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大家好！今天給大家介紹一篇發(fā)表在Genomics, Proteomics & Bioinformatics (IF:6.409)上的鑒定人視網膜色素上皮中與衰老相關的蛋白質和功能改變的（Identification of age-associated proteins and functional alterations in human retinal pigment epithelium）文章。視網膜色素上皮（RPE）具有滋養(yǎng)和支持神經視網膜等功能，對老年性視網膜病變的發(fā)病機制具有重要意義。然而，REF在衰老過程中分子變化仍然不是十分清楚。在本篇文章中，作者對10到67歲的18例樣本中分離人類原發(fā)性RPE（hRPE）細胞并進行定量蛋白質組學分析。結果表明RNF123和RNF149相關的泛素化在保護hRPE細胞免受衰老過程中氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。此外，在衰老的hRPE細胞中，細胞內和分泌蛋白中凋亡信號通路上調而內質網組織下調。下面，就讓我們看看這篇文章的具體分析內容吧~
流程圖：
結果：
1.本研究整體流程
首先，作者根據(jù)眼睛捐贈者的年齡將樣本分為三組，分別為青年組4例（Y，10-18歲），中年組7例（M，35-41歲）和老年組7例（O，55-67歲）。分離hRPE細胞并培養(yǎng)兩代。為了鑒定不同分組下hRPE細胞系之間細胞內和分泌蛋白質組的變化模式，作者使用TMT-10plex進行定量蛋白質組學。在hRPE細胞的第三代傳代時，提取和消化細胞內和分泌蛋白并使用TMT標記。對樣本使用TMT-10plex隨機標記來消除批次效應并進行LC-MS。
2.hRPE細胞的蛋白質組特征
在7921個細胞內蛋白中鑒定到74502條肽段，平均覆蓋度為25.1%。在3843個分泌蛋白中鑒定到27930條肽段，平均覆蓋度為17.4%（圖1A）。其中有5735個細胞內蛋白和2455個分泌蛋白在所有樣本中進行定量。質控結果表明，細胞內蛋白的變異系數(shù)（CV）不超過2.55%而分泌蛋白的CV不超過3.22%，豐富度前10的細胞內蛋白分別為PLEC,AHNAK,MUH9,FLNA,VIM,FLNC,PRKDC,ACTG1,MACF1和DYNC1N1（圖1B），而分泌蛋白分別為COL1A1,COL1A2,C3,FN1,FLNA,ACTN4,FLNC,FBN1,AGRN和LAMB1（圖1C）。
為了進一步描述hRPE細胞的特征，作者進行了PANTHER和GO亞細胞定位分析。PANTHER分析表明，細胞內蛋白包括代謝物相互轉化酶，核酸結合蛋白和蛋白質修飾酶（圖1D）。GO亞細胞定位分析表明，大多數(shù)細胞內蛋白屬于膜，細胞核和囊泡。此外，作者還量化了93種視網膜中未鑒定到的蛋白質（圖2E）。
3.衰老過程中hRPE蛋白質組學特征的變化
為了闡明hRPE分子功能變化與衰老之間的關系，作者使用蛋白質聚類分析鑒定與衰老相關亞型（圖2A），共鑒定到10個簇（C1-C10）。其中，簇C1,C5和C6蛋白富集通路在Y和M組相對穩(wěn)定而在O組發(fā)生顯著變化。在O組中，C1相關通路上調而C5和C6相關通路下調。因此，簇C1,C5,C6和C7蛋白富集的通路可能與衰老相關RD的病理過程密切相關。
為了進一步分析不同階段（O vs Y，M vs Y和O vs M）之間的關系并解釋衰老過程對hRPE的影響，作者進行GSEA分析。O vs Y和O vs M具有類似的富集模式（圖2B），說明這些蛋白質在O期發(fā)生了明顯變化，這可能是RPE相關疾病在老年時容易發(fā)病的原因。此外，在衰老過程中hRPE細胞在某些過程下調而在其他過程上調。
4.衰老相關蛋白和功能
為了鑒定hPRE細胞中與衰老相關的蛋白，作者計算不同分組中蛋白的皮爾森相關系數(shù)。將r閾值設置為0.5，P閾值設置為0.05，在Y vs O分組下有46個蛋白上調和35個蛋白下調（圖3C）。隨后，作者對這些蛋白進行GO和KEGG富集分析。GO分析表明FMNL3,COL18A1,ATPIF1和ERAP1等下調蛋白有助于血管生成（圖3D），RNF149,RNF123,FBXO9,PCNP和MALT1等上調蛋白參與蛋白質泛素化（圖3D）。PRKCA,PRKCI,BCAR1,GNAI2和TIGB3參與RAP1信號通路（圖3E）。
5.RNF123,RNF149和蛋白質泛素化可以保護RPE在衰老過程中免受氧化損傷
為驗證作者蛋白質組學數(shù)據(jù)結果的可靠性并解釋RNF123,RNF149，泛素化蛋白與衰老之間的關系，作者進行蛋白質印記分析（WB）。作者發(fā)現(xiàn)RNF123,RNF149和泛素化蛋白水平會隨著年齡的增長而增加（圖3A和3B）。為驗證RNF123,RNF149和相關泛素化蛋白在RPE衰老過程中的作用，作者分析使用梯度濃度的氧化損傷誘導劑（H2O2和D-gal）處理的ARPE-19和HEK293T細胞。WB結果表明，RNF123,RNF149和泛素化蛋白的水平隨D-gal和H2O2濃度的增加而增加。然而，這種現(xiàn)象會被一種天然抗氧化劑葉黃素逆轉（圖3C和3D）。接下來，作者使用具有一定濃度梯度的H2O2處理Y組和O組的hRPE細胞。CCK8活力結果表明，O組的hRPE細胞更易氧化損傷。WB結果表明，氧化損傷與蛋白質泛素化上調有關。為了研究RNF123,RNA149與蛋白質泛素化水平之間的關系，結果表明，RNF123和RNF149過表達會顯著增加ARPE-19和HEK293T細胞中蛋白質泛素化水平。這種現(xiàn)象同樣可以使用葉黃素逆轉（圖3E和3F）。為研究RNF123和RNF149在RPE細胞中的功能，作者研究RNF123和RNF149過表達猴ARPE-19細胞對氧化損傷的耐受性?；盍Ψ治霰砻?，過表達RNF123和RNF149后，ARPE-19細胞對H2O2的敏感性降低（圖3G）。由于，活性氧（ROS）的積累是細胞氧化損傷的指標。因此，作者定量H2O2處理的ARPE19細胞的ROS水平。結果表明，過表達RNF123和RNF149會到時ROS水平顯著降低（圖3H）?？偟膩碚f，ARPE-19細胞中過表達RNF123和RNF149 會抑制H2O2誘導生成的ROS水平。HEK293T細胞的結果與之類似。此外，衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）是細胞衰老的重要標志物。作者進一步定量過表達RNF123和RNF149后H2O2處理的ARPE-19細胞中SA-β-gal水平的變化。結果表明，SA-β-gal水平在H2O2處理的細胞中顯著增加（圖3I），然而過表達RNF123和RNF149后SA-β-gal水平降低。以上結果表明，過表達RNF123和RNF149會減少細胞在衰老過程中的氧化損傷，這與泛素化水平變化有關。因此，RNF123和RNF149和相關蛋白泛素化可能在保護RPE免受氧化損傷中發(fā)揮重要作用。
6.衰老相關的分泌表型和蛋白質
為鑒定與衰老相關的分泌表型，作者對分泌蛋白進行聚類分析，共鑒定到9個簇（C1-C9）（圖4A）。簇2中蛋白質富集的通路隨年齡增長而上調，這些通路與凋亡信號通路有關（圖2D）。然而，簇C9中蛋白富集的細胞組分組織和ER組織通路隨年齡增長而下調。隨后，作者進行皮爾森相關性分析，有38種蛋白上調和16種蛋白下調（圖4B）。
7.與衰老相關的分泌蛋白網絡改變
作者對分泌蛋白進行WGCNA分析，共鑒定到15個模塊（圖4C），相關性分析表明M7和M11模塊與衰老正相關，M9與衰老負相關。隨后，作者對模塊M7,M9和M11進行KEGG和GO富集分析。KEGG富集分析表明，M7和M11富集于RNA相關通路，泛素介導的蛋白水解，核苷酸切除修復等（圖4D），M9富集于丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝和精氨酸生物合成等通路。GO富集分析表明，M7的核糖體結構組分，M11的翻譯調節(jié)活性及M7和M11的結合相關過程會隨著年齡的增長而上調。然而，酶活性，NAD結合和輔酶結合會隨著年齡的增長而下調。
8.衰老過程中hRPE細胞中特異性改變的分泌蛋白
由于，分泌蛋白的特異性改變可能對衰老過程中細胞間通訊十分重要。因此，作者接下來分析了hRPE細胞中共有的細胞內蛋白和分泌蛋白，共有2067個。其中有147個分泌蛋白發(fā)生顯著變化，包括IMPAD1,CPD,RMDN3,MGAT1,MYEF2和PAPOLA（圖5A）。使用Cytoscape中ClueGo軟件對特異性改變的分泌蛋白進行功能富集分析，共鑒定到108個顯著富集的GO 功能（圖5C）。這些生物學過程可能在RPE的細胞間通訊中發(fā)揮重要作用。
總結：
RPE在滋養(yǎng)和支持神經視網膜方面發(fā)揮重要作用，在衰老相關的視網膜病變發(fā)病機制中起到關鍵作用。在這篇文章中，作者全面描述了hRPE細胞的蛋白質組和分泌組特征。此外，作者還揭示了hRPE在衰老過程中的變化并鑒定與衰老相關的蛋白質及其相關功能?？偟膩碚f，作者的研究描述了人類RPE在衰老過程中的詳細分子特征，有助于未來RPE和相關視網膜疾病的研究。
