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鐵死亡（Ferroptosis）是一種鐵依賴的細胞死亡形式，目前關于鐵死亡分析的發(fā)文層出不窮，生信人也一直在推出鐵死亡相關的分析思路。今天小編再和大家分享一篇今年五月份發(fā)表在Journal of Cancer（IF:4.478）雜志上的關于鐵死亡的膠質(zhì)瘤預后文章。膠質(zhì)瘤是最難治的顱內(nèi)疾病之一，具有發(fā)病率和死亡率高的特點，而放射治療在膠質(zhì)瘤的治療中起著至關重要的作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡與腫瘤細胞的放射敏感性高度相關。因此小編今天和大家介紹的文章就對膠質(zhì)瘤的放射敏感性及鐵死亡相關的基因進行了整合分析，并構建了預后預測模型。文章的分析方法簡潔易懂但是思路很有意思，值得我們參考。
Construction of a novel radiosensitivity- and ferroptosis-associated gene signature for prognosis prediction in gliomas
構建新放射及鐵死亡相關神經(jīng)膠質(zhì)瘤預后預測基因特征
一．研究背景
膠質(zhì)瘤是起源于膠質(zhì)細胞的腫瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤患者的中位生存期小于15個月，5年生存率小于5.5%。并且膠質(zhì)瘤的發(fā)病率一直呈上升趨勢。此外，由于膠質(zhì)瘤的復雜性和高度異質(zhì)性，目前靶向治療效果有限，還沒有有效的診斷和治療選擇。因此，迫切需要開發(fā)有效的膠質(zhì)瘤診斷和治療方法。而膠質(zhì)瘤特異性生物標志物具有巨大的治療和預后意義。因此今天介紹的這篇文章就探討了與放射敏感性和鐵死亡相關的七種生物標志物在膠質(zhì)瘤預后中的作用。
二．文章摘要
文章使用來自The Cancer Genome Atlas (TCGA)的膠質(zhì)瘤mRNA測序及相關臨床數(shù)據(jù)，通過差異分析識別放射敏感性和鐵死亡相關的差異表達基因(DEGs)。接著進行LASSO回歸分析構建基于這些基因的預測模型。此外，利用中國膠質(zhì)瘤基因組圖譜(CGGA)中的數(shù)據(jù)對結果進行驗證。同時采用ROC曲線和K-M分析顯示特征基因的生存預測能力。作者也進行了功能分析探索高風險組和低風險組之間的差異表達基因在膠質(zhì)瘤相關生物學過程中富集情況。最后文章也分析了兩組之間的免疫功能差異。
三．數(shù)據(jù)及方法
1. 數(shù)據(jù)集的獲?。?/strong>文章從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得的169個膠質(zhì)瘤腫瘤組織和5個正常組織的RNA測序數(shù)據(jù)作為訓練隊列，同時也收集了臨床信息。并收集CGGA數(shù)據(jù)庫的RNA測序數(shù)據(jù)和相關臨床數(shù)據(jù)作為驗證隊列。此外，從dbCRSR中下載了395個放射敏感性相關基因，并從FerrDb數(shù)據(jù)集中獲得了259個與鐵死亡相關的基因。
2. 識別差異表達基因：文章使用R包limma對正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織進行差異分析。采用單因素cox分析確定與總生存期(OS)相關的基因。最終識別到36個放射敏感性及19個與鐵死亡相關的有預后價值的差異基因。然后構建一個維恩圖來顯示基因交集。進一步，利用STRING在線平臺分析基因之間的交互作用，并利用Cytoscape構建可視化PPI網(wǎng)絡。
3. 構建并驗證預后模型：文章通過對放射敏感基因和鐵死亡相關基因的研究，獲得了7個交叉基因。然后，利用這7個基因特征采用LASSO Cox回歸分析構建預后模型。接著根據(jù)中位風險評分將患者分為低風險組和高風險組。采用Kaplan-Meier分析比較兩組患者的總生存期(OS)時間。使用FactoMineR R包對特征進行PCA分析。采用ROC分析評估各基因的預測精度和風險評分。此外，作者也構建了nomogram生存預測模型，用于預測1年、2年和3年的總生存期。最后，利用CGGA隊列對7個基因模型進行驗證。
4. 獨立預后分析：作者從TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中提取患者的臨床信息(年齡、性別、分期、IDH和MGMT)。采用單因素和多因素Cox回歸分析對這些變量進行分析。
5. 功能富集分析：文章根據(jù)中位風險評分將患者分為低、高風險亞組，并篩選兩組的差異表達基因。此外，使用clusterProfiler R包執(zhí)行GO和KEGG分析。最后，用R包gsva 的ssGSEA測定免疫細胞浸潤評分，估計免疫相關通路。
6. 實驗：細胞培養(yǎng)、CCK-8分析和菌落形成分析、5-Ethynyl-20-deoxyuridine (EdU)測定。
四．研究的主要內(nèi)容及結果
1. 識別TCGA中與放射敏感性和鐵死亡相關的預后差異表達基因（DEGs）
文章在第一部分作者對TCGA數(shù)據(jù)進行分析，識別放射敏感性和鐵死亡相關的DEGs，并評估其與OS的相關性，結果發(fā)現(xiàn)有36個放射敏感性和19個鐵死亡相關的DEGs具有預后價值，其中包括7個重疊基因(圖1A)。此外，作者也發(fā)現(xiàn)重疊基因ZEB1、CA9、HSPB1、STAT3和TNFAIP3在膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)(圖1B)。蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡則顯示STAT3是中心基因(圖1C)，而重疊基因的相關性如圖1D所示。
2. 比較重疊基因在正常腦組織與膠質(zhì)瘤組織的表達
在文章的第二部分，作者進行免疫組化染色，分析重疊基因在正常腦組織與膠質(zhì)瘤組織的表達情況，結果顯示ZEB1、CA9、HSPb1、STAT3、TNFAIP3基因在膠質(zhì)瘤組織中的表達高于正常組織。而基因MAPK1和MAP1LC3A在膠質(zhì)瘤組織中表達相對較低(圖2)。這些結果與TCGA數(shù)據(jù)庫中的基因表達模式一致。
3. 預后模型的構建
在這一部分作者使用TCGA數(shù)據(jù)構建了風險模型。針對上面識別的7個重疊基因。作者發(fā)現(xiàn)HSPB1、STAT3、CA9、MAP1LC3A、TNFAIP3的HR>1，表明它們與風險增加有關。另外兩個基因MAPK1和ZEB1的HR<1，為低風險基因(圖3A)。接下來作者利用LASSO Cox回歸分析使用這7個基因構建了預后模型（圖3B,C），并根據(jù)風險評分將患者分為高風險組及低風險組（圖3D）。作者進一步通過主成分分析將不同風險組的患者聚類為兩組(圖3E)。研究發(fā)現(xiàn)高風險組比低風險組生存時間短，死亡率高(圖3F)。此外，高風險組的總生存率低于低風險組(圖3G)。作者也進行了ROC分析，評估了預后模型的有效性(圖3H，I)。
4. CGGA數(shù)據(jù)驗證預后模型
在這一部分，作者以693例膠質(zhì)瘤患者為研究對象，建立了驗證模型可靠性的驗證集。首先，檢測了7個基因在CGGA中的表達。結果發(fā)現(xiàn)CGGA的基因表達與TCGA一致(圖4A)。進一步，作者將693例膠質(zhì)瘤患者按照中位風險評分分為高風險組和低風險組(圖4B)，作者也發(fā)現(xiàn)CGGA數(shù)據(jù)集的PCA和t-SNE分析與TCGA一致(圖4C和D)。高風險組患者的預后較差(圖4E)。作者也使用ROC曲線分析進一步驗證CGGA預后模型的預測準確性。結果顯示，7基因模型具有良好的預后準確性(圖4F和G)。
5. 7-基因風險模型的獨立預后價值
在這一部分作者采用單因素和多因素Cox回歸分析評估風險評分與臨床參數(shù)(年齡、性別、IDH、MGMT和疾病分期)之間的關系。結果發(fā)現(xiàn)在TCGA和CGGA數(shù)據(jù)庫中，risk score和年齡是OS的獨立預后預測因素(表1和表2)。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，高風險基因在高風險人群中有較高的表達，如圖5A熱圖所示。同樣，CGGA數(shù)據(jù)庫顯示高風險基因表達相似(圖5B)。
6. 功能富集分析
在這一部分作者利用GO富集分析和KEGG，基于DEGs分析其生物特征。結果發(fā)現(xiàn)DEGs與抗微生物體液反應、急性炎癥反應、中性粒細胞遷移和急性期反應等相關(圖6A)。KEGG通路分析則顯示，這些基因與IL-17、細胞因子-細胞因子受體相互作用、TNF信號通路等相關(圖6B)。
7. 兩種不同風險人群免疫細胞浸潤模式的比較
由于富集分析顯示，免疫特征與輻射敏感性和鐵死亡有內(nèi)在聯(lián)系。因此，在這一部分作者通過ssGSEA比較高風險組和低風險組的免疫細胞浸潤模式。結果發(fā)現(xiàn)在TCGA隊列中，高風險組DCs、巨噬細胞、TIL和Treg等細胞浸潤率較高(圖7A)。作者也發(fā)現(xiàn)在13種免疫通路中，TCGA高風險組和低風險組的I型IFN和II型IFN應答通路相似(圖7B)。同樣，CGGA顯示類似的免疫細胞浸潤模式(圖7C和D)。
8. 膠質(zhì)瘤中鐵死亡與放射敏感性的關系
在文章的最后一部分，作者用鐵死亡誘導劑誘變U87和U251細胞，然后用CCK-8法觀察放射敏感性和鐵死亡之間的關系。結果發(fā)現(xiàn)與對照細胞相比，經(jīng)過鐵死亡誘導劑處理后再進行放射處理，U87和U251細胞的細胞活力被顯著抑制(圖8A, B)。此外，文章也進行了實驗來評估鐵死亡誘導劑的放射敏感性。結果發(fā)現(xiàn)鐵死亡誘導劑處理的U87和U251細胞對放射更敏感(圖8C-F)。同樣，EDU檢測在U87和U251細胞中也顯示了類似的結論(圖8G-J)。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，文章將放射敏感性與鐵死亡相結合，基于相關基因構建了膠質(zhì)瘤預后預測模型。文章主要的方法包括差異分析，功能富集分析，LASSO cox，單因素及多因素cox及ssGSEA等常用的生物信息方法?？梢姺椒ǘ急容^基礎，不過選取的角度新穎，可見一個好的課題切入點真的可以達到事半功倍的效果。
