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Hi, guys~ 好久不見呀！今天小編跟大家分享的是Molecular Cancer上的一篇單細(xì)胞文章，該雜志的IF已經(jīng)41+了啊?。。∽屛覀兛纯?，在單細(xì)胞文章數(shù)量呈井噴式增長(zhǎng)的當(dāng)下，該研究是怎么僅憑四個(gè)樣本以及簡(jiǎn)單的分析沖出重圍的呢？話不多說，咱們看正文吧。
研究流程
本研究選擇的癌型是伴有破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞的胰腺未分化癌(UCOGCP)，這是胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的一種罕見亞型。作者收集了一名UCOGCP患者（pca_ai1）和三名PDAC患者（pca_0708, pca_0713,pca_0714）的手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)過組織解離、細(xì)胞純化、文庫(kù)構(gòu)建等，對(duì)18,376個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測(cè)序，然后對(duì)得到的scRNA?seq數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。接下來，就是常規(guī)的生信分析，包括細(xì)胞的聚類分析、可視化和注釋，軌跡擬時(shí)序分析，細(xì)胞通訊分析，功能富集，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，以及其他數(shù)據(jù)集和免疫組化的驗(yàn)證（圖1.A）。
研究結(jié)果
1、細(xì)胞聚類和注釋
在0.6的分辨率下，作者識(shí)別出了19個(gè)具有不同基因表達(dá)模式的細(xì)胞簇（圖1.D-E）。同三個(gè)PDAC樣本相比，UCOGC樣本中內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和髓系細(xì)胞占比更高。考慮到破骨細(xì)胞樣巨細(xì)胞（OGCs）可能起源于間質(zhì)上皮細(xì)胞，作者又分析了在cluster 13和cluster 15（I型導(dǎo)管細(xì)胞的兩個(gè)簇）中，間質(zhì)上皮細(xì)胞的標(biāo)志物EPCAM和KRT19以及OGC的標(biāo)志物CD68的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)cluster 15除表達(dá)KRT19外，還表達(dá)KRT81、PAEP 和 LINC01615，但不表達(dá)EPCAM（圖1.I）。對(duì)KRT81的免疫組化也證實(shí)了cluster 15含有OGC，表明 OGC 很可能起源于間充質(zhì)上皮細(xì)胞而不是髓系細(xì)胞(圖1.J)。
2、UCOGCP 中I 型導(dǎo)管細(xì)胞的異質(zhì)性
研究將I型導(dǎo)管細(xì)胞簇進(jìn)一步分成了四個(gè)subclusters（圖2.A-B），同其他樣本相比，UCOGCP富集上皮亞型subcluster 2、3（圖2.C-E）。其中，subcluster 3表達(dá)有限的上皮標(biāo)志基因EPCAM，但卻表達(dá)癌癥干細(xì)胞標(biāo)記基因CD44和NOTCH2，并顯著富集“MYC-TARGET_V1”通路，以及“細(xì)胞外基質(zhì)組織”、“創(chuàng)傷反應(yīng)”、“多細(xì)胞生物發(fā)育”、“白細(xì)胞黏附”等GO通路（圖3.F-G，J）?；赥CGA-PAAD數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證表明，這些通路的特征基因的高表達(dá)多與較差的生存相關(guān)。
基于此，作者又把subcluster 3重聚類為五個(gè)亞型（圖3.A-B），cluster 4和cluster 1表達(dá)癌癥干細(xì)胞樣細(xì)胞（CSCLCs）的標(biāo)記基因CD24, CD44和EPCAM，cluster 0和cluster 2 表達(dá)CD44 和 NOTCH2（圖3.C）。Cluster 0與上文中疑似OGC的cluster 15具有高度的重合（圖3.D），該亞型富集到了抗原呈遞、造血干細(xì)胞分化和G2/M負(fù)向調(diào)控等通路（圖3.E），軌跡分析和不同模塊的GO富集結(jié)果表明該簇可能是CSCLCs失調(diào)產(chǎn)生的多核細(xì)胞。
3、UCOGCP中導(dǎo)管細(xì)胞的軌跡分析
為了進(jìn)一步分析UCOGCP中上皮細(xì)胞簇的發(fā)育過程，研究將前面提到的cluster 13和cluster 15重新分成9個(gè)clusters（圖4.A-B），并進(jìn)行了軌跡分析。在得到的三個(gè)分支中，cluster 13和cluster 15屬于不同的分支（圖4.C-D）。不同狀態(tài)中高表達(dá)的基因富集的功能通路也存在差異（圖4.E），在決定細(xì)胞命運(yùn)走向時(shí)，起關(guān)鍵作用的基因有APOE, MUC13, NEAT1, SERPINE1, SRGN和TIM1（圖4.F）。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組熱圖可以發(fā)現(xiàn)E2F1、MYC、EGR4等轉(zhuǎn)錄因子在缺乏EPCAM的上皮細(xì)胞簇，即分支1中高度表達(dá)（圖4.G）。
4、UCOGCP中TAM細(xì)胞的異質(zhì)性
在最初的聚類中，研究發(fā)現(xiàn)UCOGCP中存在大量的腫瘤相關(guān)髓系(TAM)細(xì)胞。所以，作者將四個(gè)樣本中的TAM細(xì)胞又劃分為五個(gè)簇（圖5.A-C）。UCOGCP中的髓系細(xì)胞主要分布在cluster 2和cluster 3（圖5.D-E），在驗(yàn)證集中，這兩個(gè)簇的特征基因與OS相關(guān)（圖5.G）。通路富集分析的結(jié)果也表明了這些簇在代謝途徑上的不同（圖5.F）。
5、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性
接下來，作者分析了所有樣本中的成纖維細(xì)胞，共得到四個(gè)簇，都高表達(dá)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志基因ACAT2（圖6.A-D）。其中cluster 3來自UCOGCP樣本，與白細(xì)胞粘和MHCII 抗原呈遞相關(guān)（圖6.H）。
然后，作者又將腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞分為六個(gè)簇，它們高表達(dá)標(biāo)志基因PECAM1（圖7.A-C）。其中，86%的內(nèi)皮細(xì)胞來自UCOGCP樣本（主要分布在cluster 3和cluster 5），與UCOGCP是容易出血的腫瘤這一事實(shí)一致（圖7.D-E）。GSVA 分析表明每個(gè)簇富集到了不同的KEGG通路（圖7.F）。
6、細(xì)胞通訊
基于之前的細(xì)胞聚類和功能注釋，作者將UCOGCP中的細(xì)胞分成了22個(gè)簇（圖8.A-B）。通過分析破骨細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)水平，研究發(fā)現(xiàn)OGCs可能只是在形態(tài)上類似于破骨細(xì)胞，并不表達(dá)CD68（圖8.C）。細(xì)胞通訊分析的結(jié)果揭示了OGC和PSC、巨噬細(xì)胞_I/III、某些上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的強(qiáng)受體-配體相互作用（圖8.D）。其中，SPP1-CD44、CD74-MIF、CD74-COPD和CD74-APP等受體-配體對(duì)表現(xiàn)出強(qiáng)相互作用（圖8.E-F），這些特征基因的表達(dá)水平與預(yù)后顯著相關(guān)。
整個(gè)研究?jī)?nèi)容大體就是這樣，雖然是很經(jīng)典的單細(xì)胞分析流程，圖片也沒有很驚艷，但文章勝在選題，小編發(fā)現(xiàn)PUBMED中UCOGCP相關(guān)的文章寥寥無幾，單細(xì)胞相關(guān)的就更是相當(dāng)于沒有了，加上作者重點(diǎn)突出、層層遞進(jìn)，該有的都有，故事講的算是完整，而且人家用的是自測(cè)數(shù)據(jù)，再來那么一丟丟運(yùn)氣，這不就直接沖到40多分了！加油呀，各位打工人！Have a nice day~~~
參考文獻(xiàn)：
Wang, X., Miao, J., Wang, S. et al. Single-cell RNA-seq reveals the genesis and heterogeneity of tumor microenvironment in pancreatic undifferentiated carcinoma with osteoclast-like giant-cells. Mol Cancer 21, 133 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01596-8
