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Cell重磅|全面多組學(xué)鑒定新型胰腺癌治療靶點(diǎn)及早期診斷標(biāo)志物
哈嘍，大家好，不知大家的國慶小長假過得怎么樣呢？有沒有出去盡情high呢？話說回來，小編的假期可以說是過得相當(dāng)有意義呢，小編啊可是一個勤奮刻苦努力上進(jìn)的好孩紙，這不放假期間也不忘讀文獻(xiàn)，可謂是受益匪淺[驕傲臉]。獨(dú)樂樂不如眾樂樂，今天小編就把這篇發(fā)表在Cell雜志（IF：41.582）上的題為“Proteogenomic characterization of pancreatic ductal adenocarcinoma”的文章分享給大家。萬字長文，內(nèi)容豐富，結(jié)構(gòu)清晰，如果你時間緊張，可以跳過中間詳解，只看“摘要”和“討論”兩部分。如果你和小編一樣愛學(xué)習(xí)，愛思考，那就從頭慢慢欣賞學(xué)習(xí)吧~
摘要
胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種高度侵襲性的癌癥，患者生存率低。為了了解驅(qū)動PDAC腫瘤發(fā)生的潛在分子改變，作者對140例胰腺癌、67例正常癌旁組織和9例正常胰腺導(dǎo)管組織進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)基因組分析。采用蛋白質(zhì)組學(xué)、磷蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白組學(xué)分析來表征蛋白質(zhì)及其修飾。此外，對同一組織進(jìn)行全基因組測序、全外顯子組測序、甲基化、RNA測序(RNA-seq)和microRNA測序(miRNA-seq)，以進(jìn)行綜合分析，確定基因組改變對蛋白質(zhì)表達(dá)、信號通路、和轉(zhuǎn)錄后修飾。為了確保下游分析的可靠性，通過多種正交策略評估腫瘤細(xì)胞形態(tài)，并通過基于組織學(xué)審查的腫瘤細(xì)胞性的病理學(xué)估計進(jìn)行驗證。這種全面綜合的PDAC蛋白基因組特征對鑒定新的潛在治療靶點(diǎn)及早期診斷標(biāo)志物具有重大意義。
數(shù)據(jù)來源
作者收集了140例未經(jīng)治療的胰腺癌（35例PDAC和5例胰腺腺鱗癌）、67例正常鄰近組織和9例正常胰腺導(dǎo)管組織進(jìn)行了全面的多組學(xué)研究。進(jìn)行全基因組測序、全外顯子組測序、甲基化、RNA測序（RNA-seq）和miRNA測序、蛋白質(zhì)組學(xué)、磷蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)的測序和分析，共獲得了8組組學(xué)數(shù)據(jù)（圖1A）。
樣本是從全球多個地方前瞻性收集的，控制了缺血時間，可以確保高質(zhì)量的蛋白PTM分析（圖1B）。因為這些是手術(shù)切除的癌癥，絕大多數(shù)患者處于I-III期，只有9名IV期患者，截至到本研究數(shù)據(jù)分析時，因42%的患者還活著（圖1B），導(dǎo)致很多樣本的腫瘤細(xì)胞并不多，為了解決這種低腫瘤純度問題，作者根據(jù)以下3個標(biāo)準(zhǔn)確定了105個具有足夠腫瘤純度的樣本。
(1).KRAS變異等位基因分?jǐn)?shù)（VAF）不小于 0.075；
(2).顯著的突變負(fù)荷和拷貝數(shù)變異（CNVs）（圖1C和1D）。
(3).基于反卷積方法，使用組織學(xué)以及基于DNA甲基化和RNA的不同的分子數(shù)據(jù)模式估計腫瘤細(xì)胞占比（圖S1C)。
上述確定的105個“高腫瘤純度”的樣本納入本分析，此外低純度的樣本也被保留下來，用于探測腫瘤微環(huán)境和腫瘤亞型。
結(jié)果展示
1. PDAC隊列的蛋白質(zhì)基因組景觀
蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析共鑒定和定量了11,662 個蛋白、51,469 個磷酸位點(diǎn)和34,024個糖肽。作者發(fā)現(xiàn)整個 TMT plex 的質(zhì)量控制樣本的測量重現(xiàn)性很高，并且沒有觀察到 TMT plex 效應(yīng)（圖S1A）。在這項研究中，RNA 和蛋白之間的相關(guān)性中位數(shù)為 0.35（圖S1B），表明RNA和蛋白豐度之間存在差異，這在其他癌癥類型中也觀察到。當(dāng)分別對腫瘤和 NAT 進(jìn)行相關(guān)性分析時圖S1B），觀察到 NAT組內(nèi)的中值相關(guān)性相對于腫瘤組降低，這在其他腫瘤類型中也存在，這可能是由于細(xì)胞類型特異性的翻譯調(diào)控。
使用不同的分子數(shù)據(jù)模式估計腫瘤細(xì)胞占比，發(fā)現(xiàn)這些腫瘤細(xì)胞的估值與KRAS VAF估值顯著相關(guān)，特別是采用基于DNA甲基化反卷積獲得的腫瘤細(xì)胞的估值與KRAS VAF估值高度相關(guān)（圖S1C)。除了105個具有足夠腫瘤純度的樣本，其余35例腫瘤純度較低，但它們確實(shí)含有腫瘤細(xì)胞，其他顯著突變基因(SMG)突變，低KRAS VAF，以及病理學(xué)檢查（圖1C）都證實(shí)了這一點(diǎn)。磷酸化和糖基化水平表明，高純度腫瘤和NAT樣本是分離的，但低純度的樣本在空間上位于高純度腫瘤和NAT樣本之間，支持本研究中的純度分類（圖S1D）。
2. 基因組改變對轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和磷酸化的影響
在105個具有高純度腫瘤細(xì)胞的組織樣本中，在已知的胰腺癌驅(qū)動基因KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4中檢測到體細(xì)胞基因組改變，其比率分別為97%、83%、48%和29%（圖2A）。其中CDKN2A和SMAD4的變異百分比，由于包含了CNV和融合因此比較高。除了KRAS、TP53、CDKN2A和SMAD4這四個主要的突變基因，作者還在至少5%的腫瘤中檢測到ARID1A、RNF43、GNAS、KMT2C、KMT2D、TGFBR2和RBM10的改變（圖2A）。
作者全面描述了基因改變對相應(yīng)基因產(chǎn)物（RNA、蛋白和磷酸化）的順式（cis）和反式（trans）影響（圖2B-C）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP53突變在蛋白和磷酸酶水平上具有最大的反式效應(yīng)，在RNA/蛋白水平和磷酸酶水平上影響的基因具有很大差異，猜測這可能是由于廣泛的翻譯后調(diào)控。
TP53的突變與參與DNA損傷修復(fù)通路的蛋白（如MSH6、TP53和TP53BP1）的磷酸化增加有關(guān)，這表明這些改變在維持基因組完整性和防止細(xì)胞凋亡方面起作用（圖2C）。在TP53突變異腫瘤中，作者還觀察到MKI67的磷酸化程度更高，MKI67是細(xì)胞增殖的標(biāo)志，這意味著這些突變可能導(dǎo)致細(xì)胞生長速度增加。作者進(jìn)一步分析了TP53錯義突變與截斷突變的效應(yīng)差異。發(fā)現(xiàn)TP53錯義組與野生型組相比，TP53蛋白表達(dá)和TP53-S315磷酸位點(diǎn)表達(dá)的順式效應(yīng)明顯更大，而截斷組與野生型組之間的TP53蛋白順式效應(yīng)沒有明顯變化。有趣的是，作者發(fā)現(xiàn)錯義組和截斷組都有類似的反式效應(yīng)，這與DNA損傷修復(fù)通路中蛋白的磷酸化水平較高有關(guān)（圖S2A）。
SMAD4突變與SERPINE1在RNA和蛋白水平上的下調(diào)有關(guān)，SERPINE1是已知的轉(zhuǎn)化生長因子β（TGFβ）通路的靶點(diǎn)，與MAPK3蛋白表達(dá)和下游的MAPK信號（E2F4磷酸化）的上調(diào)有關(guān)（圖2B）。
拷貝數(shù)變異(CNVs)包括染色體9p、11q、18q和22q臂的擴(kuò)增、GATA6病灶擴(kuò)增、以及CDKN2A缺失（圖2D-E）,導(dǎo)致基因、蛋白和磷蛋白顯著表達(dá)變化（圖S2B）。由于觀察到大量擴(kuò)增，所以作者接下來著重于在擴(kuò)增的病灶內(nèi)識別新CNV驅(qū)動因素（圖2E-F）。在擴(kuò)增峰內(nèi)的543個基因中，有165個拷貝數(shù)與相應(yīng)RNA顯著相關(guān)，其中的23個也與相應(yīng)蛋白顯著相關(guān)（圖2F）。通過這種方法找到的蛋白體現(xiàn)了 CNV 事件潛在的新型順式效應(yīng)，并與肌動蛋白絲和細(xì)胞骨架形成相關(guān)（圖2F-G），肌動蛋白纖維的重組被報道與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
此外，大多數(shù)受CNVs反式調(diào)控的蛋白位于7、9、17和18號染色體內(nèi)，而CNVs在磷酸化水平上的反式效應(yīng)比較零散（圖S2C），SMAD4和CDKN2A的CNV缺失與SMAD4和CDNK2A mRNA水平較低有關(guān)，HDAC1在S406、S410和S421以及SMARCA4在S613的較高磷酸化與SMAD4缺失有關(guān)，而CDKN2A缺失與NPM1在S70和S214的較高磷酸化有關(guān)（圖2I）。
為了識別可能受腫瘤中DNA甲基化調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)，作者將RNA、蛋白質(zhì)和磷蛋白水平與啟動子DNA甲基化（圖S2D）相關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，GSTM1甲基化導(dǎo)致相應(yīng)的RNA和蛋白下調(diào)，這與GSTM1在多種癌癥中的報道一致。啟動子DNA甲基化的程度在NAT中比在腫瘤中低（圖S2E-F）。作者確定了86個表觀遺傳學(xué)沉默的基因，其中22個是癌癥基因組圖譜（TCGA）以前報道的。有兩個基因（ZNF544和THNSL2）在超過10%的腫瘤中存在表觀遺傳學(xué)沉默，與患者的生存有顯著關(guān)聯(lián)（圖S2G-I）。通過基于甲基化的亞型確定了兩個聚類（聚類M1和M2），其中聚類M2擁有更廣泛的DNA高甲基化。作者還發(fā)現(xiàn)這些腫瘤的細(xì)胞性和甲基化狀態(tài)之間的正相關(guān)，與TCGA報道一致。
3.鑒定早期PDAC特定分子特征，用于腫瘤診斷和預(yù)后
大約80%的PDAC腫瘤無法切除，因為患者是在晚期被診斷出來的。因此對于這些患者來說，如果找到早期檢測穩(wěn)定性的生物標(biāo)志物可能會提高生存率。相對于NATs而言，腫瘤中失調(diào)的蛋白、磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)代表了早期檢測/預(yù)后的潛在標(biāo)志物。
相對于NATs，2218個和2244個蛋白在PDACs中分別明顯下調(diào)和上調(diào)（圖3A）。在NATs中具有高豐度的蛋白與正常的胰腺功能有關(guān)，而在腫瘤中上調(diào)的許多蛋白則富含參與表皮和內(nèi)胚層發(fā)育的蛋白。為了確定與PDACs相關(guān)的蛋白，作者重點(diǎn)關(guān)注222個相比于NATs，在腫瘤中豐度增加2倍的蛋白（圖3A）。調(diào)整基質(zhì)和免疫含量后，仍然有27個蛋白在PDAC中仍顯著上調(diào)2倍。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，PDACs和NATs之間的差異表達(dá)與PDACs和正常胰管之間的差異表達(dá)相似(圖S3A)，而且在27個蛋白中，有21個蛋白與正常胰管相比上調(diào)2倍(圖3B，S3B)。重要的是，這27個蛋白在早期腫瘤中同樣受到調(diào)節(jié)（圖3B）。其中12個是分泌蛋白，可作為血清或胰液的早期檢測標(biāo)志物。據(jù)報道，在胰腺癌數(shù)據(jù)庫中有11個蛋白表達(dá)升高，其中6個蛋白（HK2、LOXL2、COL12A1、C19orf33、TSPAN1和MDK）以前只得到RNA或細(xì)胞系蛋白組證據(jù)的支持，LOXL2蛋白豐度與總生存期縮短有關(guān)（圖3C）。在圖3B中強(qiáng)調(diào)的21個腫瘤相關(guān)蛋白中，通過獨(dú)立采集（DIA）質(zhì)譜分析確定了14個作為早期檢測或預(yù)后標(biāo)記的潛在蛋白。
與NATs相比，4908個磷酸化位點(diǎn)和1727個N-鏈接糖基在PDACs中的豐度明顯增加。一般來說，PTMs的豐度差異與蛋白水平的豐度差異相似，而45個N-鏈接糖位點(diǎn)和645個磷酸化位點(diǎn)的豐度上調(diào)>2倍，但蛋白豐度沒有相應(yīng)增加（圖3D）。例如，雖然RALGAPA2的蛋白豐度在PDACs中下降（圖S3C），但S486和S696的兩個磷酸位點(diǎn)增加>2倍，而其他三個磷酸位點(diǎn)下降或與NAT相似（圖S3D）。據(jù)報道，RALGAPA2與胰腺癌的KRAS信號傳導(dǎo)有關(guān)，作者認(rèn)為在將來的研究中可能需要探索這些特定位點(diǎn)的功能。
除了蛋白豐度外，這些PTMs中有許多與患者的預(yù)后有關(guān)?？傮w而言，PTMs的預(yù)后價值與蛋白的預(yù)后價值相似（圖3E）。然而，APOD上的一個特定的N-鏈接糖基化與較好的總生存率有關(guān)，而總蛋白豐度則沒有（圖3F）。雖然APOD的表達(dá)減少與其他類型的癌癥預(yù)后較好有關(guān)，但對這個糖基化位點(diǎn)的作用及其對APOD功能的影響知之甚少。此外，參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的PIGR上的兩個磷酸化位點(diǎn)與預(yù)后較好有關(guān)，而ERBB信號調(diào)控因子ERRFI1上的一個位點(diǎn)則與生存率較差有關(guān)（圖3E）。
4.靶向糖蛋白生物合成，用于早期發(fā)現(xiàn)和治療干預(yù)
大多數(shù)糖蛋白是膜結(jié)合蛋白或分泌蛋白，可作為免疫治療和疾病檢測的潛在對象。PDACs和NATs的糖蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了75種N-連接糖蛋白在腫瘤中蛋白水平上調(diào)>2倍（圖4A，S4A-B）。其中，57個在胰腺癌數(shù)據(jù)庫中被報道過，18個是在本研究中新發(fā)現(xiàn)的。在75個腫瘤相關(guān)糖蛋白中，有48個通過DIA分析得到進(jìn)一步驗證。此外，與NAT和正常胰管組織相比，CA19-9抗原有關(guān)的粘液型O-連結(jié)糖蛋白在腫瘤和早期腫瘤顯著上調(diào)（圖S4C）。
作者根據(jù)不同的KRAS熱點(diǎn)突變（G12D、G12V、G12R和Q61H）進(jìn)一步區(qū)分了腫瘤與正常胰管組織的N-鏈接糖蛋白表達(dá)（圖4B）。有趣的是，CEACAM5和CEACAM6在攜帶KRAS G12D、G12V和Q61H突變的腫瘤樣本中明顯上調(diào)，而在G12R突變的腫瘤樣本中沒有發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象（圖4B-D）。據(jù)報道，CEACAM6是PDAC患者預(yù)后不良的標(biāo)志物，CEACAM6 過度表達(dá)與PDAC 中的低細(xì)胞毒性T細(xì)胞有關(guān)。此外，從早期腫瘤中N-連接糖蛋白表達(dá)中，發(fā)現(xiàn)了包括半胱氨酸結(jié)合蛋白3（LGALS3BP）的幾個早期檢測或治療的候選物（圖4B、S4E）。
N-連結(jié)糖蛋白的生物合成主要受兩個因素調(diào)控，即糖蛋白基質(zhì)和糖化酶。雖然完整糖肽(IGPs)的變化模式主要與糖蛋白底物的蛋白質(zhì)豐度呈正相關(guān)(圖4C)，但I(xiàn)GP與蛋白質(zhì)特征并不總是一致的，正如研究中描述的IGP豐度異質(zhì)性一樣，在病理組織類型中顯示出不同的糖分支模式?？偟膩碚f，在腫瘤中上調(diào)的N-連接糖蛋白主要是由帶有水楊酸和/或巖藻糖的復(fù)合糖修飾，而在腫瘤中下調(diào)的N-連接糖蛋白主要由高聚甘露糖修飾（圖4C）。這些數(shù)據(jù)表明，關(guān)注PDAC中上調(diào)的N-鏈接糖蛋白的水楊酸化和/或巖藻糖化的糖類，可能會增加癌癥的標(biāo)記物的特異性。
接下來，作者根據(jù)糖基化生物合成酶的豐度水平，研究糖基化改變的內(nèi)在機(jī)制（圖4D）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水楊酸化和/或巖藻糖化的IGPs與糖化酶的表達(dá)相關(guān)（圖4D）。比較糖基化酶的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與NATs相比，腫瘤中的糖基化酶(ST6GAL1、ST3GAL1、FUT3、FUT11、B4GALT1、B4GALT4、B3GALT5和ST6GALNAC1)表達(dá)上調(diào)（圖4E）。其中一些糖基化酶的變化，如腫瘤中ST6GAL1、ST3GAL1和B4GALT1的升高，在轉(zhuǎn)錄組水平未觀察到（圖S4F），突出了蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)在該研究中的附加價值。ST6GAL1和ST3GAL1調(diào)控水楊酸化，而FUT3和FUT11則負(fù)責(zé)巖藻糖基化，這與研究中觀察到的PDAC上調(diào)蛋白主要由水楊酸化和/或巖藻糖基化糖修飾是一致的，抑制這些酶可能作為PDAC的潛在治療策略。
5.激酶和底物的共同調(diào)控揭示了潛在的治療靶標(biāo)
由于具有KRAS驅(qū)動基因突變的腫瘤很難通過靶向治療進(jìn)行治療，對于已知KRAS突變頻率較高的PDAC，能否實(shí)現(xiàn)有效的治療干預(yù)仍是未知的。在胰腺癌發(fā)生過程中，蛋白質(zhì)磷酸化大量參與了各種信號通路。為了研究被激活的KRAS下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，以尋找替代的治療靶點(diǎn)，作者分析了激酶各自磷酸化底物上的蛋白磷酸化事件。
通過分析41個腫瘤/NAT配對組織之間磷酸化肽的差異豐度，作者對5種磷酸化底物（MCM2, FLNA, BAD, MAPK6和STAT3）進(jìn)行了分層，這些底物對應(yīng)于5種激酶（CDK7, AKT1, PAK1, PAK2和SRC），這些激酶的抑制劑要么已被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)，要么正在研究中（圖5A）。
有研究表明，磷酸化底物的升高與S期進(jìn)入/進(jìn)展（CDK7-MCM2）有關(guān)，抑制CDK7可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤進(jìn)展。AKT1是KRAS的下游激酶（圖5B），AKT1幾乎在所有腫瘤中的表達(dá)上調(diào)都是KRAS突變的結(jié)果，而KRAS突變反過來刺激G1/S進(jìn)程，進(jìn)而刺激增殖活性。
一種Ⅰ類p21激活激酶，PAK1在超過70%的腫瘤中表達(dá)上調(diào)，PAK1對其底物磷酸化蛋白（BAD）S134位點(diǎn)的磷酸化可抑制BAD誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。PAK1可以通過與RAC1直接相互作用而被激活，并且RAC1在大多數(shù)腫瘤中上調(diào)（圖5B-C）。PAK1是多種受體酪氨酸激酶的重要效應(yīng)物，如MET。作者發(fā)現(xiàn)MET和PAK1在腫瘤中同時上調(diào)，MET與KRAS、RAC1、PAK1和PAK2在腫瘤的轉(zhuǎn)錄和蛋白水平上也一致上調(diào)（圖5C）。有研究報道，MET/PAK1信號軸通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、運(yùn)動和細(xì)胞骨骼重塑來驅(qū)動胰腺致癌。
I類PAKs的另一個成員PAK2在近90%的腫瘤上調(diào)，并可能負(fù)責(zé)MAPK6-S189（圖5A-5C）的磷酸升高。磷酸化過程對MAPK6信號通路中MAPK6-PRAK復(fù)合物的形成至關(guān)重要，表明PAK2活性在調(diào)節(jié)與細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)的非典型MAPK信號通路中發(fā)揮重要作用。
擴(kuò)大磷蛋白組學(xué)分析范圍，包括正常胰管組織，結(jié)果表明在PDAC腫瘤中，I類PAKs和其他激酶及其底物的表達(dá)譜與NATs和/或正常胰管組織有本質(zhì)上的不同，表明這些蛋白是PDAC相關(guān)的激酶（圖5D、S5A-B）。
此外，通過評估不同KRAS熱點(diǎn)突變的腫瘤中相對于NATs的磷酸位點(diǎn)表達(dá)變化（圖S5C），作者進(jìn)一步分層了19個激酶（圖5E），包括7個FDA批準(zhǔn)的藥物靶點(diǎn)。這些不同的激酶表達(dá)模式提示了與特定KRAS突變相關(guān)的替代治療靶點(diǎn)。鑒于I類PAKs對PDAC的重要性，聯(lián)合抑制PAK1/2和KRAS下游通路，如MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR，可能會通過最大限度地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、運(yùn)動和對細(xì)胞骨架的信號傳導(dǎo)來增加治療效果。
6. 與內(nèi)皮細(xì)胞重塑、糖酵解和細(xì)胞連接失調(diào)有關(guān)的免疫冷PDACs
腫瘤和正常組織的分子分析的一個局限性是，它們不能完全剖析腫瘤內(nèi)在生物學(xué)和微環(huán)境動力學(xué)之間的相互作用。這種認(rèn)知差距對PDAC尤其重要，因為PDAC主要由腫瘤微環(huán)境特征驅(qū)動。本研究中，作者根據(jù)微環(huán)境細(xì)胞特征（主要是免疫浸潤程度）來對腫瘤進(jìn)行分類。使用基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的反卷積方法來劃分本研究中所有140個腫瘤樣本的細(xì)胞組成(包括低純度腫瘤)?；贒NA甲基化的反卷積進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)（圖6A、S6A-C）。根據(jù)腫瘤/基質(zhì)/免疫細(xì)胞組成，樣本被分為四個群組（圖6A）。
作者認(rèn)為，特別值得關(guān)注的是D群腫瘤，其CD8+T細(xì)胞浸潤程度較高，并伴隨著細(xì)胞毒酶和免疫檢查點(diǎn)分子的表達(dá)增加。作者將這一集群的樣本注釋為"免疫熱"腫瘤，這些病例的組織學(xué)檢查證實(shí)了與腫瘤成分相關(guān)的顯著炎癥浸潤(圖S6D)。然而，在一個病例（C3N-00303）中，免疫標(biāo)記很可能是收集的組織中包含了淋巴結(jié)的結(jié)果，突出了織學(xué)檢查在任何癌癥類型的研究中的重要性(圖S6E)。而集群A、B和C中的樣本幾乎沒有顯示免疫浸潤。由于集群A富含非腫瘤性的腺泡和胰島細(xì)胞，作者認(rèn)為只有集群B和C是真正的"免疫冷"腫瘤組（圖S6F）。
值得注意的是，內(nèi)皮細(xì)胞也富含免疫熱腫瘤（圖6B）。此外，細(xì)胞類型關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性（圖S6G）。據(jù)報道，內(nèi)皮細(xì)胞代表循環(huán)系統(tǒng)和腫瘤細(xì)胞之間的物理連接，內(nèi)皮細(xì)胞粘附蛋白對免疫細(xì)胞募集至關(guān)重要，并且在腫瘤相關(guān)血管系統(tǒng)中經(jīng)常下調(diào)，在此研究中免疫冷腫瘤內(nèi)皮粘附蛋白表達(dá)降低（圖6C）。同時，這些腫瘤也表現(xiàn)出VEGF和缺氧通路活性升高，這可以通過VEGF及其受體的表達(dá)以及推斷的通路活性來說明（圖6D）。VEGF和缺氧通路都是腫瘤發(fā)生過程中內(nèi)皮細(xì)胞重塑的重要途徑。綜上所述，這些結(jié)果支持了免疫冷態(tài)PDACs中內(nèi)皮細(xì)胞重塑和抑制免疫浸潤的關(guān)聯(lián)。
為了進(jìn)一步分析免疫冷表型背后的機(jī)制，作者使用RNA、蛋白和磷酸化數(shù)據(jù)進(jìn)行了通路分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫冷樣本的糖酵解水平較高（圖6E、S6H），包括負(fù)責(zé)生成和分泌乳酸的酶的富集，據(jù)報道乳酸是腫瘤微環(huán)境中已知的免疫抑制劑。此外，磷酸化特異性通路富集分析顯示，免疫冷樣本的細(xì)胞連接蛋白的磷酸化水平較高（圖S6I）而在轉(zhuǎn)錄組或蛋白組水平上沒有發(fā)現(xiàn)這種特征（圖6F）。
細(xì)胞連接蛋白在調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞對小分子的通透性和免疫細(xì)胞浸潤方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，細(xì)胞連接成分中的蛋白磷酸化失調(diào)可能代表了PDAC腫瘤中免疫排斥的一種機(jī)制。
這些數(shù)據(jù)共同表明，內(nèi)皮細(xì)胞重塑，伴隨著血管內(nèi)皮生長因子和缺氧通路的升高，糖酵解增加，以及細(xì)胞連接失調(diào)，可能共同抑制了免疫細(xì)胞的浸潤和功能（圖6G）。抑制這些生物過程，尤其是糖酵解和內(nèi)皮細(xì)胞重塑（這兩者是多種癌癥類型的積極靶點(diǎn)），可用于提高免疫冷型PDACs的抗腫瘤免疫功能。雖然CD8+T細(xì)胞浸潤是一個有利的預(yù)后標(biāo)志，但血管內(nèi)皮生長因子和缺氧通路信號的升高都與生存率下降有關(guān)（圖6H-I）。
7. 具有強(qiáng)烈預(yù)后功能的蛋白基因組亞型
作者將三種主要的基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的PDAC亞型策略應(yīng)用于整個腫瘤組，以探索樣本間異質(zhì)性(圖S7A)。與先前報道一致，一些分子分類明顯重疊，如ADEX (Bailey)和外分泌樣(Collisson)，經(jīng)典(Collisson)和胰腺祖細(xì)胞(Bailey)，以及鱗狀(Bailey)，準(zhǔn)間質(zhì)(Collisson)和基底樣(Moffitt)。值得注意的是，本研究隊列中的5個腺鱗癌樣本被分為鱗狀(Bailey)、準(zhǔn)間質(zhì)(Collisson)或基底樣(Moffit)組，這與對組織學(xué)上胰腺癌亞型的理解一致?；诜秦?fù)矩陣分解(NMF)的蛋白質(zhì)基因組學(xué)分型，使用來自所有140個腫瘤的多組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4個與RNA亞型顯著重疊的集群（圖S7B-C）。整個隊列的基于RNA和基于多組學(xué)的分型結(jié)果都嚴(yán)重受到腫瘤純度和細(xì)胞類型組成的干擾(圖S7B-G)。
為了減輕腫瘤純度對亞型劃分的影響，作者基于NMF的蛋白基因組學(xué)亞型限制在具有足夠具有高腫瘤細(xì)胞占比的的105個PDAC腫瘤上。這一分析揭示了兩個集群（C1和C2；圖7A）分別與Moffitt經(jīng)典亞型和Moffitt基底樣RNA亞型有顯著重疊。由于Moffitt亞型是通過使用腫瘤內(nèi)在基因簽名獲得的，兩種蛋白質(zhì)基因組亞型之間的差異更有可能反映腫瘤內(nèi)在生物信號，C2亞型與多種增殖信號通路活性升高和生存率降低相關(guān)(圖7B-C)。
盡管來自多組學(xué)數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)基因組亞型與僅來自RNA-seq數(shù)據(jù)的Moffitt亞型之間總體上一致，但22個腫瘤的分類是不一致的（圖7A-C）。11例Moffitt基底樣腫瘤被歸類為蛋白質(zhì)基因組經(jīng)典型，11例Moffitt經(jīng)典腫瘤被歸類為蛋白質(zhì)基因組基底樣型。有趣的是，根據(jù)蛋白質(zhì)基因組群分離Moffitt經(jīng)典腫瘤或基底腫瘤顯示了不同預(yù)后結(jié)果的趨勢（圖7D-E）。作者發(fā)現(xiàn)，在97個既有蛋白質(zhì)基因組學(xué)又有Moffitt分型的PDAC樣本中，蛋白質(zhì)基因組學(xué)-二分類亞型比Moffitt-二分類亞型顯示出更強(qiáng)的預(yù)后分離（圖7F-G）。作者進(jìn)一步分析了具有顯著的預(yù)后價值的392個蛋白和258個磷酸化蛋白，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)基因組學(xué)-二分類亞型（69%的蛋白質(zhì)和78%的磷酸化蛋白）比Moffitt-二分類亞型（39%的蛋白質(zhì)和38%的磷酸化蛋白）具有更顯著的差異。
為了對這兩個亞型進(jìn)行深入分析，作者將分子特征、激酶的磷酸化模式、糖基化酶和綜合蛋白基因組學(xué)提示的標(biāo)志物，與C1和C2亞型相關(guān)聯(lián)。C2亞型與圖5強(qiáng)調(diào)的大多數(shù)激酶的高表達(dá)有關(guān)。基因組富集分析顯示，化療藥物與C1（如多西他賽、乙烯利和卡巴他賽）和激酶抑制劑與C2（如PP-242、CP466722和舒尼替尼）有關(guān)聯(lián)，C1或C2亞型中預(yù)測的相應(yīng)藥物靶點(diǎn)的表達(dá)升高進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。例如，mTOR、AKT和ERK激酶表達(dá)的升高以及PP-242簽名在C2中的富集表明，mTOR可能是這些患者的潛在治療目標(biāo)。
本研究的二分類蛋白質(zhì)基因組學(xué)分型只集中在105個具有足夠腫瘤純度的樣本，以便更好地理解腫瘤內(nèi)在生物學(xué)。另一方面，免疫/微環(huán)境特征使用了所有140個樣品，因為免疫熱樣品通常具有較低的腫瘤純度（圖S7I）。當(dāng)140個樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)基因組分型時，觀察到4個亞型（圖S7B）。有趣的是，9個免疫熱樣本中的8個組成了C4亞型的子集（圖S7I），這與Moffitt經(jīng)典亞型顯著重疊（圖S7B-C）。通過進(jìn)一步將微環(huán)境/免疫分析結(jié)果與胰腺癌相似方面的研究進(jìn)行比較，作者發(fā)現(xiàn)免疫熱樣本的微環(huán)境特征更有利于免疫細(xì)胞浸潤（圖S6D）。
總之，這些結(jié)果支持整合蛋白基因組分型與患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。在預(yù)后不良的蛋白質(zhì)基因組基底樣亞型中（圖7B），對過度激活的增殖和信號通路進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗研究可能有助于開發(fā)亞型特異性治療策略。
討論
本文中，作者描述了PDAC的全面蛋白質(zhì)基因組研究，整合了多基因組特征，從而有助于深入了解基因組和表觀基因組擾動對基因和蛋白質(zhì)表達(dá)以及PTMs的影響。
為了確保PDACs與成對匹配的NATs和正常的導(dǎo)管組織比較結(jié)果的可靠性，作者利用分子學(xué)、組織學(xué)和計算機(jī)算法，來注釋隊列中腫瘤的腫瘤細(xì)胞占比和正常組織的高細(xì)胞含量，其主要目的是使分析中只包括高質(zhì)量的樣本（圖1和2），這種方法有力地識別了早期檢測、診斷或治療干預(yù)的潛在靶標(biāo)（圖3、4、5、6和7）。作者驗證了KRAS是PDAC的主要驅(qū)動基因（圖1和2），與先前報道一致。然而針對KRAS蛋白本身的治療已經(jīng)失敗，因為它的表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)光滑，缺乏安全藥物結(jié)合的疏水口袋，導(dǎo)致除了化合物MRTX849之外，獲批的KRAS特異性藥物很少，而且只有不到1%的PDAC患者身上攜帶了KRAS G12C突變。
比較具有不同熱點(diǎn)KRAS突變的腫瘤的糖蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)攜帶G12D、G12V和Q61H突變的PDAC樣本中，CEACAM5和CEACAM6顯著上調(diào)，但是攜帶G12R突變的樣本無此變化（圖4B）。CEACAM5和CEACAM6屬于免疫球蛋白超家族；通過與其他同源或異源蛋白結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞粘附；并保護(hù)腫瘤細(xì)胞不發(fā)生失巢凋亡；雖然抗CEACAM5/6單克隆抗體（mAbs）對正常組織的影響仍有待確定，但mAbs MN-15和MN-3可以通過減少腫瘤細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附而阻礙轉(zhuǎn)移。 因此，抗CEACAM5/6藥物與一線化療相結(jié)合，可能會使攜帶KRAS G12D、G12V和/或Q61H突變的PDACs患者受益；另外，抑制KRAS持續(xù)激活導(dǎo)致的關(guān)鍵下游目標(biāo)和節(jié)點(diǎn)是 PDAC 治療的一個有吸引力的策略。
MAPK/ERK和PI3K/AKT/mTOR通路是PDAC治療干預(yù)的主要目標(biāo)，每條通路的多種抑制劑都可以在臨床上使用。作者對蛋白質(zhì)組學(xué)和磷蛋白質(zhì)組學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，本研究大多數(shù)PDAC中，PAK1/PAK2激酶被上調(diào)（圖5），這些激酶已被報道為介導(dǎo)細(xì)胞骨架運(yùn)動、增殖和生存的重要信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)因子/調(diào)控因子。PAK1/PAK2位于腫瘤基因KRAS的下游，其抑制劑有可能成為靶向KRAS的新途徑，并可能與靶向典型KRAS下游MAPK/ERK和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT/mTOR通路的抑制劑結(jié)合。
PDAC的特點(diǎn)是高度抑制性的腫瘤微環(huán)境，對于大多數(shù)患者來說，細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤內(nèi)浸潤很低。盡管針對細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原-4（CTLA-4）和程序性細(xì)胞死亡蛋白-1（PD-1）的免疫療法使幾種實(shí)體惡性腫瘤患者明顯受益，但除了占PDACs<2%的微衛(wèi)星穩(wěn)定性高的腫瘤，它們對PDACs患者無效。人們對PDAC中免疫激活的決定因素知之甚少，幾乎沒有提供治療指導(dǎo)。為了剖析腫瘤微環(huán)境，作者利用多組學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與VEGF和缺氧通路活動上調(diào)相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞的缺失，反過來又與免疫冷腫瘤中的免疫細(xì)胞排斥有關(guān)（圖6）。通過血管生成療法（如索拉非尼和NGR-TNF）將腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞重塑成正常的內(nèi)皮細(xì)胞表型，可以實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子上調(diào)，并可能促進(jìn)腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞滲透。低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是胰腺腫瘤中低氧微環(huán)境的主要效應(yīng)器，并誘導(dǎo)細(xì)胞代謝進(jìn)入糖酵解模式。因此，針對HIF-1活性靶向的方法，如防止HIF1-α和HIF1-β亞基相互作用的小分子，也可能對胰腺免疫冷腫瘤有益。
N-連接糖基化發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，由一系列糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的活性介導(dǎo)。在各種實(shí)體惡性腫瘤(包括PDAC)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了水楊酸糖蛋白的異常表達(dá)，并與侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，PDAC中大多數(shù)上調(diào)的N-鏈接糖蛋白是由水楊酸糖修飾的，與PDAC中ST6GAL1和ST3GAL1相對于NAT的上調(diào)一致（圖4）。這些腫瘤上調(diào)的N-鏈接糖蛋白與參與PDAC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的重要信號通路有關(guān)（圖S4B）。因此，用更具選擇性的抑制劑來抑制這些水楊酸轉(zhuǎn)移酶，可能會通過廢除這些N-鏈接糖蛋白的功能來減弱PDAC細(xì)胞的生長、存活和轉(zhuǎn)移。
該研究表明，通過在多個組學(xué)水平上描述疾病狀態(tài)，可獲得獨(dú)特和有用的見解，從而使人們能夠更深入地理解與PDAC相關(guān)的基因組畸變的功能后果。整合轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、磷蛋白組和糖蛋白組的檢測，以及PDACs、NATs和正常導(dǎo)管的比較分析，能夠檢測出與早期PDAC相關(guān)的蛋白形態(tài)，并確定可能在臨床上找到的潛在治療靶點(diǎn)。總之，本研究描繪了驅(qū)動PDAC表型的分子特征，并為未來的研究提供了豐富的生物信息源。
亮點(diǎn)
-蛋白基因組學(xué)特征揭示了基因組改變的功能影響
-磷蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了KRAS下游的潛在的治療靶標(biāo)
-多組學(xué)將內(nèi)皮細(xì)胞重塑和糖酵解與免疫排斥聯(lián)系起來
-蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)找到用于早期檢測或干預(yù)的候選標(biāo)志物
局限性
本研究的目的是利用多組學(xué)技術(shù)全面描述PDAC腫瘤和NATs，并提供蛋白質(zhì)基因組特征，解讀基因組改變對基因表達(dá)、蛋白質(zhì)豐度和PTMs的影響。因為臨床蛋白質(zhì)組學(xué)腫瘤分析聯(lián)盟(CPTAC)項目收集的組織是未經(jīng)治療和手術(shù)切除的。所以，本研究在數(shù)據(jù)選擇上存在固有的局限性。
第一，雖然作者尋找了患者輔助治療的數(shù)據(jù)，但目前的隊列是未接受治療的樣本，這限制了對采用全身治療的轉(zhuǎn)移性疾病的外推，并且目前臨床試驗產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是有限的。
第二，蛋白質(zhì)基因組數(shù)據(jù)為關(guān)聯(lián)不同的分子改變提供了豐富的資源，這對于生成假說、破譯分子功能或預(yù)測治療方案至關(guān)重要。然而，該相關(guān)性的因果效應(yīng)無法從本研究中確定。生物學(xué)假設(shè)或治療預(yù)測需要使用細(xì)胞系，患者來源的異種移植(PDX)模型，或臨床試驗進(jìn)行進(jìn)一步的驗證。
第三，本研究的蛋白質(zhì)基因組測量使用了大塊腫瘤和NAT組織，在這些組織中，無法充分考慮異質(zhì)性對細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的影響。本研究中，作者選擇那些具有足夠腫瘤細(xì)胞的組織樣本進(jìn)行分析來解決這一限制。然而，如果能夠采用激光捕獲顯微解剖測序(LCM-seq)或單細(xì)胞測序?qū)M織進(jìn)行表征，結(jié)果將更加精確。
