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今天小編給大家解讀一篇今年12月發(fā)表在Advanced Science雜志（IF: 17.521）的文章“The Single-Cell Landscape of Intratumoral Heterogeneity and The Immunosuppressive Microenvironment in Liver and Brain Metastases of Breast Cancer”。
轉移仍然是乳腺癌死亡率較高的主要原因。其中，肝或腦轉移患者的預后非常差，PD-1/L1免疫檢查點治療的應答率也很低。因此，迫切需要研究抗PD-1/L1耐藥的潛在機制，為這些患者制定更有效的免疫治療策略。作者使用單細胞RNA測序的44473個細胞描繪了整個腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。剖析了乳腺癌肝腦轉移瘤內的異質性和免疫抑制微環(huán)境。
為了破譯乳腺癌肝和腦轉移腫瘤微環(huán)境中的細胞結構，作者對轉移病灶進行了單細胞RNA測序。然后，無監(jiān)督聚類分析，確定了具有相似表達模式的主要細胞簇(圖1b-e)。進一步進行了多重免疫熒光染色，確認乳腺癌肝臟和腦轉移組織中的細胞亞群(圖1f,g)。
為了評估乳腺癌肝和腦轉移病灶中的免疫抑制微環(huán)境，檢測了每個細胞亞群中免疫檢查點分子的表達(圖2c)。發(fā)現(xiàn)LAG3, TIGIT, CD96, 和KLRB1在T細胞中的表達高于PDCD1。相應的免疫檢查點配體CD274和PDCD1LG2在腫瘤微環(huán)境中的癌細胞或其他浸潤細胞中幾乎不表達。其他免疫檢查點配體NECTIN2、LGALS3、和LGALS9在癌細胞或其他浸潤細胞中高表達(圖2d)。這些結果表明PD-1受體和PD-L1/2配體對可能不是乳腺癌肝和腦轉移的主要免疫檢查點信號通路分子。因此，靶向LAG3-LGALS3和TIGIT-NECTIN2可能是治療乳腺癌肝和腦轉移的有效策略。
接下來，用InferCNV法區(qū)分腫瘤細胞和正常上皮細胞。在乳腺癌、肝和腦轉移瘤識別了13個主要的癌細胞亞群(圖3a-c)。為了研究來自多個樣本的癌細胞之間的共同表達模式，建立了一個meta-cluster算法。確定了六種不同細胞狀態(tài)和生物學功能的常見表達程序，包括增殖維持、轉移激活、免疫逃避、應激抵抗、代謝重編程和促進炎癥(圖3d，e)。進行相關性分析識別出三個顯著的共存程序對以及九個相互排斥的程序對(圖3i)。TOP表達的程序基因KLF5可能成為抑制乳腺癌轉移的潛在靶點。KLF5抑制劑可能成為未來抑制乳腺癌轉移的有效藥物。
根據(jù)肝轉移和腦轉移的差異表達基因，分別識別了7個和5個癌細胞亞群(圖3j)。利用hallmark信號通路進行富集分析，探索每種細胞的潛在生物學功能和相關的信號通路(圖3k,l)。
乳腺癌在很大程度上是由基因拷貝數(shù)的變化驅動的。推斷的CNV圖譜顯示了肝和腦轉移乳腺癌組織中病變間和病變內的異質性(圖4a-c)。在每個患者的亞克隆中都發(fā)現(xiàn)了多個規(guī)范的(CNV百分比大于90%)和非規(guī)范的(CNV百分比小于90%)CNV，這些CNV在癌細胞進化的細胞群體的亞克隆中被發(fā)現(xiàn)(圖4d)。癌細胞亞群c8_TOP2A、c9_HMGB2、c12_MKI67和c13_TK1主要處于循環(huán)狀態(tài)，而c1_TCN1、c2_CD74、c3_CD24、c5_CEACAM6和c10_SAT1主要處于靜止狀態(tài)(圖3g,h)。Monocle2和RNA velocity對癌細胞進行了軌跡分析還剖析了與癌細胞狀態(tài)轉變有關的基因模式的變化(圖4i,f,j,k)。接著，作者評估了每個癌細胞群的干性(圖4l,m)。此外，還研究了免疫檢查點配體在每個癌細胞亞群中的表達。最有希望的免疫檢查點治療靶點CD274(PD-L1)和PDCD1LG2(PD-L2)在每個癌細胞群體中的表達水平較低(圖4n,o)。另外兩個免疫檢查點配體NECTIN2和LGALS3幾乎在所有的亞群中都有高表達。這些表面蛋白有望成為未來肝臟和腦轉移乳腺癌治療的免疫靶點。
之后，作者分別對T細胞和B細胞進行重組，確定了13個T細胞和先天淋巴亞群(圖5a，b)。在四個CD8+T細胞中2個cluster高表達免疫檢查點分子TIGIT、LAG3、CD96。B細胞重新聚集后，確定了四個主要亞群 (圖5c,d)。CD4+T細胞表現(xiàn)出相對高水平的共刺激分子，包括ICOS和TNFRSF4，這對CD8+T細胞的細胞毒性刺激很重要(圖5f，g)。CD8+T細胞高表達GZMB、GZMK、和GZMH等細胞毒基因。數(shù)據(jù)還顯示，這些CD8+ T細胞亞型表達T細胞衰竭相關抑制受體，包括LAG3、TIGIT和CD96，表明這些CD8+ T細胞在乳腺癌肝和腦轉移的初始激活步驟后就衰竭了(圖5f，g)。CD8_T_cells_c1_GZMK和CD8_T_cells_c4_IFIT3的功能紊亂得分顯著高于其他兩個集群。此外，CD8_T_cells_c1_GZMK簇在腦轉移癌中的功能紊亂評分高于肝轉移癌(圖5h,i)。
GO和KEGG分析了每種類型細胞潛在的生物學功能和相關的信號通路(圖5j,k)。為了追蹤CD8+T細胞的分化，進行了偽時序分析。CD8_T_cells_c1_GZMK簇的終末狀態(tài)最多，偽時序得分最高，揭示了CD8_T_cells_c2_ZNF683和CD8_T_cells_c3_KLRB1簇處于中間狀態(tài)(圖5l)。在B細胞的偽時序軌跡分析中，Plasma_cells_MZB1簇處于最末期，具有最高的偽時序分數(shù)(圖5m)。接下來，檢測了CD8+T細胞亞群中免疫檢查點受體的表達，發(fā)現(xiàn)LAG3、TIGIT、CD96、a d KLRB1(CD161)的表達高于PDCD1(PD-1)(圖5n-p)。
CellphoneDB預測了癌細胞和免疫細胞之間相互作用。Treg細胞與其他細胞群體的相互作用最多，表現(xiàn)出與癌細胞的強烈相互作用(圖6f)。癌細胞通過CXCL10-CXCR3配體-受體對招募了CD4_T_Cells_c2_CXCL13、CD8_T_Cells_c1_GZMK、CD8_T_Cells_c4_IFIT3、NK_Cells_KLRD1和T reg_Cells_FOXP3簇(圖6g)。參與細胞間通訊的其他重要配體-受體對如圖6h所示。
髓系細胞可分為20個簇(圖7a-d)。單核細胞形成兩個簇：Mono_c1_VCAN和Mono_c2_FCN1。TAMs有12個簇，可分為M1巨噬細胞、M2巨噬細胞和增殖性巨噬細胞。M1-TAMs與炎癥因子相關，包括CCL2/3/4、CXCL3和TNF，在腫瘤微環(huán)境中募集T細胞、未成熟DC和NK細胞。M2-TAMs是促進腫瘤的巨噬細胞，高表達MRC1、CD163。此外，M2類TAMs的免疫檢查點分子PD-L1、PD-L2、LGALS3、LGALS9的表達均高于M1類TAMs。分析了TAM成熟的軌跡，并確定了TAM狀態(tài)轉換中涉及的基因表達模式的變化(圖7f-h)。
DC由四個簇組成：常規(guī)DC、耐受樹突狀細胞和漿細胞樣樹突狀細胞。cDCs是成熟的DCs，可以激活CD8+T細胞和其他抗腫瘤免疫反應，并且高表達共刺激因子、MHC II類分子和促炎細胞因子(圖7i)。LAMP3-positive tDCs是樹突狀細胞的一個免疫抑制亞群，它們高水平表達幾種陰性免疫調節(jié)因子，包括IDO1，CCR7，LGALS3，LGALS9，和NECTIN2(圖7i，k)。GO和KEGG探索每種細胞類型的潛在生物學功能和相關的信號通路(圖7j)。根據(jù)CellphoneDB分析，腫瘤微環(huán)境中，TAMS與癌細胞和其他髓系細胞的相互作用最多(圖7l)。
在間質間隔中發(fā)現(xiàn)了三種主要的細胞類型：CACs、ECs和MCs(圖8a-d)。CAF被聚為四個亞群；ECs分為四個亞群；MCs可分為五個亞群(圖8g)。主成分分析和diffusion map揭示了CAFs_c2_DCN的兩種不同的演化軌跡，最終發(fā)展為炎癥性CAF簇(圖8h)。動脈內皮細胞、靜脈內皮細胞和肝竇內皮細胞由毛細血管內皮細胞發(fā)育而來，參與轉移灶的動態(tài)血管生成過程(圖8i)。Mural_cells_c2_COL1A1細胞發(fā)育成兩個分支，且這些分支中的Mural_cells_c4_MYH11和Mural_cells_c5_RGS5簇具有最高的偽時序分數(shù)，代表最分化和成熟的MC(圖8j)。
接下來，檢查了免疫檢查點配體在每個癌細胞亞群中的表達。幾個免疫檢查點分子在三種基質細胞亞型中高度表達，包括LGALS3，LGALS9，NECTIN2，和TNFRSF14(圖8k)。根據(jù)CellphoneDB分析，CAFs_c2_DCN, ECs_c1_GJA5,和Mural_cells_c2_COL1A1分別是CAF、ECs和MC與癌細胞相互作用最多的細胞。
不同的CAF亞群有不同的生長因子分泌模式(圖8l)。提示CAF可產(chǎn)生VEGFRA/B，與內皮細胞上的血管內皮生長因子受體結合，促進血管生成?；诩毎L因子和受體對，構建了CAF和癌細胞的調控網(wǎng)絡。CAFs_c2_DCN亞群通過FGF2/7-FGFR3/4和IGF1-IGF1R信號通路促進癌細胞生長(圖8m)。特別是，RGS5+腫瘤相關成纖維細胞簇被發(fā)現(xiàn)，并證明通過分泌Periostin和Biglycan來負調控轉移性乳腺癌的免疫過程。
駐留細胞(微膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、神經(jīng)元、肝細胞等)是腦或肝轉移微環(huán)境不可缺少的組成部分，參與形成獨特的定殖生態(tài)位和免疫環(huán)境。共鑒定了13個細胞群，包括小膠質細胞、星形膠質細胞、少突膠質細胞、神經(jīng)元、少突膠質細胞前體細胞、肝細胞和膽管細胞(圖9a-e)。小膠質細胞Microglials_c1_CCL4通過分泌趨化因子如CCL3/4在腫瘤微環(huán)境中募集T細胞、未成熟DC和NK細胞，從而促進免疫應答。Microglials_c2_LGALS1表達高水平的Galectin-1，可能通過CD8+T細胞排斥形成免疫抑制的微環(huán)境。此外，免疫檢查點基因SELPLG和LGALS3在小膠質細胞中高表達，而FGL1、NECTIN2、和LGALS3在肝細胞和膽管細胞中高表達(圖9f-h)。
在本研究中，作者對肝和腦轉移的乳腺癌樣本進行了高分辨率分析，確定了不同的主要細胞類型，包括癌細胞、淋巴細胞、髓系細胞、基質細胞和器官特異性駐留細胞。分析每個細胞團的分子特征、調節(jié)因子、動力學和功能，探討它們在轉移性腫瘤進展和免疫逃逸中的作用。在癌細胞中鑒定出六種不同細胞狀態(tài)和生物學功能的共同表達程序，包括增殖維持、轉移激活、免疫逃避、應激抵抗、代謝重編程和促進炎癥?？傊撗芯拷沂玖烁魏湍X轉移性乳腺癌的瘤內異質性和免疫抑制腫瘤生態(tài)系統(tǒng)，這為深入了解免疫檢查點治療抵抗的機制提供了信息，并為這些患者開發(fā)精確的免疫治療策略提供了信息。
