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Systematic discovery of mutation-directed neo-protein-protein interactions in cancer
系統(tǒng)性地發(fā)現(xiàn)與驗證癌癥中突變導(dǎo)致的新蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用
一．研究背景
基因組突變數(shù)據(jù)可提供潛在的癌癥驅(qū)動基因和治療靶點。然而，即使在同一癌癥基因中，不同的驅(qū)動突變也可能在功能上不同，具有不同的臨床意義。因此，將這種癌癥突變信息轉(zhuǎn)化到突變氨基酸水平，對于識別突變等位基因特異性靶點、生物標(biāo)記物等來說至關(guān)重要。在編碼可作用靶點的驅(qū)動基因中發(fā)現(xiàn)了一些突變，但大多數(shù)突變位于與已知藥物無直接聯(lián)系的基因中，或位于編碼“不可抗”的基因中，如銜接蛋白或腫瘤抑制因子。這些蛋白質(zhì)主要通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)與其他細(xì)胞成分的相互作用發(fā)揮其功能。因此，了解癌癥驅(qū)動突變?nèi)绾瓮ㄟ^改變的PPI整合到細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)中，可能會導(dǎo)致潛在的通路干擾策略治療癌癥（圖1A）。錯義突變是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的常見基因組變異。突變（MUT）等位基因可能在編碼的蛋白質(zhì)上產(chǎn)生新的表位（圖1A）。這種突變可能改變編碼蛋白質(zhì)的內(nèi)在特性。這些新表位也可能產(chǎn)生對接位點以誘導(dǎo)新相互作用，或阻礙削弱現(xiàn)有的相互作用。這種新表位觸發(fā)的差異性PPI（Df-PPI）可能指示重新連接的致癌程序，這些程序是腫瘤細(xì)胞生長和擴(kuò)散失調(diào)的基礎(chǔ)，并可能揭示治療干預(yù)急需的腫瘤特異性分子靶點。然而，由癌基因和抑癌基因突變引發(fā)的新相互作用的范圍仍有待確定。
二．研究方法
在這里，該研究建立了一個基于NanoLuc熒光素酶的生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRETn）差異PPI識別平臺，該平臺可比較篩選野生型（WT）和突變體（MUT）等位基因?qū)?yīng)物，以檢測活哺乳動物細(xì)胞中與癌癥相關(guān)蛋白的差異相互作用（圖1B）。該技術(shù)為定量高通量差異篩選（qHT-dS），能夠從17792對潛在PPI的檢查中系統(tǒng)地鑒定32個等位基因的差異WT和MUT相互作用蛋白。對Df-PPI數(shù)據(jù)集的分析顯示，癌基因和腫瘤抑制基因的錯義突變引起的相互作用廣泛增加。對突變導(dǎo)向的新形態(tài)PPI（neo-PPI）的檢測揭示了癌基因和抑癌基因突變形式的潛在替代機(jī)制和信號通路。選擇BRAFV600E /KEAP1相互作用進(jìn)行驗證，使用一組正交分析將其提升至經(jīng)驗證的neo-PPI狀態(tài)。該neo-PPI重定向BRAFV600E上調(diào)NRF2介導(dǎo)的氧化還原信號。qHT-dS平臺能夠在單個突變殘基分辨率下加速發(fā)現(xiàn)Df-PPIs，所得數(shù)據(jù)集可作為生物醫(yī)學(xué)界精確腫瘤學(xué)方法的資源。
三．研究結(jié)果
1、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)文庫用于PPI篩查
為了確定由基因組改變編碼的復(fù)發(fā)突變殘基產(chǎn)生的新蛋白，該研究試圖建立突變殘基和具有明確的癌癥相關(guān)蛋白的連接，用于重點對比檢查。為此，構(gòu)建了一個癌癥相關(guān)基因表達(dá)文庫，為OncoPPi v2文庫（圖1C），由556個不同的人類WT蛋白編碼ORF組成，以搜索驅(qū)動突變的相互作用伴侶。為了選擇人類癌癥突變等位基因以發(fā)現(xiàn)Df-PPI，建立了一組致癌突變表達(dá)載體，為OncoMut文庫。對于驅(qū)動突變的比較研究，首先關(guān)注兩個定義明確的癌基因和四個頻繁突變的腫瘤抑制基因中的復(fù)發(fā)性突變，這些基因具有來自不同腫瘤譜系的24個等位基因（圖1D）。OncoMut文庫包含癌基因AKT1和BRAF的突變；腫瘤抑制因子SPOP、F-box和FBXW7和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子SMAD4和SMARCA4。
2. qHT-dS平臺用于比較分析WT和MUT PPI
為了識別活細(xì)胞中的Df-PPIs，建立了一個差異篩選平臺qHT-dS（圖1B）。通過使用1536孔板格式的基于BRETn的超高通量PPI篩選技術(shù)實現(xiàn)。為了確保對qHT-dS數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格的統(tǒng)計評估，開發(fā)了對相互作用進(jìn)行比較分析的（CARINA）算法，以量化相互作用信號的強(qiáng)度（圖2A）。將fold-over-control（FOC）數(shù)據(jù)與BRET飽和曲線的曲線下面積（AUC）值（PFOC）的p值分析相結(jié)合，進(jìn)行對比研究，以確定WT和MUT的PPI（圖2B-2D）。通過CARINA分析，共為每個PPI及其相應(yīng)的對照組建立了55600條BRET飽和曲線。與單點蛋白質(zhì)表達(dá)二元PPI映射不同，qHT-dS包含蛋白質(zhì)表達(dá)的變化。當(dāng)FOC≥1.2，PFOC≤0.01時，CARINA識別出50%以上的已知WT PPI，而低于1.2的FOC下限僅會略微增加篩查中檢測到的已知PPI數(shù)量（圖2C）。因此，F(xiàn)OC ≥1.2和PFOC≤0.01被用作定義統(tǒng)計顯著性PPI的主要閾值。利用這些參數(shù)，共識別出8839個PPI（圖2D）。這些PPI可作為進(jìn)一步評估的候選相互作用，以確定不同的PPI。
3.確定不同PPI的優(yōu)先級
為了鑒定突變驅(qū)動的Df-PPI，根據(jù)WT和MUT-PPI圖譜的FOC值進(jìn)行了比較分析。為了區(qū)分相互作用的獲得（Go-PPI）和相互作用的喪失（Lo-PPI），計算WT和MUT-PPI曲線之間的差異以獲得差異分?jǐn)?shù)（DS）以及相應(yīng)的p值（PDS）（圖3A）。根據(jù)DS和PDS，確定了864個差異Go-PPI（DS>1，PDS<0.001）和172個差異Lo-PPI（DS<1，PDS<0.001）。應(yīng)用QDS<0.01和DS ≥1.5或DS≤1.5為高嚴(yán)格（HS）閾值，表明WT和MUT PPI信號之間至少有50%的差異，HS-Go-PPI和HS-Lo-PPI組分別有359和13 個PPI（圖3A和3B）。這372個高嚴(yán)格差異PPI用于評估等位基因依賴性相互作用的特異性和性質(zhì)。通過對HS-Go-PPI圖譜的分析，不同的基因產(chǎn)物，甚至同一基因的不同等位基因，在相互作用伴侶中表現(xiàn)出顯著的差異（圖3C）。例如，在SPOP和FBXW7中，發(fā)現(xiàn)不到10%的重疊Go-PPI伴侶發(fā)生突變。G386D與D351H SMAD4等位基因和F102C與F133V SPOP等位基因的共享伴侶比例分別為13%和30%，表現(xiàn)出突變特異性相互作用。令人驚訝的是，同一位點的突變以殘基依賴的方式顯示出不同的相互作用。例如，62%的SPOP F133L伴侶與F133V伴侶不同。由于與熱休克蛋白90（HSP90）的一般伴侶功能相關(guān)，這種突變等位基因特異性相互作用不太可能發(fā)生，盡管許多疾病突變體顯示與HSP90的相互作用增加。事實上，僅識別到HS-Go-PPI和HSP90已知PPI伴侶之間的小部分重疊（1.4±0.9%）（圖3C）。這些結(jié)果凸顯了突變等位基因介導(dǎo)的Go-PPIs的特異性以及在蛋白質(zhì)連接性水平上潛在的等位基因依賴性腫瘤異質(zhì)性。為了深入了解等位基因驅(qū)動的致癌程序，對每個伴侶的等位基因選擇性進(jìn)行了檢查（圖3D）?？偟膩碚f，35%的HS-Go-PPI伴侶與3個或更多的等位基因相互作用，通過不同的突變涉及共同的致癌通路。這些HS-Go-PPI伴侶在核心生長調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮作用（圖3E）。實驗結(jié)果也顯示，多種突變殘基參與了常見通路，如細(xì)胞周期、PI3K/AKT/mTOR和JAK/STAT通路，為致癌基因的表達(dá)提供了機(jī)制基礎(chǔ)功能的這些驅(qū)動突變（圖3F）。此外，大多數(shù)HS-Go-PPI伴侶（65%）與一個或兩個等位基因相互作用，表明這些伴侶和相應(yīng)的通路可能在含有某些突變的癌癥中發(fā)生特異性改變（圖3D）。
4. neo-PPI候選相互作用的實驗驗證
為了收集進(jìn)一步的實驗證據(jù)以驗證突變介導(dǎo)的差異PPIs，對HS-Df-PPI數(shù)據(jù)集進(jìn)行了采樣，以便在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行同源性BRET和GST pulldown的實驗驗證。總的來說，325個PPIs中有265個顯示出差異結(jié)合信號，代表了82%的HS-Df PPIs（圖4）。對BRAFV600E介導(dǎo)的neo-PPIs候選相互作用（圖4A）在黑色素瘤、肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中進(jìn)行了檢測，其中BRAFV600E定義了一個患者亞群，并進(jìn)行了三次補(bǔ)充性分析。（i）NanoPCA分析用于確認(rèn)癌細(xì)胞中接近內(nèi)源性表達(dá)水平的BRAFV600E neo-PPIs，表明在A375黑色素瘤細(xì)胞和H1299肺癌細(xì)胞中分別與BRAFV600E有44和38個結(jié)合的相互作用（圖4A和4C）。（ii）標(biāo)記BRAFV600E的標(biāo)記物用于檢查其與內(nèi)源性結(jié)合伴侶的相互作用。在肺癌細(xì)胞的flag-BRAFV600E免疫復(fù)合物中檢測到15個內(nèi)源性伴侶（圖4D）。在結(jié)腸癌細(xì)胞系中進(jìn)行內(nèi)源性flag-V600E co-IP研究進(jìn)一步證實了五種neo-PPIs（圖4Ei）。（iii）利用co-IP質(zhì)量抗體證明內(nèi)源性BRAFV600E與VHL、BCL2L1和KEAP1在患者來源的含有BRAFV600E的癌細(xì)胞形成復(fù)合物（圖4Eii）。同樣，在MCF7乳腺癌細(xì)胞中檢測AKT1E17K neo-PPI，在HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞中檢測SMAD4G386D PPI，并在C4-2前列腺癌細(xì)胞中評估SPOPF133L伴侶與內(nèi)源性伴侶的相互作用（圖4F-4H）。
5. neo-PPI候選相互作用闡述腫瘤抑制基因和癌基因突變的假說
該研究檢查了已確定的腫瘤抑制蛋白和癌基因蛋白的PPI核心元素。通常認(rèn)為，腫瘤抑制基因通過功能缺失突變導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，從而損害其腫瘤抑制功能。出乎意料的是，Df-PPI數(shù)據(jù)顯示，腫瘤抑制基因突變同時表現(xiàn)出Lo-PPIs和Go-PPIs以及一組不同的癌癥相關(guān)蛋白，這意味著腫瘤抑制基因可能通過neo-PPI獲得新形態(tài)活性。例如，SMAD4G386D與GSK3β的相互作用增強(qiáng)可能使SMAD4G386D獲得影響GSK3β調(diào)節(jié)的Wnt/b-catenin途徑的能力。SPOPF133L是一種在前列腺癌中頻繁突變的腫瘤抑制因子，它不僅失去了與已知WT結(jié)合伴侶的相互作用，如BRD4和NCOA3（SRC-3），而且增強(qiáng)了與其他伴侶的相互作用，如c-JUN（圖4H）。SPOPF133L /c-JUN neo-PPI支持以下假設(shè)，即SPOP突變可能參與c-JUN通路以驅(qū)動AP-1介導(dǎo)的致癌程序。qHT-dS數(shù)據(jù)還表明，致癌激酶的驅(qū)動突變，如AKT1E17K和BRAFV600E，能夠與多個結(jié)合伴侶相互作用，這可能會重新連接致癌途徑，并提出替代途徑干擾方法（圖4）。例如，該研究的篩查揭示了AKT1E17K的51個等位基因選擇性結(jié)合伴侶（圖4F）。AKT1E17K介導(dǎo)的相互作用得到了其他數(shù)據(jù)集的支持，包括與乳腺癌細(xì)胞中內(nèi)源性伴侶的結(jié)合、共同的亞細(xì)胞定位以及一部分伴侶的已定義AKT1磷酸化基序的存在（圖4F）。在已鑒定的Go-PPI中，E17K突變似乎增強(qiáng)了AKT1與DNA損傷反應(yīng)（DDR）蛋白質(zhì)的相互作用，如ATM和FANCC/E（圖4F），這增加了AKT1E17K可能改變細(xì)胞對DNA損傷和修復(fù)的反應(yīng)的可能性。AKT1E17K狀態(tài)與增強(qiáng)的細(xì)胞對DNA損傷信號的抵抗力呈正相關(guān)，支持未來對AKT1E17K可能通過NOOPI和ATM調(diào)節(jié)DDR的假設(shè)的檢驗。類似地，熱點突變V600E使BRAF能夠與RAS /MEK信號級聯(lián)之外的蛋白質(zhì)伴侶相互作用。與WT對應(yīng)物相比，確認(rèn)了BRAFV600E的NRAS和14-3-3β的常見PPI以及MEK1的Lo-PI（圖4A和4B）。、還確定了47個V600E增強(qiáng)的PPI候選相互作用，顯著擴(kuò)展了BRAFV600E突變等位基因介導(dǎo)的致癌通路（圖4A-E）。
6. BRAFV600E與KEAP1的neo-PPI的驗證
基于以上研究，假設(shè)突變的BRAFV600E產(chǎn)生了一個新表位，與KEAP1的親和力增強(qiáng)，這可能通過調(diào)節(jié)NRF2介導(dǎo)的通路影響ROS反應(yīng)。為了驗證這一假設(shè)，通過一組互補(bǔ)的生化和細(xì)胞實驗進(jìn)一步評估了這一neo-PPI。與qHT-dS結(jié)果一致（圖5A），在GST pulldown實驗中，BRAFV600E顯示出明顯高于WT和其他BRAF突變體與KEAP1的相互作用信號（圖4）。通過Venus-PCA分析（圖5B），在顯示細(xì)胞質(zhì)定位的活細(xì)胞中，以及在內(nèi)源性細(xì)胞條件下，通過對一對等基因細(xì)胞系（圖5C）和一組患者來源的BRAFV600E黑色素瘤細(xì)胞系（圖4E）的co-IP研究，證明了這種neo-PPI，支持其在生理條件下的存在。研究表明BRAFV600E的激酶結(jié)構(gòu)域和KEAP1的KELCH結(jié)構(gòu)域?qū)е铝怂鼈兊年P(guān)聯(lián)（圖5D）。通過BLI分析純化的蛋白質(zhì)，BRAFV600E的激酶結(jié)構(gòu)域（而非WT的激酶結(jié)構(gòu)域）顯示出與KEAP1 KELCH結(jié)構(gòu)域的直接結(jié)合BLI信號（圖5E）。用vemurafenib治療BRAFV600E攜帶細(xì)胞以劑量依賴性方式減弱BRAFV600E與KEAP1的相互作用（圖5F）?？傊?，這些數(shù)據(jù)有力地支持了BRAFV600E /KEAP1這一neo-PPI。
7. BRAFV600E /KEAP1 neo-PPI導(dǎo)向NRF2信號
事實上，BRAFV600E（而非WT）的過度表達(dá)顯著穩(wěn)定了NRF2蛋白（圖6A和6B），增加了其轉(zhuǎn)錄ARE報告活性（圖6C），增加了NRF2及其靶基因NQO1的蛋白水平（圖6D），但沒有增加NRF2 mRNA水平（圖6E）。與WT細(xì)胞系相比，BRAFV600E黑色素瘤細(xì)胞系中的NRF2蛋白及其下游NQO1蛋白水平（圖6G和6H）顯著升高。這些數(shù)據(jù)得到CCLE數(shù)據(jù)集的支持，顯示上調(diào)的NQO1 mRNA水平與BRAF的V600E狀態(tài)呈正相關(guān)（圖6I）。此外，用vemurafenib治療BRAFV600E黑色素瘤細(xì)胞可降低KEAP1結(jié)合，導(dǎo)致NRF2和NQO1蛋白水平下調(diào)（圖5F和6J）。MEK1抑制劑對KEAP1/NRF2活性沒有影響（圖6K）。BRAFV600E表達(dá)增加與KEAP1復(fù)合物中NRF2數(shù)量減少相關(guān)，表明BRAFV600E取代了KEAP1復(fù)合物中的NRF2（圖6L）。這些結(jié)果表明了BRAFV600E誘導(dǎo)的KEAP1隔離模型，其中BRAFV600E通過與KEAP1的競爭結(jié)合激活NRF2，此外還有先前報道的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制。為支持該模型，KEAP1的沉默使NRF2蛋白水平對BRAFV600E狀態(tài)無反應(yīng)（圖6F）。進(jìn)一步分析了CRISPR-Cas9數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)BRAFV600E突變使癌細(xì)胞依賴KEAP1生存，對KEAP1敲除的敏感性增加（圖6M）。因此，BRAFV600E細(xì)胞可能遺傳對KEAP1控制通路的內(nèi)在敏感性。
8. 化合物篩選證實了BRAF V600E突變所帶來的互作上的缺陷
為了尋找利用BRAFV600E相關(guān)脆弱性的潛在治療劑，利用一對帶有V600E突變或無突變的BRAF的基因工程MCF10A細(xì)胞系進(jìn)行化學(xué)篩選。利用生物活性化合物文庫進(jìn)行平行細(xì)胞活性篩選，發(fā)現(xiàn)一類醌類化合物對V600E細(xì)胞具有選擇性生長抑制作用（圖6N）。這一結(jié)果證實了路徑分析的觀察結(jié)果，該分析將BRAFV600E /KEAP1相互作用與NQO1的增強(qiáng)激活聯(lián)系起來。因此，V600E突變的獲得有可能導(dǎo)致NQO1功能的提高，從而提高對有毒NQO1底物的敏感性。為了驗證這一論點，利用脫氧喹啉酮（DNQ）（圖6O），一種有效且特異的NQO1底物，來檢測其對BRAFV600E細(xì)胞存活的影響。當(dāng)用DNQ處理時，BRAFV600E攜帶細(xì)胞對DNQ的敏感性高于WT細(xì)胞（圖6P）。觀察到的差異反應(yīng)曲線顯示，使用BRAFV600E的WM3482細(xì)胞系比使用BRAF WT和DNQ處理的CHL細(xì)胞系的敏感性顯著增強(qiáng)（圖6Q）。因此，黑色素瘤癌細(xì)胞中的BRAFV600E可能觸發(fā)對NRF2-NQO1調(diào)節(jié)的細(xì)胞毒性醌衍生物的敏感性增強(qiáng)。鑒于BRAFV600E /KEAP1 neo-PPI可由BRAFV600E抑制劑vemurafenib調(diào)節(jié)（圖5F和6J），確定vemurafenib是否能與DNQ協(xié)同抑制V600E癌細(xì)胞的生長。使用BRAFV600E突變的WM3482細(xì)胞系作為模型，與單獨使用DNQ治療相比，使用維莫拉非尼后再使用DNQ治療顯示DNQ的效力略有下降，表明vemurafenib對DNQ有負(fù)面影響（圖6R）。然而，當(dāng)我們用DNQ預(yù)處理細(xì)胞，然后用vemurafenib逆轉(zhuǎn)治療順序時，觀察到DNQ的效力顯著增加（圖6R）。在BRAFV600E突變的多個黑色素瘤細(xì)胞系中也觀察到了這種有效的順序組合效應(yīng)（圖6S）。因此，BRAFV600E與KEAP1的neo-PPI不僅重新連接了NRF2調(diào)節(jié)的氧化還原通路，而且還產(chǎn)生了對細(xì)胞毒性NQO1底物敏感性增強(qiáng)的細(xì)胞狀態(tài)。未發(fā)現(xiàn)的BRAFV600E變異體定向組合策略支持對已證實的neo-PPI的未來探索，以用于機(jī)制研究和neo-PPI治療策略（圖6T）。
四、總結(jié)
總之，該研究結(jié)果支持通過突變等位基因激活的PPI重組突變驅(qū)動的致癌途徑的概念。經(jīng)實驗驗證的neo-PPI提供了產(chǎn)生可測試假設(shè)的基礎(chǔ)，以進(jìn)一步檢驗其功能意義。這種突變決定的PPI不僅可以增強(qiáng)我們對癌癥分子重編程的理解，而且還可以揭示針對腫瘤變體介導(dǎo)的治療干預(yù)機(jī)制的潛在方法，這可能適用于癌基因和腫瘤抑制基因的基因組改變。從該研究的定量篩選平臺、生物信息學(xué)和實驗注釋以及驗證性研究中獲得的Df-PPI數(shù)據(jù)集和neo-PPI數(shù)據(jù)集，為科學(xué)界提供了一個有價值的資源，用于變異介導(dǎo)的分子相互作用研究，以加速精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法。
