掃碼聯(lián)系客服
今天給大家?guī)硪黄?strong>液-液相分離調(diào)節(jié)基因與消化道腫瘤臨床相關(guān)性的生信分析，作者利用TCGA數(shù)據(jù)表征了LLPS調(diào)節(jié)因子在3種消化道腫瘤類型（如COAD，STAD和ESCA）中的表達(dá)分析。研究思路設(shè)計(jì)精美，這就給各位解讀一下！
文章“Systematic Analysis of Molecular Characterization and Clinical Relevance of Liquid-Liquid Phase Separation Regulators in Digestive System Neoplasms”發(fā)表在《Front Cell Dev Biol》，影響因子6.081分。
研究背景
1、不會(huì)混合的兩種液體（如油和水）之間的分離被稱為液-液相分離（liquid-liquid phase separation，LLPS）。例如，將一湯匙醋倒入水中，只需短暫攪拌即可將兩種液體完全混合。但是將一湯匙油倒入水中油會(huì)聚結(jié)成小滴，無法如何攪拌也不混合。某些蛋白質(zhì)的行為類似于液體，而某些液體的蛋白質(zhì)卻不會(huì)混合在一起。然而，關(guān)于這些液體樣蛋白如何影響細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)與行為卻知之甚少。這樣的蛋白質(zhì)不溶解在細(xì)胞內(nèi)。相反，它們可以與自身或與其它蛋白質(zhì)凝結(jié)，從而使細(xì)胞能夠?qū)⒛承?strong>生化活性區(qū)分開，而不必將其包裹在膜結(jié)合的細(xì)胞器內(nèi)。
2、蘇州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所的周芳芳教授和浙江大學(xué)生命科學(xué)研究所張龍教授預(yù)2021年在《Signal Transduction and Targeted Therapy》雜志上發(fā)表了題為“Liquid-liquid phase separation in human health and diseases”的綜述，系統(tǒng)性地介紹了液相分離在人類生理狀態(tài)和疾病狀態(tài)下的功能作用。其中提部分介紹了LLPS如何調(diào)控轉(zhuǎn)錄，舉文中一例：不同的轉(zhuǎn)錄因子，包括胚胎干細(xì)胞多能性轉(zhuǎn)錄因子OCT4、配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子雌激素受體和酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4，均可以與共激活因子復(fù)合物Mediator形成相分離的凝聚物。凝聚物可以通過影響啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子、管家基因調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。
3、LLPS還可以影響免疫應(yīng)答，T細(xì)胞受體（TCR）的信號(hào)簇可以相分離成凝聚物，TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子CD45則被排除在凝聚體之外，以確保T細(xì)胞的活化。這些免疫反應(yīng)凝聚體的形成，為干預(yù)治療提供了潛在的新途徑。
結(jié)果展示
Genetic Alterations of LLPS Regulators in Digestive System Neoplasms
消化系統(tǒng)腫瘤中LLPS調(diào)控因子的基因改變
作者共納入了156個(gè)LLPS調(diào)控基因。評(píng)估了156個(gè)LLPS調(diào)節(jié)因子的突變表達(dá)分析，確定消化系統(tǒng)腫瘤中LLPS調(diào)節(jié)因子的突變水平。
在TCGA的COAD，STAD和ESCA隊(duì)列中個(gè)體作者的突變頻率很高。其中，421個(gè)COAD樣本中，328個(gè)（77.91%）有LLPS調(diào)節(jié)因子突變（圖 1A)。其中，突變頻率最高的基因是TP53（58%），其次是BRD4（8%），ITSN1（8%），TNRC6B（10%）和FBN1（10%）（圖 1A)。同時(shí)，在441個(gè)STAD樣本中，296個(gè)（67.12%）具有LLPS調(diào)節(jié)劑突變（圖 1C).其中，高頻突變基因前10名包括TP53（0.5）、FBN1（0.1）、AR（0.07）、POLR2A（0.05）、PML（0.05）、BRD4（0.05）、AGO2（0.04）、TNRC6B（0.04）、HTR1A（0.04）和ITSN1（0.04）（圖 1C)。最后，在184個(gè)ESCA樣本中，172個(gè)（93.48%）具有LLPS調(diào)節(jié)劑突變（圖 1E)。其中，突變頻率前10名的基因包括TP53（0.87），F(xiàn)BN1（0.06），KPNB1（0.04），MED1（0.03），BRD4（0.03），PML（0.03），DLG4（0.02），F(xiàn)US（0.02），LCP2（0.02）和NPHS1（0.02）（圖 1E)。通過結(jié)合對(duì)DSN中LLPS調(diào)節(jié)因子遺傳改變的分析，我們發(fā)現(xiàn)BRD4，F(xiàn)BN1和TP53在所有類型的消化腫瘤中均發(fā)生突變（圖1A、C、E)。本研究還進(jìn)行了LLPS基因共表達(dá)析，在所有類型的消化腫瘤均可發(fā)現(xiàn)TP3突變（圖 1B，D，F(xiàn))。這表明LLPS調(diào)節(jié)基因的突變可能會(huì)推動(dòng)消化道腫瘤的進(jìn)展。
Genetic Alterations of LLPS Regulators Were Related to the Progression of Digestive System Neoplasms
LLPS調(diào)控基因的改變與消化系統(tǒng)腫瘤的進(jìn)展有關(guān)
突變特征可以反映腫瘤的病理過程。除了環(huán)境因素, 也有文獻(xiàn)報(bào)道諸如APOBEC和DNA修復(fù)基因等體內(nèi)的改變參與腫瘤細(xì)胞的基因突變。在本研究中,作者分析了APOBEC的和非APOBEC富集的COAD、STAD和ESCA樣本之間的突變負(fù)荷。如圖2所示, 作者發(fā)現(xiàn)所有LLPS調(diào)控基因的總突變負(fù)荷在APOBEC -富集的STAD樣本中明顯降低。作者在COAD樣本中發(fā)現(xiàn)與非APOBEC富集的樣本相比TARDBP、CBX1、SQSTM1、DDX4和TIAL1突變?cè)贏POBEC富集的樣本中明顯減少 (圖2A)。在STAD樣本中, FBN1突變受到了下調(diào)。然而, 與非APOBEC -富集樣本相比, UBC突變?cè)贏POBEC富集的樣本中顯著下調(diào)(圖2C)。對(duì)于ESCA，BRD4 *、HNRNPH1、XPO1、TP53、ESR1、IPO5、MED1和UBQLN2上的突變與非APOBEC富集的樣本相比，APOBEC富集的樣本中含量較高(圖2E)。
此外，作者分析了COAD中LLPS調(diào)控基因的變異等位基因頻率(VAF)，發(fā)現(xiàn)TP53、NPHS1、TNRC6B、ITSN1和TNPO1的VAF值較高(圖2B)。LLPS調(diào)控基因的VAF分析顯示，TP53、PML、AR、TNRC6B、ITSN1和BRD4的值較高(圖2D)。最后，對(duì)ESCA中LLPS調(diào)控基因的VAF分析顯示，TP53、PML、BRD4、DLG4和PTPN1可能是ESCA進(jìn)展的驅(qū)動(dòng)基因(圖2F)。
Genetic Alterations of LLPS Regulators Were Related to the Prognosis of Digestive System Neoplasms
LLPS調(diào)控基因表達(dá)水平與消化系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后相關(guān)
為了進(jìn)一步證明LLPS調(diào)控基因在消化系統(tǒng)腫瘤中的臨床重要性，作者分析了LLPS調(diào)控基因的表達(dá)水平改變與COAD、STAD和ESCA臨床特征之間的關(guān)系。如圖3所示，根據(jù)腫瘤TNM分期分析顯示，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的M0 COAD樣本中GATA2和ITSN1突變顯著富集，M1 COAD樣本中TP53突變顯著富集，Mx COAD樣本中HTR1A突變顯著富集(圖3A)。在STAD樣本中，T1分期的樣本的DYRK3、YTHDF1、HTR1A、ELN、PRNP、SUMO3、UBQLN2、CBX5、LCP2、NCK1、EWSR1、YTHDF2和SOS1突變水平顯著升高。ABL1、PRNP、ESR1突變水平在T2 STAD樣本中顯著升高，DDX3X、TIA1、CBX2、KPNB1、DAXX、XPO1、MORC3、GATA3、ITSN1、SOS1、TNRC6B、DYRK3、PML、FBN1、ESR1、IPO5突變水平在T4/x STAD樣本中顯著升高(圖3B)。通過ESCA樣本分析，結(jié)果顯示MED1突變更可能與囊性、粘液性和漿液性腫瘤有關(guān)。TP53突變更可能與鱗狀細(xì)胞腫瘤相關(guān)(圖3C)。
接下來，作者進(jìn)行Cox回歸分析，以確定LLPS基因突變與消化道腫瘤患者總生存期 OS之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，CPEB3、SFPQ、APP、SURF6、XPO1和HNRNPA2B1突變與與COAD OS時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。通過分析STAD樣本，作者發(fā)現(xiàn)LCP2、KPNA2、PIAS2、PML、MED1和SURF6突變與STAD 患者的OS時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。然而，沒有觀察到在ESCA中LLPS調(diào)控基因突變水平與OS之間存在顯著相關(guān)性。
Predicting the Drug Response in Digestive System Neoplasms Based on Genetic Alterations of LLPS Regulators
基于LLPS調(diào)控因子的基因改變預(yù)測(cè)消化系統(tǒng)腫瘤中的藥物反應(yīng)
接下來，作者根據(jù)LLPS調(diào)控基因的表達(dá)水平預(yù)測(cè)了在消化系統(tǒng)腫瘤中的藥物反應(yīng)。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA修復(fù)、耐藥性、組蛋白修飾、核激素受體、磷脂酶、蛋白酶相關(guān)的藥物可能在發(fā)生對(duì)應(yīng)突變的COAD(圖4A)、STAD(圖4B)和ESCA(圖4C)患者中有較好的應(yīng)答。
LLPS Regulators Were Significantly Differently Expressed in Digestive System Neoplasms
LLPS調(diào)控因子在消化系統(tǒng)腫瘤中表達(dá)顯著不同
作者接下來利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析LLPS調(diào)控基因在消化系統(tǒng)腫瘤中的表達(dá)水平。如圖5所示，作者發(fā)現(xiàn)LLPS在COAD、STAD和ESCA中具有不同的表達(dá)模式(圖5A)。例如，RPL23A、RPL5、NPM1、TP53、CBX2、SURF6、MYC、PRMT1、POU5F1、SYN1、RARA、SQSTM1、CBX5、CBX1、LBR、IPO5、FMR1、TIA1和SGOL1在COAD樣本中均顯著上調(diào) (圖5)。NCK1、MORC3、PRNP、HOMER3、UBC和PML在ESCA樣品中均顯著高表達(dá) (圖5A)，而ITSN1、CPEB3、TNRC6B、SYN2、DYRK3、FYN、ESR1、GATA3、LAT、GRAP2、LCP2、GATA2、MAPT、HSPB2、ELN、AR、FBN1和DLG4在STAD樣品中均顯著高表達(dá) (圖5A)。此外，作者還分析了LLPS調(diào)控基因在腫瘤和正常樣本之間是否存在表達(dá)差異?？傊髡甙l(fā)現(xiàn)21個(gè)LLPS調(diào)控基因在COAD樣本中存在差異表達(dá)(圖5B,C)， 38個(gè)LLPS調(diào)控基因在STAD樣本中存在差異表達(dá)(圖5B,C)。26個(gè)LLPS調(diào)控基因在READ樣本中存在差異表達(dá)(圖5B,C)， 21個(gè)LLPS調(diào)控基因在ESCA樣本中存在差異表達(dá)(圖5B,C)。只有2個(gè)LLPS調(diào)控基因在所有4種消化系統(tǒng)腫瘤中存在異常表達(dá)，包括SYN2和MAPT (Figure5C)。如圖5D所示，與正常樣本相比，SYN2和MAPT在所有腫瘤樣本中都過表達(dá)。
LLPS Regulators Were Significantly Related to Tumor Immune Infiltration in Digestive System Neoplasms
在消化系統(tǒng)腫瘤中，LLPS調(diào)節(jié)基因與腫瘤免疫浸潤(rùn)顯著相關(guān)
新的研究表明，腫瘤免疫浸潤(rùn)在預(yù)測(cè)人類癌癥的免疫治療反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。因此，作者全面分析了在COAD、ESCA和STAD樣本中LLPS調(diào)節(jié)基因表達(dá)與腫瘤免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性。如圖6所示，我們發(fā)現(xiàn)LLPS調(diào)控基因與消化系統(tǒng)腫瘤中的腫瘤免疫浸潤(rùn)顯著相關(guān)(圖6A , D)。例如，C6orf150與活化的樹突狀細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞顯著相關(guān)(圖6A)。TNRC6B與活化的樹突狀細(xì)胞和記憶B細(xì)胞呈正相關(guān)，與休眠NK細(xì)胞和活化的肥大細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)(圖6C)。另外，MYC、RPL5、NONO、LBR、NPM1和IPO5與DSNs中的CD4、記憶和活化T細(xì)胞最為顯著地正相關(guān)(圖6A, D)。GRAP2、LAT、PML、LCP2、HNRNPD和GATA3與消化系統(tǒng)腫瘤中的CD8 T細(xì)胞呈最顯著正相關(guān) (圖6A D)。FMR1、DYRK1A、DDX3X、MAP1LC3B、TIAL1、YTHDF3、HNRPDL、NCK1、SOS1、XPO1、TIA1、MORC3和TNPO1與消化系統(tǒng)腫瘤中的調(diào)控性T細(xì)胞(Tregs)呈最顯著負(fù)相關(guān)(圖6A D)。
Construction of LLPS Regulators Signature in Digestive System Neoplasms
消化系統(tǒng)腫瘤中LLPS調(diào)控基因特征的構(gòu)建
接下來，作者構(gòu)建了一個(gè)基于LLPS調(diào)控基因的消化系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，以量化單個(gè)消化系統(tǒng)腫瘤患者的風(fēng)險(xiǎn)模式。LASSO回歸與十倍交叉驗(yàn)證，以得到最優(yōu)lambda值。結(jié)果顯示，11個(gè)、7個(gè)和6個(gè)基因分別與CRC、ESCA和STAD的OS顯著相關(guān)(圖7A)、圖7B和圖7C)。作者基于消化系統(tǒng)腫瘤中這些基因的多變量Cox回歸建立了一個(gè)預(yù)后模型。如圖9所示，COAD的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= (0.1422)*CBX2 + (0.303) *CSTF2T + (0.0738)*DLG4 + (0.3897)*FUS + (0.145)*FYN + (0.1619)*HOMER3 + (0.0388)*MAPT + (0.082)*MYC + (0.1419)*NCK1 + (0.3473)*SFPQ + (0.1166)*SYN1(圖7D)。ESCA的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= (0.4195)*DAXX + (0.4709)*FMR1 + (0.2345)*GATA2 + (0.0365)*IPO5 + (0.1818)*MAPT + (0.6283)*NPM1 + (0.0282)*TNPO1(圖7E)。STAD的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分= (0.1379)*CSTF2 + (0.0593)*LBR + (0.3102)*SURF6 + (0.137)*SYN1 + (0.0395)*SYN2 + (0.0804)*YTHDF2(圖7F)。然后根據(jù)整個(gè)樣本簽名的中位數(shù)將消化系統(tǒng)腫瘤分為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高組和低組。結(jié)果顯示，高危組的OS比低危組短 (圖7D , F)。此外，作者接下來對(duì)建立的CRC、STAD和ESCA評(píng)分進(jìn)行了時(shí)間依賴性ROC分析(圖7G, I)。在1、3和5年OS時(shí)，CRC模型的AUC值分別為0.691、0.643和0.653(圖7G)。STAD在1-、3-和5年OS時(shí)的AUC值分別為0.716、0.793和0.730(圖7H)。ESCA的模型在1年、3年和5年OS的AUC值分別為0.662、0.625和0.511(圖7I)。
The Levels of LLPS Regulators Signature Associated With Immune Infiltration
與免疫浸潤(rùn)相關(guān)的LLPS調(diào)控因子水平
很少有研究報(bào)道TME浸潤(rùn)免疫細(xì)胞與LLPS調(diào)控基因的關(guān)系。在本研究中，作者研究了LLPS調(diào)節(jié)基因在TME中的作用。作者利用CIBERSORT方法分析了LLPS調(diào)控因子特性中免疫細(xì)胞成分的變化，并首次系統(tǒng)地揭示了LLPS調(diào)控基因可能與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)有顯著相關(guān)性。如圖8所示，結(jié)果顯示LLPS調(diào)控因子簽名評(píng)分與COAD中CD4 + T細(xì)胞浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和髓樣樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著正相關(guān)(圖8A)。結(jié)果顯示，LLPS調(diào)控基因模型評(píng)分與STAD中B細(xì)胞、CD4 + T細(xì)胞浸潤(rùn)、CD8 + T細(xì)胞浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、髓樣樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平顯著正相關(guān)(圖8B)。此外，LLPS調(diào)控基因模型評(píng)分與ESCA細(xì)胞中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈正相關(guān)。此外，這些生物信息學(xué)分析與上述LLPS參與調(diào)節(jié)免疫信號(hào)的分析一致(圖8C)。這些提示LLPS模型可能預(yù)測(cè)消化系統(tǒng)腫瘤對(duì)免疫治療的反應(yīng)。
Comprehensively Bioinformatic Analysis of LLPS Regulators in Digestive System Neoplasms
消化系統(tǒng)腫瘤中LLPS調(diào)控基因的綜合生物信息學(xué)分析
接下來，作者進(jìn)行了KEGG和GO分析，以揭示LLPS調(diào)節(jié)基因在消化系統(tǒng)中的潛在作用。KEGG分析顯示，COAD中不同表達(dá)的LLPS調(diào)控基因與ErbB和T細(xì)胞受體信號(hào)通路顯著相關(guān)(圖9A)， ESCA中不同表達(dá)的LLPS調(diào)控基因與結(jié)直腸癌、ErbB信號(hào)通路、慢性髓系白血病、急性髓系白血病、子宮內(nèi)膜癌、腫瘤轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)、mRNA監(jiān)測(cè)通路、化學(xué)致癌-受體激活、和RNA轉(zhuǎn)運(yùn)(圖9B)。非常有趣的是，GO分析顯示LLPS調(diào)控因子主要富集于T細(xì)胞受體信號(hào)通路、抗原受體介導(dǎo)的信號(hào)通路以及對(duì)T細(xì)胞激活的調(diào)控，這表明它們可能與調(diào)控COAD中的免疫應(yīng)答有關(guān)(圖9C)。與此同時(shí),也觀察到LLPS調(diào)控基因參與調(diào)控T細(xì)胞受體信號(hào)通路。此外，作者發(fā)現(xiàn)STAD和ESCA中的LLPS調(diào)控基因主要參與RNA代謝過程的調(diào)控(圖9D,E)。例如，STAD和ESCA中的LLPS調(diào)控基因參與調(diào)控mRNA代謝過程、RNA剪接、miRNA結(jié)合、調(diào)控RNA結(jié)合和mRNA前結(jié)合。
Construction of LLPS Regulators Signaling Network in Digestive System Neoplasms
消化系統(tǒng)腫瘤中LLPS調(diào)控基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
為了解LLPS調(diào)節(jié)基因如何影響消化系統(tǒng)腫瘤中的信號(hào)通路改變，作者構(gòu)建了一個(gè)LLPS調(diào)控基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。我研究結(jié)果表明，在COAD中，LCP2、ABL1、GRAP2、NCK1和PRNP調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體信號(hào);FYN、CPEB3、DLG4、EIF4EBP2、PRNP、MAPT與認(rèn)知記憶相關(guān)(圖10A、C)。STAD中，CSTF2、PTBP1、HNRNPA1L2、TIA1、HNRNPA2B1、TARDBP和NUP98參與RNA剪接調(diào)控。KPNA2、MED1、HNRNPA2B1、TARDBP、NUP98和XPO1與核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和核轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控有關(guān)(圖10B)。在ESCA中，發(fā)現(xiàn)FUS、HNRNPA2B1、KPNA2、GATA3、TP53、MYC、PML、CGAS、NPM1、HNRNPA1和HNRNPD與DNA代謝過程調(diào)控有關(guān)，CSTF2、PSPC1、NONO、HNRNPA3、DAZAP1、FMR1、PTBP1、HNRNPA2B1、FUS和HNRNPD與RNA剪切有關(guān)(圖10D)。
總結(jié)
作者系統(tǒng)地分析了4個(gè)LLP調(diào)控因子，分析了這4個(gè)基因與消化系統(tǒng)腫瘤的預(yù)后、進(jìn)展和腫瘤微環(huán)境的調(diào)控機(jī)制。此外，作者構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后模型，風(fēng)險(xiǎn)模型與患者地預(yù)后存在相關(guān)性，可以預(yù)測(cè)患者地預(yù)后。最后，腫瘤免疫分析結(jié)果顯示LLPS調(diào)控基因與CD4 + T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD8 + T細(xì)胞的浸潤(rùn)水平顯著正相關(guān)。
