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大家好呀，今天分享的文章題為單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析穩(wěn)定和易損的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊之間不同的免疫環(huán)境，文章思路清晰，于今年一月發(fā)表在《Front Immunol》（IF = 8.786）上，讓我們來(lái)一起學(xué)習(xí)一下吧！
一、摘要
無(wú)論狹窄的程度如何，易損斑塊都是缺血性卒中和血栓性并發(fā)癥的重要原因。斑塊內(nèi)免疫微環(huán)境的變化似乎是影響斑塊特征的一個(gè)重要因素。然而，穩(wěn)定斑和易損斑之間的免疫微環(huán)境差異尚不清楚。在本研究中，對(duì)5例創(chuàng)傷患者的顳淺動(dòng)脈和3例動(dòng)脈粥樣硬化患者的斑塊進(jìn)行了RNA測(cè)序，以初步確定斑塊中的關(guān)鍵免疫反應(yīng)過(guò)程。采用流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF）技術(shù)來(lái)探索9個(gè)易損斑塊和12個(gè)穩(wěn)定斑塊之間的免疫組成的差異。
二、結(jié)果
1、分析斑塊和正常顳淺動(dòng)脈的RNA-seq數(shù)據(jù)，初步探索斑塊內(nèi)的免疫微環(huán)境
本文通過(guò)對(duì)3例動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊和5例顱腦外傷手術(shù)患者顳淺動(dòng)脈進(jìn)行差異分析，得到16036個(gè)差異基因，其中，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中有3656個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。對(duì)上調(diào)的基因進(jìn)行GO和KEGG注釋，主要富集在T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)以及與TNF信號(hào)通路相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程中，這表明TNF-a在斑塊內(nèi)介導(dǎo)免疫反應(yīng)。隨后，作者通過(guò)xcell推斷RNA-seq數(shù)據(jù)的細(xì)胞類型和比例，結(jié)果顯示，顳淺動(dòng)脈包含大量?jī)?nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和纖維細(xì)胞；動(dòng)脈粥樣硬化斑塊除了這些細(xì)胞外，還包含大量的巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T和B淋巴細(xì)胞。免疫浸潤(rùn)分析的結(jié)果為后續(xù)選擇CyTOF抗體譜提供了指導(dǎo)。（圖1）
2、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中免疫細(xì)胞的組成
根據(jù)影像學(xué)結(jié)果，作者將標(biāo)本分為12個(gè)穩(wěn)定斑塊和9個(gè)易損斑塊。在RNA-seq分析的基礎(chǔ)上篩選出特異性金屬抗體。使用無(wú)監(jiān)督聚類方法Flowsom分析了21例患者動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的細(xì)胞組成（圖2），發(fā)現(xiàn)了15個(gè)簇，且巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞是斑塊的主要組成部分。巨噬細(xì)胞由6個(gè)細(xì)胞簇組成，占63.9%。淋巴細(xì)胞由T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞組成。而T淋巴細(xì)胞有7個(gè)簇，占31.9%。B淋巴細(xì)胞由兩個(gè)簇組成，占4.2%。T-SNE用于轉(zhuǎn)換高維CyTOF數(shù)據(jù)，并用于繪制所有樣本的免疫分區(qū)。（圖3）
3、T細(xì)胞在穩(wěn)定斑塊中占優(yōu)勢(shì)，巨噬細(xì)胞在易損斑塊中占優(yōu)勢(shì)
比較這兩種斑塊的組成，每個(gè)細(xì)胞亞群都分布在兩種類型的斑塊中。T細(xì)胞以穩(wěn)定斑塊為主，占57.2%。巨噬細(xì)胞占39.1%。而巨噬細(xì)胞是易損斑塊中最豐富的細(xì)胞群占56.4%。T細(xì)胞僅占36.7%。這表明了這兩個(gè)斑塊之間的免疫環(huán)境的差異。（圖4C）
4、CD4+T記憶細(xì)胞在穩(wěn)定斑塊中更豐富，而CD11c+CD4c+T細(xì)胞在易損斑塊中分泌更高的IFN-r
斑塊中的T細(xì)胞類型是多種多樣的，有5個(gè)CD4+T淋巴細(xì)胞簇，包括記憶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞。比較兩個(gè)斑塊中細(xì)胞亞群的比例差異，第10簇的CD4+T細(xì)胞是穩(wěn)定斑塊中唯一更豐富的細(xì)胞組。CD45RO+和CD127是記憶細(xì)胞的表面標(biāo)記物，共存于該簇的細(xì)胞表面。兩種斑塊的其他亞群含量無(wú)差異。然而，易損斑塊中的簇2（CD11c+CD4+T細(xì)胞）比穩(wěn)定斑塊中分泌更高水平的IFN-r。（圖4B-I）
5、易損斑塊中的CD19+CD20-B細(xì)胞分泌更多的TNF-a和IL-6，而CD19-CD20+B細(xì)胞表達(dá)更多的PD-1分子
樣本中存在兩種類型的B細(xì)胞，這些B細(xì)胞表面有不同的分子模式。簇9表達(dá)CD19+，而簇8表達(dá)CD20，但不表達(dá)CD19。簇9還表達(dá)了參與細(xì)胞活化和遷移的表面標(biāo)記物HLA_DR和CCR7，這表明該簇可能是一組活化的B亞群細(xì)胞。功能分析顯示，簇8在易損斑塊中表達(dá)了更高水平的PD-1分子。簇9顯示出較高水平的TNF-a和IL-6（圖4E-3和4E-4）。
6、易損斑塊含有更多的CD86+CD68+ M1促炎巨噬細(xì)胞
巨噬細(xì)胞是斑塊中最豐富的簇，包含多個(gè)細(xì)胞亞群（圖4C）。然而，與穩(wěn)定的斑塊相比，第14簇是唯一一個(gè)在易損斑塊中更豐富的簇（圖4B-D）。這些簇表達(dá)CD68和HLA_DR。此外，與M1樣巨噬細(xì)胞對(duì)應(yīng)的CD86存在于簇14的表面。多色免疫熒光檢測(cè)顯示，在易損斑塊中有更多的M1巨噬細(xì)胞（圖5A，B）。功能分析顯示，該簇也表達(dá)了IL-6和IFN-r（促炎細(xì)胞因子），功能分析未顯示出顯著性差異（圖4E-4）。
三、小結(jié)
本文對(duì)5例創(chuàng)傷患者的顳淺動(dòng)脈和3例動(dòng)脈粥樣硬化患者的斑塊進(jìn)行了RNA測(cè)序，分析兩種斑塊的差異基因、使用上調(diào)基因分析兩種斑塊在功能層面的不同、使用xcell比較了兩種斑塊中免疫細(xì)胞比例的差異。并通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析每類細(xì)胞浸潤(rùn)的比例，在易損斑塊中發(fā)現(xiàn)了更多的CD86+CD68+ M1促炎巨噬細(xì)胞，而CD4+T記憶細(xì)胞主要出現(xiàn)在穩(wěn)定斑塊中。此外，在易損斑塊中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)IFN-r分泌的CD4+T細(xì)胞的CD11c+亞群。在B細(xì)胞的兩個(gè)亞群中，易損斑塊中的CD19+CD20-B細(xì)胞分泌更多的TNF-a和IL-6，而CD19-CD20+B細(xì)胞表達(dá)更多的PD-1分子。本文邏輯清晰，作者對(duì)兩種斑塊做了清晰地對(duì)比。
參考文獻(xiàn)：Ge P, Li H, Ya X, Xu Y, Ma L, He Q, Wang R, Liu Z, Zhang Q, Zhang Y, Wang W, Zhang D, Zhao J. Single-cell atlas reveals different immune environments between stable and vulnerable atherosclerotic plaques. Front Immunol. 2023 Jan 18;13:1085468. doi: 10.3389/fimmu.2022.1085468 . PMID: 36741406; PMCID: PMC9889979.
