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近年來，腫瘤分子分型目前作為國家精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略的重點(diǎn)研究投入方向，也備受各大頂尖期刊的青睞，且相關(guān)研究多次產(chǎn)出高分文章，腫瘤分子的分型也重新定義了對這種癌癥的進(jìn)一步研究，包括發(fā)展模型，改善診斷和預(yù)后，以及確定更具體的治療方法。所以，這樣的文章很難不火，接下來就和小編一起來解讀一篇今年9月22日發(fā)表在《nature communication》上的一篇關(guān)于多組學(xué)研究識別視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤亞型的文章，希望為大家的課題提供思路，少畫餅干實(shí)事！
摘要:
視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤是一種罕見的兒童視網(wǎng)膜癌，發(fā)病率約為17000例活產(chǎn)兒中1例，但它是最常見的兒童眼內(nèi)惡性腫瘤。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的主要治療目標(biāo)是通過早期發(fā)現(xiàn)和治療、防止轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散，首先挽救兒童的生命。我們通過對102例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)錄組、甲基組和DNA拷貝數(shù)改變數(shù)據(jù)的綜合分析，確定了與不同臨床和病理特征(診斷時(shí)的年齡、側(cè)變性、遺傳和生長模式)相關(guān)的兩種亞型。多組學(xué)方法的使用使我們可靠地鑒定了兩種主要的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分子亞型。同時(shí)，這兩種亞型不同的分子、病理和臨床特征突出了這種分類的相關(guān)性，與亞型2腫瘤相關(guān)的高干性和神經(jīng)元特征將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與新興的癌癥研究領(lǐng)域聯(lián)系起來，為治療開辟了新的機(jī)會(huì)。
結(jié)果：
兩種具有明顯臨床和病理特征的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分子亞型的鑒別
研究人員分析了102個(gè)去核的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，為了研究不同的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分子亞型的存在，研究人員結(jié)合了3種基因組方法，mRNA表達(dá)，DNA甲基化和體細(xì)胞拷貝數(shù)改變。在這三個(gè)組學(xué)數(shù)據(jù)集中，計(jì)算樣本的多個(gè)分區(qū)k集群（圖a）,針對各種k值,通過無監(jiān)督層次聚類，大多數(shù)腫瘤可歸屬于兩個(gè)亞型之一(38/亞型1,58/亞型2)。然后比較了這兩個(gè)亞型的臨床和病理特征發(fā)現(xiàn)，亞型1腫瘤患者在診斷時(shí)明顯更年輕(中位年齡=11.0 vs 23.9)。并且視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤通常表現(xiàn)為外生性生長(進(jìn)入視網(wǎng)膜下間隙)，內(nèi)生生長(向玻璃體方向)，或較少見的混合生長模式(內(nèi)生和外生性)。亞型1腫瘤明顯更多是外生的，而亞型2腫瘤大部分是內(nèi)生的。亞型2腫瘤中壞死區(qū)域比亞型1腫瘤中更常見。腫瘤直徑和組織學(xué)危險(xiǎn)特征(視神經(jīng)侵犯、脈絡(luò)膜或鞏膜侵犯)在兩種亞型之間沒有顯著差異。
亞型2比亞型1對比，表現(xiàn)出更多的遺傳改變
研究人員研究了這兩種腫瘤亞型的基因組特征，通過確定它們的人類體細(xì)胞突變譜，除了視神經(jīng)母細(xì)胞瘤常見的1q, 2p (MYCN)， 6p, 13q的增加和13q (RB1)以及16q的損失/缺失（圖a），在亞型2中我們可以明顯的觀察到1q增益、2p增益和16q損失/LOH在亞型2樣本中明顯更頻繁(圖a)。MYCN擴(kuò)增從拷貝14到拷貝246不等。且在排除MYCN擴(kuò)增時(shí)，亞型2拷貝數(shù)變異的基因組比例顯著高于亞型1（圖b）。全外顯子測序檢測到的亞型2的體細(xì)胞突變數(shù)量顯著高于亞型1(圖c)。由于RB1、BCOR和ARID1A三個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)反復(fù)突變。所以研究人員對31個(gè)缺乏全外顯子測序數(shù)據(jù)的樣本中的23個(gè)進(jìn)行了這三個(gè)基因的靶向測序。RB1、bbcor、ARID1A突變、MYCN擴(kuò)增、1q增益和16q損失的分布如圖中的亞型所示。無論其亞型如何，大多數(shù)腫瘤均存在RB1突變，且兩種腫瘤亞型間突變類型無差異。值得注意的是，亞型2發(fā)現(xiàn)了一個(gè)沒有RB1改變的腫瘤，并顯示了高水平的MYCN擴(kuò)增(141拷貝)。BCOR突變僅在亞型2中發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)ARID1A突變也是如此。大多數(shù)沒有MYCN擴(kuò)增的亞型2腫瘤表現(xiàn)出1q的增加和16q的損失。相比之下，除一例MYCN擴(kuò)增腫瘤外，沒有一例MYCN擴(kuò)增腫瘤有1q增益或16q損失（圖d）。CpG島(CpG island)：CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區(qū)段，CpG保持或高于正常概率。CpG島主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島。CpG島的GC含量大于50%，長度500~1000bp。在圖e中，顯示了6607個(gè)差異甲基化cpg的熱圖。與亞型1相比，亞型2腫瘤在CpG島內(nèi)表現(xiàn)出更頻繁的高甲基化，在CpG島外表現(xiàn)出更頻繁的低甲基化，4種mycn擴(kuò)增的亞型2腫瘤在CpG島外表現(xiàn)為低甲基化，而在CpG島內(nèi)不表現(xiàn)為高甲基化（圖f）。
這兩種亞型在錐體和神經(jīng)節(jié)/神經(jīng)元標(biāo)記的表達(dá)和干性特征的表達(dá)上存在差異
研究人員比較了兩個(gè)亞型的轉(zhuǎn)錄組。幾乎有三分之一的基因在兩個(gè)亞型之間有錐體差異表達(dá)，錐體標(biāo)記物在亞型1腫瘤中過表達(dá)，而神經(jīng)元/神經(jīng)節(jié)標(biāo)記物在亞型2腫瘤中過表達(dá)(圖a)。在已知參與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的基因中，有31個(gè)被發(fā)現(xiàn)在兩種亞型之間有差異表達(dá)，這些基因中的一些位于擴(kuò)增/擴(kuò)增區(qū)(KIF14和MDM4位于1q32.1, MYCN位于2p24.3)，或丟失(RBL2位于16q12.2)染色體區(qū)域，而其他基因則參與MYC/MYCN通路(MIR17HG, SKP2)。通過對6207個(gè)基因進(jìn)行層次聚類分析，確定了3個(gè)主要基因簇:2個(gè)亞型中上調(diào)基因簇(1.1基因簇由1201個(gè)基因組成，1.2基因簇由1788個(gè)基因組成)和1個(gè)亞型中上調(diào)基因簇(3112個(gè)基因組成)(圖b)。接下來研究人員對三個(gè)基因簇進(jìn)行了基因富集分析（圖c）。亞型2中缺乏炎癥/免疫標(biāo)記和MYC和E2F靶基因的富集引起了干性特征，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們將四種不同的干性標(biāo)志應(yīng)用于59個(gè)有轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本。我們還評估了干細(xì)胞干性指數(shù)和各種免疫細(xì)胞豐度之間的關(guān)系，根據(jù)微環(huán)境細(xì)胞群(MCP)計(jì)數(shù)器評分進(jìn)行估計(jì)。干性指數(shù)與單核細(xì)胞系、B系和細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的MCP評分呈負(fù)相關(guān)(圖d)。結(jié)論得出，亞型2與高干性相關(guān)。同時(shí)，在分析的24個(gè)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)志物中，一小部分(EBF3, EBF1, GAP43, POU4F2, NEFM, ALCAM, NRN1, CNTN2)在亞型2腫瘤中一致過表達(dá)，在亞型2腫瘤這些基因過表達(dá)可以被認(rèn)為是神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)基因（圖e）。這些觀察表明亞型2可能是錐神經(jīng)元亞型。神經(jīng)元基因的表達(dá)不僅存在于腦和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中，也存在于一些上皮性腫瘤中(乳腺、卵巢、結(jié)腸癌)65。近年來，腫瘤細(xì)胞利用神經(jīng)和神經(jīng)發(fā)育途徑增殖、遷移，并與包括內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)元在內(nèi)的正常細(xì)胞相互作用的研究已經(jīng)變得很清楚。因此，在亞型2腫瘤中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元基因的過度表達(dá)可能與這些腫瘤的侵襲性有關(guān)。
錐體細(xì)胞分化狀態(tài)和神經(jīng)元/神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)可以區(qū)分這兩種亞型
在兩種亞型的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中觀察到的圓錐體標(biāo)記物的表達(dá)與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的起源細(xì)胞是一致的。研究人員測量了在視網(wǎng)膜錐標(biāo)記瀑樣在不同時(shí)間點(diǎn)后人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的分化成視網(wǎng)膜早期和晚期的表達(dá)水平,亞型1 (n = 23)和亞型2 (n = 44)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤正如預(yù)期的那樣，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的視網(wǎng)膜類器官中，早期光感受器/錐細(xì)胞標(biāo)記物(OTX2, CRX, THRB, RXRG)的表達(dá)出現(xiàn)在較早的時(shí)間點(diǎn)，而晚期錐細(xì)胞標(biāo)記物(PDE6H, GNAT2, ARR3, GUCA1C)則出現(xiàn)在較早的時(shí)間點(diǎn)。GUCA1C是最后一個(gè)表達(dá)的標(biāo)記物，這與之前相關(guān)研究體外和體內(nèi)的觀察結(jié)果一致。結(jié)果表明，亞型1腫瘤對應(yīng)的錐體發(fā)育階段比亞型2腫瘤更分化。由于幾種神經(jīng)元/神經(jīng)節(jié)細(xì)胞譜系相關(guān)基因在腫瘤亞型之間存在差異表達(dá)，研究人員還比較了它們在視網(wǎng)膜類器官和兩種亞型腫瘤樣本中的表達(dá)水平，與亞型1相比，亞型2中的這些神經(jīng)節(jié)標(biāo)志物上調(diào)(圖a)。圖b顯示了亞型1和亞型2腫瘤細(xì)胞錐體每個(gè)時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜的誘導(dǎo)分化后,每個(gè)腫瘤亞型的質(zhì)心之間的相關(guān)系數(shù)和瀑樣圖；為了說明每個(gè)亞型的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的視錐體分化程度，我們使用光感受器/視錐標(biāo)記物表達(dá)，結(jié)合分化誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)的視網(wǎng)膜器官樣本和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣本，生成了一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(圖c)。為了進(jìn)一步探討視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中視錐細(xì)胞分化的異質(zhì)性，研究人員還通過免疫組化研究了早期光感受器標(biāo)記物(CRX)和晚期視錐細(xì)胞特異性標(biāo)記物(ARR3)的分布。還檢測了神經(jīng)節(jié)細(xì)胞標(biāo)記物(EBF3)的表達(dá)。
亞型2腫瘤細(xì)胞內(nèi)異質(zhì)性的單細(xì)胞分析
為了進(jìn)一步探討亞型2腫瘤的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，我們對亞型2腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序。免疫組化分析顯示ARR3和EBF3相互排斥表達(dá)，定義了兩種類型的區(qū)域在約30%的亞型2腫瘤中觀察到。研究人員在質(zhì)控之后保留了1198個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，并通過單細(xì)胞聚類分析得到了7個(gè)聚類并通過簇標(biāo)記物表達(dá)進(jìn)行了單細(xì)胞亞群的識別，每一簇標(biāo)記物表達(dá)的可視化如圖所示（圖a-e），通過單細(xì)胞分析方法對亞型2 腫瘤的細(xì)胞內(nèi)異質(zhì)性進(jìn)行了分析。
亞型2腫瘤與較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)
研究了視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移是否屬于一個(gè)特定的分子亞型。在最初的102例視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤病例中，沒有患者發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，研究人員研究了另外112例在診斷時(shí)具有高危病理特征的原發(fā)腫瘤，其中19例隨后發(fā)生轉(zhuǎn)移。TFF1在正常發(fā)育的視網(wǎng)膜中未表達(dá)。在亞型2腫瘤中，與亞型1腫瘤相比，它是最高上調(diào)基因,表達(dá)在大多數(shù)腫瘤亞型2但很少或根本沒有在亞型1腫瘤中表達(dá)。研究人員通過免疫組化評估了TFF1蛋白是否表達(dá)在最初的102個(gè)分類的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，其中55個(gè)腫瘤發(fā)生了TFF1表達(dá)(18個(gè)亞型1和37個(gè)亞型2)。圖a顯示了具有代表性的亞型1和亞型2腫瘤中TFF1、CRX和ARR3的表達(dá)。亞型1腫瘤顯示很少或沒有TFF1的表達(dá)，而大多數(shù)亞型2腫瘤表現(xiàn)出高水平的表達(dá)（圖a-b）。在隨后發(fā)生轉(zhuǎn)移的19例原發(fā)腫瘤中，有18例可檢測到TFF1表達(dá)。18例TFF1陽性都不是非轉(zhuǎn)移性病例（圖b）。這表明他們屬于亞型2。與此一致的是，16例轉(zhuǎn)移性病例中有15例EBF3陽性，是亞型2特異性相關(guān)的神經(jīng)節(jié)標(biāo)記物。所有這些結(jié)果都表明了，亞型2腫瘤比亞型1腫瘤更具侵襲性。
文章小結(jié)：
到這里文章就結(jié)束了，多組學(xué)方法的使用使我們可靠地鑒定了兩種主要的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤分子亞型。這兩種亞型不同的分子、病理和臨床特征突出了這種分類的相關(guān)性，錐樣和錐/神經(jīng)元兩種分子亞型的鑒定代表了對視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤認(rèn)識的重大進(jìn)展。重新定義了對這種兒童癌癥的進(jìn)一步研究，包括發(fā)展模型，改善診斷和預(yù)后，以及確定更具體的治療方法。與亞型2腫瘤相關(guān)的高干性和神經(jīng)元特征將視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與新興的癌癥研究領(lǐng)域聯(lián)系起來，對于臨床治療有著重要的指導(dǎo)意義。
