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每年約有15萬人死于膀胱癌，其中約有70%-80%的患者為非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）。目前，已經(jīng)開發(fā)了多種治療NMIBC的方法但是很多患者對治療無效。因此，鑒定NMIBC的治療靶點和預(yù)后因子十分重要。今天就給大家介紹一篇發(fā)表在eBioMedicine（IF：11.205）研究NMIBC預(yù)后因子的文章“YAP1 activation is associated with the progression and response to immunotherapy of non-muscle invasive bladder cancer”。這篇文章中作者重點關(guān)注在腫瘤發(fā)生發(fā)展中十分重要的基因YAP1。作者通過UC3-siYAP1細(xì)胞和NMIBC隊列數(shù)據(jù)鑒定YAP1相關(guān)的基因特征，結(jié)果表明YAP1激活與高危NMIBC患者的特征和免疫治療反應(yīng)有關(guān)。
流程圖：
結(jié)果：
1.篩選膀胱癌細(xì)胞系進行分析和驗證
首先作者分析了MCF10A乳腺上皮細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)集并篩選2151個與YAP1過表達(dá)相關(guān)的基因。使用這些基因?qū)CF10A數(shù)據(jù)集進行水平聚類共鑒定到2個亞組（圖1A）。隨后，在4個細(xì)胞系中分析與YAP1激活有關(guān)的基因（圖1a和1b）。與細(xì)胞系RT4相比而言，基因YAP1，CYR61，CTGF和TEAD2在細(xì)胞系UC14，T24和UC3中的表達(dá)水平升高，而基因FGFR3的表達(dá)水平顯著降低（圖1c）。轉(zhuǎn)染YAP1-S127A后，細(xì)胞系RT4和UC14細(xì)胞系中CYR61,CTGF和TEAD2的表達(dá)水平升高而FGFR3的表達(dá)水平降低。轉(zhuǎn)染siYAP1后，細(xì)胞系UC3和T24細(xì)胞系中，CYR61，CTGF和TEAD2的表達(dá)水平顯著降低而FGFR3的表達(dá)水平增加。以上結(jié)果表明，細(xì)胞系UC3適合進行下一步實驗研究YAP1表達(dá)后下游基因的表達(dá)趨勢。
2.根據(jù)YAP1激活情況將NMIBC患者分為亞組
作者使用轉(zhuǎn)染siYAP1的UC3膀胱癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)集鑒定到549個YAP1失活有關(guān)的差異表達(dá)基因，包括50個最顯著差異表達(dá)基因。將這50個差異基因與UROMOL隊列數(shù)據(jù)結(jié)合并進行K-means分析。其中siYAP1-轉(zhuǎn)染細(xì)胞和YAP1失活患者聚為一類而siCon-轉(zhuǎn)染細(xì)胞和YAP1激活患者聚為一類。然而，這50個基因僅能表明YAP1在細(xì)胞實驗條件下被激活而不是與NMIBC患者相關(guān)的生物學(xué)特征。因此，作者使用t檢驗評估UROMOL隊列的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，在UROMOL數(shù)據(jù)集的YA亞組和YI亞組鑒定到976個差異表達(dá)基因。
使用這976個基因進行一致性聚類將NMIBC患者分為三組，分別為YA1，YA2和YI亞組。
3.YAP1激活與NMIBC患者的無進展生存期和膀胱內(nèi)治療（IVT）受益顯著相關(guān)
在各個亞組的激活信號通路中鑒定到32個基因（圖2a），與YI亞組相關(guān)的7個基因具有管腔乳頭特征，與YA1亞組相關(guān)的10個基因參與DNA損傷和修復(fù)通路，與YA1和YA2亞組相關(guān)的6個基因參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和TGFβ通路激活。許多高危膀胱癌患者，如T1期和高級別，被納入YA1亞組。此外，UROMOL隊列的第2類被細(xì)分為YA1和YA2亞組。（圖2a）。KM分析表明YA1亞組的進展率高于YA2和YI亞組（圖2b）。多因素分析表明，YA1亞組無進展生存期的重要指標(biāo)包括分期，分級和在UROMOL隊列中的976個基因的signature。IVT會顯著影響YA1亞組的無進展生存期（圖2c）而不會影響YA2和YI亞組（圖2d和2e）。
4.驗證YAP1激活對膀胱癌患者的預(yù)后價值
作者結(jié)合Lund和Korean兩個隊列的NMIBC患者的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)創(chuàng)建新的隊列驗證YAP1激活與患者預(yù)后的相關(guān)性。與上述結(jié)果一致，NMIBC高危患者被納入YA1和YA2亞組。YA1和YA2亞組患者的進展率顯著高于YI亞組。多因素分析表明YA1亞組無進展生存的重要指標(biāo)包括分期，分級和976個基因的signature。
5.實驗驗證YAP1激活
接下來，作者使用YAP1基因敲除實驗研究基因YAP1對UC3細(xì)胞增殖和活力的影響，并進行體外驗證。作者主要使用兩種siRNAs分別為siYAP1#1和siYAP1#2，生成了YAP1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均降低70%的細(xì)胞。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染scRNA細(xì)胞相比，siYAP1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞存活率、增殖形成、侵襲性和遷移率均有所降低。此外，CCNA2，TEAD2，CTGF，CYR61，SMAD3和SMAD6在UC3細(xì)胞系中的表達(dá)水平有所改變。此外，CTGF，CYR61和CCNA2的蛋白水平有所降低。以上結(jié)果表明，在穩(wěn)定條件下研究表型變化和基因表達(dá)水平變化是合理的。使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA-YAP1的UC3細(xì)胞系（shYAP1），生成YAP1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平均降低的細(xì)胞系（圖3a）。與shNTS細(xì)胞相比，shYAP1細(xì)胞的存活率、集落形成、侵襲性和遷移性均降低（圖3b和3c）。在shYAP1中，YA1和YA2亞組的相關(guān)基因表達(dá)水平降低而YI亞組相關(guān)基因表達(dá)水平升高（圖3d）。此外，CTGF，CYR61，E2F1和FOXM1蛋白水平有所降低（圖3e）。然而，將YAP1載體轉(zhuǎn)染到shYAP1細(xì)胞后，亞群相關(guān)基因的表達(dá)水平有所恢復(fù)（圖3f）。以上結(jié)果表明，YAP1基因下調(diào)表達(dá)會抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和遷移，并且與YA1和YA2亞群相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。
6.與免疫治療反應(yīng)相關(guān)的綜合分析和臨床特征分析
接下來，作者綜合分析IMvigor210數(shù)據(jù)集和UROMOL數(shù)據(jù)集研究YAP1激活如何影響免疫治療的反應(yīng)?；诖砻總€亞組的32個選定基因，之前的基因表達(dá)譜分析是一致的（圖4a）。KM分析表明，接受PD-L1免疫治療的YA1亞組患者生存期有所延長（圖4b）。隨后，作者研究各個亞組和客觀緩解率（ORR），其中YA1亞組的ORR高于YA2和YI亞組（圖4c）。
在YA1亞組中免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的PD-L1蛋白相對高表達(dá)（圖5a和5b）。YA1和YI亞組的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）具有顯著差異（圖5c）。基于TCGA分型，大部分管腔型，基底型和神經(jīng)元型包括在YA1亞組中，管腔浸潤亞型包括在YA2亞組中，管腔乳頭亞型被納入YI亞組（圖5d）。在Lund分型中，基因組不穩(wěn)定（GU）亞型在三個亞組中比例類似，YA1亞組主要包括基底/SCC樣和尿基B亞型，YA2亞組主要包括浸潤亞型，YI亞組主要包括尿基底A亞型（圖5e）。UROMOL隊列的第2類被分為YA1和YA2亞組，而UROMOL隊列的第1類和第3類被納入YI亞組（圖5f）。此外，大多數(shù)NMIBC高?；颊弑患{入YA1亞組（圖5g和5h）。以上結(jié)果表明，基于這976個基因?qū)CGA和UROMOL數(shù)據(jù)集進行綜合分析，可以研究YAP1激活如何影響MIBC患者的預(yù)后。
結(jié)論：
總的來說，作者鑒定到NMIBC的三個亞組并研究YAP1激活，YAP1激活在不同亞組患者的進展中具有顯著差異。作者的研究為NMIBC患者接受手術(shù)后各種治療反應(yīng)的生物學(xué)決定因素提供額外見解，有助于通過劃分不同患者亞組進行精準(zhǔn)治療。
