掃碼聯(lián)系客服
我們先回顧一下以前的高通量測序類的文章，當(dāng)某項測序技術(shù)剛剛興起的時候，單純的生信分析就可以發(fā)比較好的期刊，最大的原因就是技術(shù)和創(chuàng)意新穎。但隨著技術(shù)的發(fā)展，價格的下降，這些文章越來越多。于是審稿人就要求測序類文章要加以基礎(chǔ)實驗驗證。尤其是高分測序文章，甚至用體內(nèi)動物實驗（in vivo）和體外細(xì)胞實驗（in vitro）來升華自己的文章。但是對于單細(xì)胞測序而言，其技術(shù)角度和常規(guī)的測序文章明顯不同。我們會感覺單細(xì)胞測序類文章會有大量生信分析的部分。但是這類文章還是會穿插一些基礎(chǔ)實驗來提升文章的檔次。在小編看過了許多篇關(guān)于單細(xì)胞測序的文章后，為大家總結(jié)出單細(xì)胞測序中的“濕”實驗。下面我就為大家具體介紹下這類實驗~
一、流式技術(shù)
同樣，流式細(xì)胞儀（flow cytometry，F(xiàn)CM）也是作為一種強(qiáng)大的單細(xì)胞分析工具。流式細(xì)胞術(shù)是利用流式細(xì)胞儀對于處在快速直線流動狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒同時進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的高新技術(shù)。其主要的流程如下：
舉個栗子：
在下面的這篇文章中[1]，作者建立了非肥胖糖尿病(NOD)自身免疫小鼠模型，并在4、8、15周取小鼠胰島組織做了單細(xì)胞測序。在這3個時間點，作者發(fā)現(xiàn)胰島內(nèi)浸潤的細(xì)胞主要是T細(xì)胞、B細(xì)胞和cDCs。流式細(xì)胞術(shù)證實了胰島內(nèi)主要細(xì)胞群的存在，并且sc-RNA seq鑒定的浸潤模式涵蓋了了流式細(xì)胞術(shù)的數(shù)據(jù)。
二、免疫熒光技術(shù)
免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。這使得組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
一般的流程如下：
舉個栗子：
在下面的這篇文章[2]中，作者發(fā)現(xiàn)胃粘液分泌細(xì)胞主要主要由表達(dá)MUC5AC的PMCs（pit mucous cell）和表達(dá)MUC6的GMCs（gland mucous cell）組成。利用PCA（主成分分析）發(fā)現(xiàn)這些表達(dá)MUC6的腺細(xì)胞明顯分為兩個亞群。簇1的表達(dá)特征符合正常胃竇腺細(xì)胞的分子特征，但是簇2的表達(dá)特征主要由腸干細(xì)胞或發(fā)育相關(guān)基因組成，包括OLFM4、PHLDA1和LEFTY1。所以作者用免疫熒光(IF)染色證實了MUC6和OLFM4以及LEFTY1是共同表達(dá)的（獲得腸干細(xì)胞表型）。
三、免疫組化
免疫組化，免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry，IHC)，也是是一項利用抗原抗體反應(yīng)，通過使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術(shù)。免疫組化主要用的是組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，組織標(biāo)本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對組織形態(tài)保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復(fù)，所以石蠟切片仍然是首選的標(biāo)本制作方法。
免疫組化流程如下：
舉個栗子：
在下面的這篇文章[3]中，作者通過對EOC（上皮卵巢癌）患者卵巢組織單細(xì)胞測序內(nèi)容的分析確定了腫瘤細(xì)胞內(nèi)兩個亞群的生物標(biāo)志物后（CYR61/RGS5），作者在8個卵巢癌樣本中應(yīng)用了CYR61和RGS5的IHC共染色，以驗證樣品制備和scRNA-seq的生信分析的可靠性。IHC結(jié)果證明，CYR61+腫瘤細(xì)胞和RGS5+CAFs的比例與scRNA-seq結(jié)果是一致的。
大家有沒有覺得很熟悉？免疫組化和免疫熒光有點相似。下面我為大家總結(jié)一下兩者的異同點。方便大家選擇 。
相同點：
兩者都是利用抗原抗體結(jié)合原理在蛋白層面進(jìn)行研究。
不同點：
1、標(biāo)本制作： 免疫熒光一般用冰凍切片，減少雜質(zhì)干擾；而酶免疫組化一般用石蠟切片或冰凍切片均可以。石蠟切片，對組織形態(tài)保存好，保存時間也長，所以石蠟切片仍然是免疫組化首選的標(biāo)本制作方法。
2、實驗步驟：免疫熒光染色步驟簡單，而酶免疫組化方法較為復(fù)雜，多了DAB顯色過程。 3、標(biāo)本保存：免疫熒光染色后的標(biāo)本一般短時間拍照，時間長了熒光衰退；而酶免疫組化染色標(biāo)本可以長期保存。
4、結(jié)果展示：免疫熒光得到的圖片是彩色的，上檔次。免疫組化結(jié)果除了知道蛋白是在細(xì)胞漿還是細(xì)胞膜表達(dá)高些，還可以用軟件做相對定量分析。
四、免疫印跡
Western Blot蛋白免疫印跡是對目的蛋白進(jìn)行檢測、分析以及定量的一種技術(shù)。蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE 分離后從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物（如PVDF膜）上，后用特異性抗體對某一特定的抗原進(jìn)行著色，分析著色的位置或深度獲得該蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況。其可以說是檢測蛋白質(zhì)的金標(biāo)準(zhǔn)（受到審稿人青睞）。下面是WB的一般流程:
舉個栗子：
在下面這篇文章[4]，作者對從健康和NASH（非酒精性脂肪肝）小鼠肝臟分離的非實質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序。通過一系列分析工作，作者為代謝組織中的非實質(zhì)細(xì)胞類型在代謝控制和疾病進(jìn)展中發(fā)揮更普遍的作用。其中如下圖所示，作者就利用WB技術(shù)證明了在喂食CDAHFD（高脂飲食）的小鼠中，服用Elafibror后，肝臟GPNMB蛋白表達(dá)和血漿GPNMB水平也一直降低。
五、RNA-FISH
FISH當(dāng)然不的魚的意思，F(xiàn)ISH是指熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescene in situ hybridization, FISH)的縮寫。FISH是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù)。是利用DNA堿基互補(bǔ)配對的特點，在體外一定的條件下，使同源的DNA鏈或DNA-RNA單鏈結(jié)合成雙鏈，以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法。
下面分享下RNA-FISH心得體會
舉個栗子：
在下面這篇文章[5]中，作者分析了兩個果蠅的睪丸單細(xì)胞RNA序列(scRNA-seq)數(shù)據(jù)。作者發(fā)現(xiàn)有證據(jù)表明，X染色體在體細(xì)胞和減數(shù)分裂前細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性與常染色體相同，而在減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄活性低于常染色體。通過scRNAseq和RNA-FISH，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)msl（male-specific lethal）基因MLE、roX1和roX2的胚系表達(dá)水平很低或檢測不到，沒有胚系核roX1/2定位的證據(jù)。scRNAseq和RNA-FISH的結(jié)果相似互相印證。
六、譜系示蹤技術(shù)
這個技術(shù)相對來講就復(fù)雜了點。首先多細(xì)胞生物的生長發(fā)育基于細(xì)胞分裂和分化。在哺乳動物的胚胎發(fā)育早期階段，每個細(xì)胞就已經(jīng)被賦予了特定的分化潛能( cell totipotency)，這種特性在后期發(fā)育過程中才逐漸表現(xiàn)出來，最終分成為不同的組織、器官類型。另外一方面，某些終末分化的成體細(xì)胞在一定的生理或者病理條件下會發(fā)生去分化( dedifferentiation)或者轉(zhuǎn)分化 ( transdifferentiation)，變?yōu)榱硗庖环N細(xì)胞或組織類型，例如腫瘤的發(fā)生、心臟成纖維細(xì)胞再編程轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞等現(xiàn)象。細(xì)胞的命運(yùn)決定是指單個細(xì)胞及其所有后代細(xì)胞的分化和發(fā)育活動，對細(xì)胞的命運(yùn)決定進(jìn)行追蹤和觀察稱為細(xì)胞譜系示蹤。
以Cre-loxP 同源重組系統(tǒng)為例介紹一下大概流程：
在含有 Cre 的轉(zhuǎn)基因小鼠中，Cre 在特性基因的啟動子驅(qū)動下，在特定的細(xì)胞類群中表達(dá)，當(dāng) Cre 小鼠與含有 loxP 位點的報告基因小鼠交配后，Cre 通過識別 loxP位點，將兩個 loxP 位點之間的終止序列切除，從而使含有 Cre 的細(xì)胞類群表達(dá)出報告基因，由于這種切除是位于基因上的，從而是永久性的和不可逆的，因此，所有表達(dá) Cre 的細(xì)胞類群及其后代都將永久的被報告基因蛋白標(biāo)記上，因此，利用該細(xì)胞追蹤技術(shù)可以解析特定細(xì)胞的起源和命運(yùn)。
舉個栗子：
在下面這篇文章[6]中，作者通過遺傳譜系追蹤和單細(xì)胞RNA測序，發(fā)現(xiàn)Lepr-Cre標(biāo)記了成年鼠長骨中大部分的骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞。瘦素受體(Lepr)陽性細(xì)胞是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，高度富集在骨骼干/祖細(xì)胞，可以維持成人骨骼內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。然而，這個群體中的異質(zhì)性一直難以捉摸。Lepr-Cre示蹤細(xì)胞在穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激條件下的綜合分析揭示了成脂、成骨和骨膜譜系的動態(tài)變化。通過對8周齡Lepr-Cre小鼠股骨遠(yuǎn)端的免疫熒光顯像（骨折前后）。作者發(fā)現(xiàn)雖然在骨折前僅能檢測到少量Lepr-Cre+骨膜細(xì)胞，但骨折和照射后骨膜細(xì)胞明顯擴(kuò)張。
小編總結(jié)：
介紹了那么多實驗，但是具體該選擇哪一種實驗還要結(jié)合實驗內(nèi)容，實驗周期，實驗費用來確定。但是有驗證實驗的話絕對可以提升文章的檔次！好了，今天關(guān)于單細(xì)胞測序中的“濕”實驗方法就列舉到這里，如果你在單細(xì)胞測序文章中還發(fā)現(xiàn)其他的“濕”實驗，可以留言供大家一起學(xué)習(xí)~~
參考文獻(xiàn)
[1] P.N. Zakharov, H. Hu, X. Wan, E.R. Unanue, Single-cell RNA sequencing of murine islets shows high cellular complexity at all stages of autoimmune diabetes, J Exp Med, 217 (2020).
[2] P. Zhang, M. Yang, Y. Zhang, S. Xiao, X. Lai, A. Tan, S. Du, S. Li, Dissecting the Single-Cell Transcriptome Network Underlying Gastric Premalignant Lesions and Early Gastric Cancer, Cell Rep, 27 (2019) 1934-1947 e1935.
[3] T. Kan, S. Zhang, S. Zhou, Y. Zhang, Y. Zhao, Y. Gao, T. Zhang, F. Gao, X. Wang, L. Zhao, M. Yang, Single-cell RNA-seq recognized the initiator of epithelial ovarian cancer recurrence, Oncogene, DOI 10.1038/s41388-021-02139-z(2022).
[4] X. Xiong, H. Kuang, S. Ansari, T. Liu, J. Gong, S. Wang, X.Y. Zhao, Y. Ji, C. Li, L. Guo, L. Zhou, Z. Chen, P. Leon-Mimila, M.T. Chung, K. Kurabayashi, J. Opp, F. Campos-Perez, H. Villamil-Ramirez, S. Canizales-Quinteros, R. Lyons, C.N. Lumeng, B. Zhou, L. Qi, A. Huertas-Vazquez, A.J. Lusis, X.Z.S. Xu, S. Li, Y. Yu, J.Z. Li, J.D. Lin, Landscape of Intercellular Crosstalk in Healthy and NASH Liver Revealed by Single-Cell Secretome Gene Analysis, Mol Cell, 75 (2019) 644-660 e645.
[5] E. Witt, Z. Shao, C. Hu, H.M. Krause, L. Zhao, Single-cell RNA-sequencing reveals pre-meiotic X-chromosome dosage compensation in Drosophila testis, PLoS Genet, 17 (2021) e1009728.
[6] C. Mo, J. Guo, J. Qin, X. Zhang, Y. Sun, H. Wei, D. Cao, Y. Zhang, C. Zhao, Y. Xiong, Y. Zhang, Y. Sun, L. Shen, R. Yue, Single-cell transcriptomics of LepR-positive skeletal cells reveals heterogeneous stress-dependent stem and progenitor pools, EMBO J, DOI 10.15252/embj.2021108415(2021) e108415.
