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近年來miRNA研究慢慢陷入低谷期，進(jìn)入深水區(qū)，如果沒有特別亮眼的研究，很難沖刺高分。今天就跟著小編一起來看看一篇 2022年2月發(fā)表在Molecular Cancer（IF：27.401）上的文章如何“炒冷飯”，將自測數(shù)據(jù)結(jié)合 miRNA signature沖上 27+的，讓我們一起解開miRNA研究新套路。
一、研究背景
食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC）的預(yù)后效果較差，原因在于食道中存在廣泛的淋巴網(wǎng)絡(luò)，再加上缺乏保護(hù)性血清，導(dǎo)致侵襲性早期區(qū)域腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，并且在早期階段，ESCC患者通常無癥狀，導(dǎo)致診斷延遲。目前尚無臨床相關(guān)的無創(chuàng)生物標(biāo)志物可用于食管鱗狀細(xì)胞癌早期發(fā)現(xiàn)。
miRNA已被公認(rèn)為有前途的非侵入性生物標(biāo)志物候選，這主要是由于它們的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和循環(huán)中的豐度。然而，盡管已經(jīng)提出幾種單獨(dú)的循環(huán)miRNA用于ESCC診斷，但它們的臨床翻譯潛力仍然值得懷疑。
故本研究旨在使用系統(tǒng)的全轉(zhuǎn)錄組miRNA表達(dá)譜分析，建立并評估了一種基于循環(huán)miRNA的標(biāo)記，用于早期檢測ESCC。
作者的研究設(shè)計(jì)包括五個主要階段：計(jì)算機(jī)發(fā)現(xiàn)階段，組織驗(yàn)證階段，回顧性血清生物標(biāo)志物優(yōu)先排序階段，回顧性血清訓(xùn)練和驗(yàn)證階段，以及前瞻性血清訓(xùn)練和驗(yàn)證階段，通過使用 7 個獨(dú)立、回顧性和前瞻性、跨國、多中心隊(duì)列整合轉(zhuǎn)錄組范圍的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)和臨床驗(yàn)證，建立了一種新穎的、非侵入性的、基于 miRNA 的特征。
二、結(jié)果
1、鑒定可將 ESCC 與正常粘膜區(qū)分開來的 18-miRNA
在計(jì)算及發(fā)現(xiàn)階段，作者使用三個基于組織的全轉(zhuǎn)錄組miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集（TCGA ESCC，GSE55856和GSE43732）來發(fā)現(xiàn)強(qiáng)大的miRNA候選物。作者評估m(xù)iRNA是潛在的候選者的標(biāo)準(zhǔn)如下：
（1）在ESCC和正常組織之間差異表達(dá)（標(biāo)準(zhǔn)：log2 FC >0.5，F(xiàn)DR調(diào)整后的p<0.05）;
（2）區(qū)分ESCC和正常標(biāo)本（標(biāo)準(zhǔn)：AUC>0.7）;
（3）在ESCC中上調(diào)，具有相對較高的表達(dá)，以利于血清樣品中的檢測（標(biāo)準(zhǔn)：平均表達(dá)>所有差異表達(dá)的miRNA的中位平均表達(dá)）。
由此從每個數(shù)據(jù)集中鑒定出癌癥組織中明顯過表達(dá)的miRNA（圖1A-C），并通過overlap分析選出18個候選miRNA（圖1D）。
主成分分析表明，這些miRNA導(dǎo)致ESCC患者和健康個體之間形成不同的簇，這表明這些miRNA可用于區(qū)分ESCC患者。
為了評估 18-miRNA 的診斷潛力，作者采用了雙管齊下的策略。 首先，在每個數(shù)據(jù)集中，使用 2 倍交叉驗(yàn)證（重復(fù) 100 次）進(jìn)行多元logistics回歸，以證明特征的診斷性能（平均 AUC = 0.98、0.99、0.98；圖 2）。
其次，在 GSE55856 數(shù)據(jù)集上訓(xùn)練了一個多元logistics回歸模型，然后將相同的統(tǒng)計(jì)模型應(yīng)用于所有三個數(shù)據(jù)集，以進(jìn)一步驗(yàn)證和確認(rèn) 18-miRNA 特征的診斷性能（AUC = 0.99、1.00、0.99）。
接下來，為了確定這些候選miRNA的功能意義，作者基于從 miRTarBase 數(shù)據(jù)庫 (V8) 獲得的經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的 miRNA-靶標(biāo)相互作用構(gòu)建了 miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?？偟膩碚f，作者根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)在TCGA數(shù)據(jù)集中鑒定出393個在腫瘤和正常樣品之間差異表達(dá)的基因：|log2 FC| > 2和BH-adjust p < 0.01。
2、ESCC患者回顧性隊(duì)列血清中8-miRNA循環(huán)特征的訓(xùn)練和驗(yàn)證
由于作者要開發(fā)一種非侵入性液體活檢方法，故接下來作者檢查了基于組織的18-miRNA組合在基于血清的生物標(biāo)志物優(yōu)先排序隊(duì)列中的轉(zhuǎn)化潛力的診斷性能。在18個miRNA中，與健康對照組相比，ESCC患者的血清中有8個miRNA（miR-103，miR-106b，miR-151，miR-17，miR-181a，miR-21，miR-25和miR-93）在ESCC患者的血清中顯著上調(diào)（p <0.05，student t-tests）。
由此將研究重點(diǎn)放在8個上調(diào)的miRNA候選物。作者首先采用logistics回歸推導(dǎo)出風(fēng)險(xiǎn)評分公式，再使用該風(fēng)險(xiǎn)公式和來自血清訓(xùn)練隊(duì)列的Youden指數(shù)（0.582）作為臨界閾值，以區(qū)分高危和低危人群，通過AUC和相應(yīng)的95%置信區(qū)間，敏感性和特異性評估了該8-miRNA在訓(xùn)練隊(duì)列中的診斷性能（圖3A）（AUC為0.83（95%CI，0.79-0.87），靈敏度為78%，特異性為75%）。緊接著在另外兩個獨(dú)立的患者隊(duì)列評估其性能，與血清訓(xùn)練隊(duì)列一致，循環(huán) miRNA signature在兩個血清驗(yàn)證隊(duì)列中都取得了穩(wěn)健的表現(xiàn)（圖3B-C）。
接下來，作者使用血清驗(yàn)證隊(duì)列2，比較了8-miRNA signature與經(jīng)典的腫瘤標(biāo)記物——鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(SCC-Ag)在ESCC患者中的診斷性能。結(jié)果表明，8-miRNA在區(qū)分所有疾病階段的ESCC患者方面顯著優(yōu)于SCC-Ag（圖3D）。
上述結(jié)果已經(jīng)證實(shí)了8-miRNA對ESCC早期診斷測定的潛力，但其是否對ESCC而不是其他癌癥類型具有診斷特異性尚未明確。
因此作者進(jìn)一步使用公共血清miRNA數(shù)據(jù)集評估了8-miRNA在其他主要惡性腫瘤（包括結(jié)直腸癌，前列腺癌，肺癌和乳腺癌）中的診斷性能。
將8-miRNA的評分公式應(yīng)用于這些數(shù)據(jù)集，并評估了每種癌癥類型中區(qū)分癌癥患者和健康對照組的診斷性能。與ESCC相比，其他癌癥類型中8-miRNA的AUC值顯著降低。
總的來說，這些數(shù)據(jù)支持 8-miRNA 特征的診斷功效，以及它在檢測早期 ESCC 方面的潛力。
3、在兩個獨(dú)立的前瞻性 ESCC 患者隊(duì)列中驗(yàn)證循環(huán) miRNA 特征的診斷性能
為了驗(yàn)證其臨床效果，故作者在兩個隨機(jī)的前瞻性ESCC患者隊(duì)列中檢查了其性能。
作者使用qRT-PCR測定，以評估兩個血清標(biāo)本（分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集）中8-miRNA特征的表達(dá)，構(gòu)建logistics回歸分析，結(jié)果表明，8-miRNA特征在區(qū)分ESCC患者和健康對照的能力方面顯著優(yōu)于單個miRNA（訓(xùn)練集AUC=0.92，驗(yàn)證集AUC=0.93）。
此外作者進(jìn)行了單變量和多變量分析，以確認(rèn)循環(huán)miRNA特征是檢測所有階段的ESCC患者以及特異性I期患者的唯一重要預(yù)測因子。
最后驗(yàn)證了8-miRNA的成本效益。由于I-IV期ESCC患者的診斷風(fēng)險(xiǎn)評分顯著升高（所有p<0.001，單側(cè)Student’s t-tests），作者檢查了8-miRNA用于識別高級別上皮內(nèi)瘤變患者的診斷性能。
結(jié)果表明8-miRNA能夠識別患有高級別上皮內(nèi)瘤變（n = 13，p<0.01，單側(cè)Student’s t-tests；圖 5）。然而，與健康對照組相比，低級別上皮內(nèi)瘤變（n = 8）或食管炎（n = 6）患者的風(fēng)險(xiǎn)評分沒有顯著變化。因此循環(huán)miRNA特征可能用于早期檢測高風(fēng)險(xiǎn)的癌前病變。
三、討論
在三個基于組織的全轉(zhuǎn)錄組miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)強(qiáng)大的miRNA候選物，再采用qRT-PCR評估了候選miRNA的表達(dá)水平，構(gòu)建了miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，使用多變量logistics回歸評估其診斷性能，再輔以血清驗(yàn)證隊(duì)列和臨床樣本驗(yàn)證，評估其臨床效果及進(jìn)行成本效益分析，采用全面的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)過程，這思路也是絕了！
參考文獻(xiàn)
[1] Miyoshi, J., Zhu, Z., Luo, A. et al. A microRNA-based liquid biopsy signature for the early detection of esophageal squamous cell carcinoma: a retrospective, prospective and multicenter study. Mol Cancer 21, 44 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01507-x
