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早晨好呀，小編與您一起開啟元氣滿滿的一天！腸道菌群與腫瘤治療的相關(guān)研究蒸蒸日上，而腸道菌群是如何調(diào)控腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞異質(zhì)性而影響藥物應(yīng)答呢？近期《Cell》雜志上發(fā)表一篇名為“Microbiota triggers STING-type I IFN-dependent monocyte reprogramming of the tumor microenvironment”的文章，該研究思路邏輯清晰，環(huán)環(huán)相扣，巧妙的地挖掘臨床數(shù)據(jù)驗證基礎(chǔ)研究結(jié)論，讓我們一起來抽絲剝繭，揭曉答案！
腸道菌群觸發(fā)腫瘤微環(huán)境中STING-IFN-Ⅰ依賴的單核細(xì)胞重編程
背景：
腸道菌群可影響抗腫瘤免疫功能，控制腫瘤細(xì)胞自發(fā)生長以及調(diào)控化學(xué)治療和免疫治療的應(yīng)答效應(yīng)。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境（TME）中扮演關(guān)鍵角色，其浸潤類別和比例對臨床治療效果有重要預(yù)測價值。單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（MPs）作為TME的重要組成部分，存在高度的異質(zhì)性和可塑性，包括單核細(xì)胞 [Mo]、巨噬細(xì)胞 [Macs] 和樹突狀細(xì)胞 [DCs]，Mo可分化為DCs誘導(dǎo)抗腫瘤反應(yīng)，也可分化為Macs促進(jìn)腫瘤的免疫抑制和疾病進(jìn)展。腸道菌群組成與個體對免疫檢查點阻斷（ICB）的反應(yīng)之間存在關(guān)聯(lián)，但菌群能否調(diào)節(jié)TME中MPs的異質(zhì)性以及涉及的信號傳導(dǎo)路徑有待研究。
本文的研究者發(fā)現(xiàn)缺乏微生物群會使TME向促腫瘤性Macs傾斜。微生物群衍生的STING（stimulator of interferon genes）激動劑可誘導(dǎo)瘤內(nèi)單核細(xì)胞產(chǎn)生I型干擾素（IFN-I），從而調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化和NK-DC軸。采用高纖維飲食調(diào)節(jié)腸道菌群可觸發(fā)瘤內(nèi)IFN-I-NK-DC信號軸，并提高免疫檢查點阻斷（ICB）的療效，表明化療藥物反應(yīng)者（R）與非反應(yīng)者（NR）之間的免疫細(xì)胞構(gòu)成差異可通過糞便菌移植轉(zhuǎn)移來實現(xiàn)。這項研究揭示了微生物群和TME之間的調(diào)控新機制，有望改善癌癥治療預(yù)后。
結(jié)果：
1，菌群缺失誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中Macs增加，而Mo和DCs減少
為探究菌群是否參與塑造TME中MPs構(gòu)成，首先將EL4淋巴瘤腫瘤植入SPF小鼠和無菌飼養(yǎng)GF小鼠，通過NanoString分析，基因組富集分析（GSEA）結(jié)合免疫學(xué)基因組（ImmGen）數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在SPF鼠和GF鼠的腫瘤浸潤性MPs之間存在顯著分布差異（圖1A-B）。對腫瘤組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq），證實SPF鼠的TME中以DCs為主，而GF鼠更傾向分化為促腫瘤性Macs細(xì)胞（圖1C-H）。GSEA結(jié)果顯示IFN-α應(yīng)答是Macs和DCs細(xì)胞的最主要途徑。SPF的MPs與抗腫瘤有關(guān)，而GF的MPs與免疫調(diào)節(jié)和抗炎功能有關(guān)（圖1I-J）。菌群缺乏會導(dǎo)致腫瘤內(nèi)IFN-Ⅰ信號傳導(dǎo)受損，MPs更傾向于Macs浸潤，而Mo和DCs比例減少。
2，菌群調(diào)控腫瘤IFN-I-NK細(xì)胞軸
在TME中，GF鼠的Mo和DCs的數(shù)量顯著低于SPF，使用廣譜抗生素（ABX）抑制SPF鼠的菌群會出現(xiàn)類似的表型（圖2A-B）。缺乏菌群的小鼠存在TME特異性而非全身性DCs生成障礙（圖2C-D）。說明在菌群缺失的情況下，Mo和DCs的數(shù)量均減少（圖2E-G）。因此，盡管以菌群為導(dǎo)向的信號在生理水平不足以控制自發(fā)腫瘤生長，但對于調(diào)控MPs構(gòu)成和獲得良好的抗腫瘤治療應(yīng)答至關(guān)重要。
為了解菌群如何調(diào)控TME中的MPs，對可能影響MPs功能的瘤內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行檢測。發(fā)現(xiàn)在GF鼠的EL4腫瘤中，與Mo和DCs的募集、維持和功能相關(guān)的蛋白質(zhì)以及IFN-I在蛋白質(zhì)（IFNa）和mRNA（Ifnb1）均降低（圖3A-B）。推測菌群可以調(diào)節(jié)TME中IFN-I的產(chǎn)生，利于抗腫瘤免疫應(yīng)答。為明確在缺乏菌群的情況下，缺乏IFN-I信號而導(dǎo)致的相同TME重塑是否影響治療應(yīng)答，采用化療藥物奧沙利鉑（oxa，需要菌群信號和髓樣細(xì)胞發(fā)揮療效）作用于Ifnar1-/-鼠，發(fā)現(xiàn)Ifnar1-/-鼠顯示出對oxa的反應(yīng)類似于ABX或GF鼠（圖3D），證實IFN-I信號是oxa應(yīng)答所必需。STING是IFN-I產(chǎn)生的一個主要調(diào)節(jié)因子，在化療過程中發(fā)揮重要作用。STING的缺乏（Tmem173-/-）則引起oxa的應(yīng)答受損，與Ifnar1或菌群信號的缺失相似（圖3E）。說明菌群對抗腫瘤治療效果的影響至少部分是通過IFN-I誘導(dǎo)產(chǎn)生的。
蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)分析顯示，GF鼠和Ifnar1-/-腫瘤中對NK細(xì)胞募集和激活至關(guān)重要的IFN誘導(dǎo)蛋白數(shù)量和NK細(xì)胞比例顯著降低，GF鼠腫瘤中Xcl1表達(dá)降低（圖3F-I）。比較來自SPF與GF鼠腫瘤的NK細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)SPF的NK細(xì)胞具有活化表型，編碼效應(yīng)蛋白和已知調(diào)節(jié)NK細(xì)胞功能的基因表達(dá)較高。相反，來自GF的NK細(xì)胞表達(dá)更高水平的轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白（Tgfbi）基因，IFNg也顯著減少（圖3J）。結(jié)果顯示：菌群誘導(dǎo)TME中的IFN-I信號引起NK細(xì)胞的有效募集和激活，NK細(xì)胞通過募集DC觸發(fā)正反饋路徑以促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答。
3，STING激動劑c-di-AMP刺激腫瘤IFN-I-NK軸并重編程MPs
STING介導(dǎo)的IFN-I信號可以增強NK細(xì)胞的抗腫瘤作用。推斷菌群衍生的STING激動劑，如環(huán)狀二核苷酸（CDNs）將能夠調(diào)節(jié)TME中的IFN-I-NK-DC軸。采用細(xì)菌CDN環(huán)狀二腺苷單磷酸酯（c-di-AMP [cdAMP]）體外刺激腫瘤浸潤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)cdAMP誘導(dǎo)下的TME細(xì)胞是IFN-I的主要來源（圖3K）。cdAMP誘導(dǎo)IFN-I產(chǎn)生引起Xcl1和Ccl5的增加表達(dá)（圖3L）。有趣的是，對SPF或GF鼠腫瘤中MPs的NanoString分析顯示GF腫瘤的Mo產(chǎn)生Ifnb1的能力受損（圖3M），可解釋IFN-I蛋白的減少、NK細(xì)胞的功能障礙。為挽救GF鼠TME的IFN-I信號缺陷，模擬菌群衍生物的潛在系統(tǒng)性效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)GF動物在cdAMP作用下，腫瘤內(nèi)的IFN-I基因水平增加并恢復(fù)Mo和DCs的浸潤（圖3N-O）。結(jié)果表明：菌群衍生產(chǎn)物，如STING激動劑cdAMP通過IFN-I調(diào)節(jié)TME中先天免疫細(xì)胞的相互作用和抗腫瘤應(yīng)答反應(yīng)。
4，高纖維飲食可調(diào)節(jié)菌群，誘導(dǎo)IFN-I，增加DCs，改善抗腫瘤應(yīng)答
腸道菌群組成與癌癥治療效應(yīng)有關(guān)。SPF小鼠在EL4腫瘤植入前喂飼高纖維飲食（FD）或ABX來調(diào)控小鼠腸道菌。發(fā)現(xiàn)與對照飲食的小鼠相比，F(xiàn)D小鼠的EL4腫瘤的發(fā)生率和總DCs的絕對數(shù)量增加，且出現(xiàn)較低的癌癥風(fēng)險和自發(fā)腫瘤生長抑制狀態(tài)（圖4A-C）。MC38模型證實FD可重塑腫瘤內(nèi)MPs構(gòu)成，增加DCs和Mo，減少Macs（圖4D-H）。更重要的是FD顯著增強抗PD-1和抗PD-L1治療的療效（圖4I-J）。結(jié)果：調(diào)控菌群可以改變TME的構(gòu)成，特別是DCs比例，進(jìn)而調(diào)控抗腫瘤應(yīng)答能力。
5，Akkermansia muciniphila可觸發(fā)TME中IFN-I-NK-DC軸
為探索IFN-I-NK細(xì)胞軸在FD誘導(dǎo)TME重塑中的作用，將FD飼養(yǎng)的小鼠糞便移植（FMT）到GF動物體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)FD移植后的GF鼠腫瘤中IFN-I基因水平更高，表達(dá)Ifnb1的Mo比例更高，NK細(xì)胞的Xcl1表達(dá)增加（圖5A）。證實FD小鼠菌群通過IFN-I重塑TME，調(diào)節(jié)DCs含量增加和抗腫瘤應(yīng)答能力。
為評估由FD引起的菌群的變化，對不同地區(qū)繁育小鼠進(jìn)行FD飼喂后進(jìn)行糞便16S rRNA測序，發(fā)現(xiàn)FD飼喂足以誘導(dǎo)類似的腸道菌群組成（圖5B）。而菌群中α-多樣性減少，phyla Verrucomicrobia與Proteobacteria豐度增加，Firmicutes減少（圖5C）。然后構(gòu)建transkingdom網(wǎng)絡(luò)預(yù)測，網(wǎng)絡(luò)由13個細(xì)菌節(jié)點和4個表型節(jié)點組成。Akkermansia與cDC浸潤呈正相關(guān)，與腫瘤負(fù)荷呈負(fù)相關(guān)，表明Akkermansia與腫瘤控制有關(guān)（圖5D）。
為探索單一類型微生物是否足以誘發(fā)TME中的免疫變化，利用雙位數(shù)的間性中心（BiBC）分析衡量網(wǎng)絡(luò)中單個節(jié)點影響，發(fā)現(xiàn)Akkermansia具有最高的BiBC得分（圖5E），成為介導(dǎo)FD調(diào)節(jié)的DCs和腫瘤生長表型的最佳候選菌。為測試Akkermansia的預(yù)測調(diào)節(jié)作用，在腫瘤植入前，將Akkermansia muciniphila (Akk) 單克隆鼠與GF小鼠相比，發(fā)現(xiàn)DCs明顯增加，pro/antitumor中Macs比率明顯降低，抑制腫瘤生長（圖5F-G）。
為驗證Akk利于重塑TME是通過STING-IFN-I路徑實現(xiàn)。采用液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）測量細(xì)菌產(chǎn)生的CDNs（cdAMP，c-di-guanosine monophosphate [cdGMP]和c-GAMP），發(fā)現(xiàn)Akk以產(chǎn)生cdAMP為主（圖5H）。分析來自SPF、GF或GF+Akk的小鼠腸道內(nèi)容物，發(fā)現(xiàn)SPF小鼠可產(chǎn)生三種CDNs，GF小鼠中未檢測到，而Akk可誘導(dǎo)GF小鼠生成cdAMP（圖5I），證實Akk在體內(nèi)主要誘導(dǎo)生成cdAMP。
為檢測cdAMP的生物活性及其誘導(dǎo)IFN-I的潛力，將熱滅活A(yù)kk或其培養(yǎng)上清與STING-IRF3細(xì)胞在有或無STING抑制劑的情況下共同培養(yǎng)，兩者均可誘導(dǎo)STING介導(dǎo)的IRF3激活（圖5J）。然后探索Akk是否也能調(diào)節(jié)體內(nèi)IFN-I-NK細(xì)胞軸，發(fā)現(xiàn)GF+Akk的TME中產(chǎn)生Ifnb1的Mo和NK細(xì)胞的Xcl1表達(dá)增加（圖5K）。證實Akk的存在與TME中IFN-I-NK-DC軸的激活促進(jìn)抗腫瘤應(yīng)答之間的直接聯(lián)系。
6，瘤內(nèi)Mo-IFN-I-NK-DC相互作用與黑色素瘤患者對ICB的反應(yīng)相關(guān)
菌群如何影響癌癥患者對ICB藥物的應(yīng)答？為探究這個問題，通過重新分析經(jīng)ICB治療黑色素瘤患者隊列的RNA-seq數(shù)據(jù)[1]，發(fā)現(xiàn)IFN-I基因與Mo、NK細(xì)胞和DCs之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖6A）。在缺乏菌群的小鼠和無應(yīng)答者（NR）腫瘤中，抑制腫瘤的MPs細(xì)胞類型和細(xì)胞因子/趨化因子的基因特征明顯降低（圖6B）。此外，重分析在接受ICB治療的黑色素瘤患者的驗證隊列中觀察到類似的結(jié)論[2]，即Mo、IFN-I、趨化因子、DCs、CDC1和IL15RA基因高表達(dá)與治療后總體生存率的提高顯著相關(guān)，而趨化因子產(chǎn)生與NK細(xì)胞功能有關(guān)（圖6C-D）。在ICB應(yīng)答者（R）和NR的TME中觀察到的治療效果差異，支持菌群通過重編程TME先天免疫細(xì)胞影響個體對ICB的應(yīng)答反應(yīng)。
7，菌群調(diào)控IFN-I和TME中的MPs細(xì)胞構(gòu)成，以促進(jìn)ICB治療作用
為了驗證在R和NR個體的TME免疫成分差異與菌群之間調(diào)控關(guān)系，對來自ICB治療的3個R和個NR個體進(jìn)行FMT，即糞便分別移植給GF鼠（圖7A）。接受R-FMT的GF鼠TME中的Mo獲得刺激性表型，與SPF相似。相反，接受NR-FMT的GF鼠的MPs向Macs傾斜（圖7B-C），類似于GF。NR-FMT小鼠的腫瘤內(nèi)DCs和Mo也顯著減少，促進(jìn)/抗腫瘤Macs比率增加，NK細(xì)胞有減少趨勢（圖7D）。此外，NR-FMT腫瘤降低Ifnb1表達(dá)并導(dǎo)致NR-FMT小鼠的腫瘤生長抑制性差（圖7E-F）。證明菌群、腫瘤內(nèi)IFN-I和ICB反應(yīng)之間存在因果調(diào)控關(guān)系。
最后從臨床角度驗證調(diào)控關(guān)系，利用一項I期臨床試驗中，患有抗PD-1難治性轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者接受FMT后獲得有效應(yīng)答再次接受抗PD-1治療，對治療有效人群（trial-R）和無效人群（trial-NR）腫瘤的RNA-seq數(shù)據(jù)[3]重分析，發(fā)現(xiàn)IFN-α應(yīng)答是FMT后上調(diào)的首要途徑之一（圖7G）。此外，Mo、IFN-I、NK細(xì)胞、趨化因子、DCs、cDC1s、IL-15/IL-15RA和CD8 T細(xì)胞的基因特征在FMT后的trial-R組中均出現(xiàn)升高（圖7H）。相對于基線水平（FMT前），以上基因特征在FMT后試驗trial-R組腫瘤中有所增加，但在trial-NR組中保持不變（圖7I）。說明菌群、瘤內(nèi)IFN-I-NK-DC軸，以及癌癥患者對ICB的反應(yīng)之間存在明顯的因果調(diào)控關(guān)系。
通過對以上內(nèi)容的學(xué)習(xí)，主要結(jié)論歸納為以下幾點：
1，菌群產(chǎn)生的STING激動劑（cdAMP）誘導(dǎo)TME中Mo產(chǎn)生IFN-I，觸發(fā)抗腫瘤作用。
2，Mo調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的招募和激活以及隨后的NK與DCs間的調(diào)控關(guān)系。
3，破壞菌群導(dǎo)致Mo/IFN-I/NK/DC信號傳導(dǎo)異常，Mo分化為促腫瘤Macs。
4，F(xiàn)D可調(diào)節(jié)菌群產(chǎn)生cdAMP，觸發(fā)IFN-I途徑并改善抗腫瘤應(yīng)答反應(yīng)。
5，移植來自ICB 應(yīng)答個體的菌群可誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)IFN-I，重塑TME，利于ICB應(yīng)答。
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