xué)、TME、代謝和缺氧途徑的綜合情況（圖7J）?？傊?，本研究分析確定了一個由 26 個巨噬細(xì)胞特異性基因組成的巨噬細(xì)胞基因特征，并確定了它們在膠質(zhì)瘤中的預(yù)后價值。研究結(jié)果驗證了巨噬細(xì)胞，尤其是 M2 巨噬細(xì)胞在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的調(diào)節(jié)作用。
