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肺癌耐藥機(jī)制的多組學(xué)分析
肺癌是一種高風(fēng)險(xiǎn)惡性腫瘤。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的突變使EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)成為一個(gè)有吸引力的治療選擇。然而，患者通常會(huì)對(duì)EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥性并影響腫瘤的免疫浸潤(rùn)，導(dǎo)致患者生存不良。而其分子變異尚不完全清楚，需要進(jìn)一步研究。今天小編給大家分享一篇2022年2月2日發(fā)表在Journal of Inflammation Research（IF：6.922）上的文章，看看這篇文章是如何利用多組學(xué)分析來(lái)研究肺癌的耐藥機(jī)制的吧！
研究背景
肺癌是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，約 80% 的肺癌為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。晚期 NSCLC 的治療效果并不理想，但是有研究發(fā)現(xiàn)EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)在無(wú)進(jìn)展生存期和緩解率方面優(yōu)于化療。TKI和化療聯(lián)合使用可能會(huì)進(jìn)一步提高肺癌的總體生存率。然而，患者在服用 TKI 約 9 到 14 個(gè)月后會(huì)出現(xiàn)耐藥性。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與耐藥相關(guān)的改變，但1代或2代 EGFR-TKI的耐藥機(jī)制（吉非替尼、阿法替尼等）仍不完全清楚。因此，迫切需要一些新的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)EGFR-TKI耐藥性，并促進(jìn)臨床實(shí)踐中的最佳治療選擇。
腫瘤微環(huán)境中與癌癥相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可能導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和治療抵抗。 EGFR-TKI可以調(diào)節(jié)EGFR突變的NSCLC患者的腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，治療后的腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著降低。 這種變化可能與EGFR-TKI耐藥有關(guān)，并為免疫檢查點(diǎn)抑制劑等后續(xù)治療提供線索。
因此，本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)探索是否存在與第一代和第二代EGFR-TKI耐藥、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和SCLC轉(zhuǎn)化相關(guān)的差異表達(dá)基因(DEGs)。并且為克服對(duì)EGFR-TKI的耐藥性提供新的見(jiàn)解。研究工作流程如圖 1 所示。
圖1：研究流程圖。
結(jié)果
TKI抗性差異表達(dá)基因（DEGs）的鑒定
作者在三套GEO數(shù)據(jù)集中一共識(shí)別出107個(gè)EGFR-TKI抗性versus EGFR-TKI敏感性的DEGs（圖2A）。
圖2
DEGs的GO和KEGG通路富集分析
結(jié)果表明，DEGs主要富集于細(xì)胞粘附、細(xì)胞外基質(zhì)組織、正向調(diào)控GTPase活性、負(fù)向調(diào)控細(xì)胞增殖和生物過(guò)程的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞成分在細(xì)胞外泌體、質(zhì)膜、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞外區(qū)域和質(zhì)膜的整體成分中顯著富集(圖2B-a)。而DEGs的KEGG通路分析顯示，它們與細(xì)胞粘附分子、病灶粘附、PI3K-Akt信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等相關(guān)(圖2B-b)。
DEGs的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)
作者利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，并在Cytoscape中可視化。利用MCODE提取了四個(gè)關(guān)鍵模塊; 基因之間的相關(guān)性越大，圓圈越大，顏色越深(圖2C)。作者發(fā)現(xiàn)在厄洛替尼和吉非替尼耐藥譜中CD44和FYN的表達(dá)均降低，而在阿法替尼耐藥譜中升高。
Hub基因的表達(dá)與生存分析
接下來(lái)，作者分析了Hub基因在GEPIA上的表達(dá)水平。與正常組織相比，RAB25、ERBB2、SPP1、CDH1、ESRP1、ITGB4在肺腺癌組織中的表達(dá)水平顯著升高，ZEB1、FYN的表達(dá)水平顯著降低(圖3A)。與高表達(dá)的SPP1和ITGB4相比，低表達(dá)的SPP1和ITGB4在LUAD和LUSC患者中與更好的總生存相關(guān)。另一方面，與低表達(dá)相比，同時(shí)高表達(dá)的SPP1和ZEB1與LUAD和LUSC患者的總生存期較差相關(guān)(圖3B)。因此，作者認(rèn)為SPP1對(duì)NSCLC的生存具有重要意義。
圖3
SPP1在泛癌組織中的表達(dá)及預(yù)后潛力
接下來(lái)，作者研究了SPP1在泛癌中的表達(dá)。SPP1在多種腫瘤組織中表達(dá)明顯高于其同源正常組織(圖4A)。根據(jù)組織芯片對(duì)SPP1蛋白的染色，SPP1主要位于細(xì)胞質(zhì)中。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，肺腺癌腫瘤細(xì)胞中染色為中度，正常肺組織細(xì)胞中是低染色(圖4B)。作者還比較了EGFR突變體、野生型肺腺癌和TCGA正常樣本中SPP1的表達(dá)。與其他兩種類型相比，EGFR突變型肺腺癌中SPP1的表達(dá)水平顯著升高(圖4C)。
圖4
根據(jù)SPP1的表達(dá)水平，作者將EGFR突變的肺腺癌患者分為四組：0-25 %組，25%-50%組，50%-75%組和75%-100%組 (圖5A)。其中，最低表達(dá)組的DSS最長(zhǎng)。25%-50%組和50%-75%組的中位生存時(shí)間分別為3.8年和3.2年(圖5B)。3年ROC曲線的AUC為0.762(圖5C)。因此，SPP1的表達(dá)水平可能是EGFR突變型肺腺癌的預(yù)后因素。
圖5
EGFR突變/野生型和TKI耐藥群體的免疫景觀
作者通過(guò)TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析了與肺腺癌預(yù)后hub基因表達(dá)相關(guān)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)程度。 發(fā)現(xiàn)SPP1的表達(dá)與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的浸潤(rùn)呈正相關(guān)（圖 6A）。 xCell 結(jié)果顯示，與野生型相比，具有 EGFR 突變的肺腺癌患者的 CD8+ T 細(xì)胞和 CD4+ Th2 的豐度較低（圖 6B）。與低表達(dá)相比，SPP1 高表達(dá)的肺腺癌患者的巨噬細(xì)胞 M1 和 CD4+ Th2 細(xì)胞較多，而 CD8+ T 細(xì)胞較少（圖 6C）。這些結(jié)果可能表明 SPP1 可以調(diào)節(jié)腫瘤免疫耐受和免疫逃逸。
圖6
免疫浸潤(rùn)景觀如圖 7A 所示。在圖 7B 中，兩類免疫能力（抗腫瘤免疫和促腫瘤抑制）呈正相關(guān)（R=0.5438，P<0.001）。作者還發(fā)現(xiàn)效應(yīng)記憶 CD4 T 細(xì)胞、NK T 細(xì)胞、MDSC（髓源性抑制細(xì)胞）和 Th2 T 細(xì)胞中度或高度相關(guān)（圖 7C）。作者在每種免疫細(xì)胞中分別比較了厄洛替尼敏感和耐藥樣本之間的差異。發(fā)現(xiàn)與敏感組相比，耐藥組中的 CD8+ T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞較少，而 CD4+ T 細(xì)胞則更多（圖7D）。
圖7
SPP1與免疫細(xì)胞在肺腺癌中的預(yù)后分析
作者根據(jù)相關(guān)免疫細(xì)胞富集或耗盡的肺腺癌亞組中SPP1的表達(dá)進(jìn)行了預(yù)后分析(圖8A)。研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平如何，SPP1高表達(dá)的LUAD患者預(yù)后明顯較差。提示SPP1可能是不同免疫浸潤(rùn)LUAD的有效預(yù)后指標(biāo)。
泛癌組織中SPP1與TMB/MSI的共表達(dá)
作者發(fā)現(xiàn)PD-L1 (CD274)與SPP1之間呈現(xiàn)正相關(guān)（圖8B）。此外，作者通過(guò)對(duì)SPP1表達(dá)和TMB/MSI的分析發(fā)現(xiàn)，SPP1不僅在LUAD中與TMB和MSI密切相關(guān)，還與其他腫瘤相關(guān)。在DLBC、THYM、SARC、ACC和PRAD中，SPP1的表達(dá)與高TMB相關(guān)(圖8C)。另一方面，在LUAD和LUSC中SPP1與MSI呈負(fù)相關(guān)。在結(jié)腸癌（COAD）、腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）、肉瘤（SARC）、直腸癌（READ）和睪丸癌（TGCT）中，SPP1與MSI呈高相關(guān)性(圖8D)。
SCLC轉(zhuǎn)化共表達(dá)RNA-miRNA網(wǎng)絡(luò)
由于SCLC轉(zhuǎn)化也是EGFR-TKI耐藥的原因之一。作者比較了SCLC和TKI耐藥的DEGs，發(fā)現(xiàn)有42個(gè)基因在兩種基因圖譜中共同表達(dá)。CD44、MUC1、ESRP1、SPP1和ZEB1均為SCLC和TKI耐藥的中心基因(圖8E)。作者還發(fā)現(xiàn)hsa-miR-495-3p、hsa-miR-24-3p、hsa-miR-181a- 5p和hsa-miR-125a-3p通過(guò)疾病miRNAs網(wǎng)絡(luò)與SCLC和NSCLC均相關(guān)。同時(shí)，5個(gè)hub基因被預(yù)測(cè)為這些miRNAs的靶基因(圖8F)。
圖8
甲基化預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的建立和評(píng)價(jià)
接下來(lái)，作者比較了正常與LUAD患者SPP1表達(dá)及DNA甲基化情況。與正常組織相比，LUAD中SPP1表達(dá)較高，啟動(dòng)子甲基化水平較低(圖9A)。SPP1啟動(dòng)子的高甲基化代表基因表達(dá)降低。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型包括5個(gè)中心基因(CD44、MUC1、ESRP1、SPP1和ZEB1)的CpGs。單因素和多因素分析顯示，LUAD患者SPP1 CpG cg00088885和CD44 CpG cg20971158與OS顯著相關(guān)(圖9B和C)，作者發(fā)現(xiàn)，z-score較低的患者通常比z-score較高的患者有更好的預(yù)后(圖9D-a)。根據(jù)多因素比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，將患者分為高危組和低危組，發(fā)現(xiàn)低危組生存獲益更好(圖9D-b)。
圖9
TKIs敏感性與SPP1相關(guān)
利用Cell Miner數(shù)據(jù)，作者獲得了60種不同人類癌細(xì)胞的SPP1表達(dá)水平。大多數(shù)癌細(xì)胞的Z值低于0，即SPP1高表達(dá)，對(duì)藥物具有耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)SPP1基因表達(dá)時(shí)，除肺癌之外，乳腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、黑素瘤等其他類型的癌癥也對(duì)TKIs具有耐藥性。
SPP1在EGFR突變型肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)水平
最后，作者收集了13個(gè)LUAD組織和8個(gè)癌旁組織，檢測(cè)SPP1在EGFR突變LUAD中的表達(dá)。qRT-PCR分析顯示，與相鄰正常組織相比，EGFR-突變LUAD組織中SPP1表達(dá)明顯升高(P=0.0188)(圖9E)。
結(jié)論
綜上所述，EGFR-TKI耐藥是肺癌靶向治療的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。該研究的結(jié)果表明，SPP1上調(diào)可能誘導(dǎo)對(duì)第1代和第2代EGFR-TKIs的耐藥性，并且SPP1可能被視為TKI治療的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。此外，SPP1的高表達(dá)可能促進(jìn)抗腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，在這種情況下可以考慮ICIs治療。同時(shí)，SPP1和CD44的DNA甲基化可能是肺腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。此外，5個(gè)hub基因可能通過(guò)調(diào)控EGFR-TKI耐藥的腫瘤干細(xì)胞促進(jìn)LUAD向SCLC的轉(zhuǎn)化。
參考文獻(xiàn)
1. Wang, Z., Zhang, L., Xu, W., Li, J., Liu, Y., Zeng, X., Zhong, M. and Zhu, Y. (2022) The Multi-Omics Analysis of Key Genes Regulating EGFR-TKI Resistance, Immune Infiltration, SCLC Transformation in EGFR-Mutant NSCLC. J Inflamm Res, 15, 649-667.
