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今天給大家分享一篇2023年1月31日發(fā)表在Nature Communications （IF:17.694）上，單細(xì)胞分析揭示與肺癌分子亞型相關(guān)的成纖維細(xì)胞亞群的文章。
Single-cell analysis reveals prognostic fibroblast subpopulations linked to molecular and immunological subtypes of lung cancer
一．研究背景以及研究方法
在這里，研究者使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）、多重免疫組化以及CIBERSORTx來鑒定了非小細(xì)胞肺癌中的三個(gè)成纖維細(xì)胞亞群:外膜成纖維細(xì)胞、肺泡成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。肺泡和外膜成纖維細(xì)胞富集于正常組織，并且二者在肺腺癌（LUAD）中富集時(shí)，可改善LUAD患者總生存率。偽時(shí)間分析確定了成纖維細(xì)胞激活的三個(gè)階段:炎癥細(xì)胞因子的初始上調(diào)，應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)，以及纖維膠原蛋白表達(dá)的增加。肌成纖維細(xì)胞與LUAD總生存率低相關(guān)，與上皮分化喪失、TP53突變、近端分子亞型和髓系細(xì)胞招募相關(guān)。
二．研究結(jié)果
1、從scRNA-seq數(shù)據(jù)鑒定成纖維細(xì)胞
研究者共收集6例癌旁、7例肺鱗癌（LUSC）和5例肺腺癌（LUAD）樣本進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（圖1a，1b）。從中識(shí)別到間充質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞群（圖1c）。間充質(zhì)細(xì)胞包括兩個(gè)獨(dú)立的細(xì)胞群:內(nèi)皮細(xì)胞（VWF+）和基質(zhì)細(xì)胞（DCN+和DPT+）（圖1c）。
為了區(qū)分肌成纖維細(xì)胞與壁細(xì)胞，作者鑒定了人類肺組織中成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞之間差異表達(dá)的基因（HLCA;圖1 e）。作者在HLCA數(shù)據(jù)集中計(jì)算了它們的平均每細(xì)胞表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)這些特征可以準(zhǔn)確地識(shí)別兩類細(xì)胞（圖1f, g）。然后他們在自產(chǎn)的數(shù)據(jù)集中檢查了這些特征的表達(dá)量（圖1h-j），證明在基質(zhì)細(xì)胞簇中檢測到了壁細(xì)胞（n=69）和成纖維細(xì)胞（n=885）。
2. NSCLC中存在三種成纖維細(xì)胞亞群
作者在6個(gè)已發(fā)表的NSCLC的scRNA-seq數(shù)據(jù)集再次進(jìn)行了成纖維細(xì)胞鑒定，并且也識(shí)別到三個(gè)成纖維細(xì)胞亞群（外膜成纖維細(xì)胞、肺泡成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞）（圖2a， 2b）。
隨后對三個(gè)亞群進(jìn)行差異基因與通路分析，鑒定出肌成纖維細(xì)胞上調(diào)的622個(gè)基因，其中188個(gè)基因在樣本水平分析中仍然保持顯著性。肌成纖維細(xì)胞亞群的標(biāo)志物包括MMP11、POSTN、CTHRC1、COL1A1、ACTA2和COL3A1（圖2c）。GSVA通路分析顯示，這些細(xì)胞顯著上調(diào)了參與產(chǎn)生膠原ECM相關(guān)的通路（圖2d）。外膜成纖維細(xì)胞中有481個(gè)基因上調(diào)，其中73個(gè)基因在分析樣本差異表達(dá)時(shí)仍然顯著，包括PI16、IGFBP6、MFAP5、APOD、PLA2G2A和GSN。GSVA通路分析發(fā)現(xiàn)涉及PTGIS的多種通路上調(diào)，包括前列腺素和膽汁酸/鹽的合成（圖2d），以及補(bǔ)體激活通路也顯著上調(diào) （圖2d）。對于肺泡成纖維細(xì)胞，差異表達(dá)分析鑒定出672個(gè)上調(diào)基因，其中78個(gè)在樣本水平分析中仍保持顯著性，包括MACF1、RGCC、INMT、LIMCH1、A2M和GPC3。GSVA通路分析鑒定出TRP通路上調(diào)（圖2d）。
作者發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞上調(diào)了基質(zhì)小體相關(guān)的多個(gè)基因，大多數(shù)是間質(zhì)膠原蛋白（圖2e）;肺泡成纖維細(xì)胞上調(diào)與基底膜和ECM糖蛋白相關(guān)的多個(gè)基因的表達(dá);外膜性成纖維細(xì)胞上調(diào)多種ECM糖蛋白和蛋白聚糖（圖2e）。隨后他們計(jì)算了每個(gè)基質(zhì)小體的模塊得分，發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞顯著上調(diào)間質(zhì)膠原（圖2f）;而肺泡和肌成纖維細(xì)胞均表現(xiàn)出明顯增加的基底膜基因表達(dá)（圖2g）。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)腫瘤樣本中的這三個(gè)亞群相較于正常對照樣本，間質(zhì)膠原蛋白表達(dá)顯著增加（圖2h）。并且，無論是哪種亞型，肌成纖維細(xì)胞Signature在腫瘤樣本中顯著上調(diào)（圖2i）。與癌旁組織相比，從腫瘤樣本中分離的成纖維細(xì)胞中的iCAF Signature顯著下調(diào)（圖2j）。
3. 不同亞型的空間分布和豐度
作者應(yīng)用多重免疫組化（mxIHC）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證（圖3a）。mxIHC結(jié)果顯示肺泡和外膜成纖維細(xì)胞在正常肺組織存在（圖3b）。而在肺間質(zhì)組織中也觀察到AOC3 +肺泡成纖維細(xì)胞（圖3b），在支氣管周圍區(qū)域也觀察到CD34+外膜成纖維細(xì)胞（圖3b）。然后也在NSCLC的切片中證實(shí)了三個(gè)亞群的存在（圖3c, d）。
作者還觀察了正常、LUAD和LUSC組織樣本中每個(gè)亞群體的相對豐度。與LUAD和LUSC相比，對照組織樣本中的外膜成纖維細(xì)胞明顯更豐富（圖3e）。肺泡成纖維細(xì)胞同樣在對照組組織中最多，但在一些LUAD樣本中也具有一定高豐度，而在LUSC中很少出現(xiàn)（圖3e）。相比之下，LUAD和LUSC的肌成纖維細(xì)胞豐度比對照組織顯著增加，但LUSC的肌成纖維細(xì)胞豐度也明顯高于LUAD（圖3e）。用CIBERSORTx分析TCGA RNA-seq數(shù)據(jù)證實(shí)了成纖維細(xì)胞亞群和組織類型之間的這些關(guān)聯(lián)（圖3g）。然后用mxIHC進(jìn)一步驗(yàn)證（圖3f）。
4.肌成纖維細(xì)胞的偽時(shí)間軌跡分析
作者進(jìn)行了軌跡推斷分析，發(fā)現(xiàn)外膜成纖維細(xì)胞和肺泡成纖維細(xì)胞可以作為肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的獨(dú)立起始祖細(xì)胞（圖4a, b，c）。這個(gè)分化軌跡上確定了四個(gè)基因模塊:祖細(xì)胞、早期激活、未完全分化和分化（圖4d, e）。
相比之下，未完全分化和分化模塊在偽時(shí)間內(nèi)的表達(dá)趨勢在對照樣本和NSCLC樣本之間存在差異性，轉(zhuǎn)分化的中間階段在腫瘤樣本顯著增加（圖4f， 4g）（圖4f）。隨后使用REACTOME通路進(jìn)行了富集分析（圖4h），表明富含許多編碼核糖體蛋白的基因（圖4h），這是肌成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)特征，可能表明這些細(xì)胞具有增強(qiáng)的蛋白質(zhì)翻譯能力。參與HSF1轉(zhuǎn)激活的熱休克家族基因（如HSPA1A、DNAJB1和HSP90AB1）在該模塊中顯著富集（圖4h）。此外，在這個(gè)模塊中也發(fā)現(xiàn)了氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因（如HIF1A、GGT和SERPINE1）高表達(dá)。
作者使用mxIHC檢測了HSPA1A/HSP70的表達(dá)。當(dāng)將腫瘤內(nèi)的細(xì)胞與腫瘤鄰近對照區(qū)域的細(xì)胞進(jìn)行比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)成纖維細(xì)胞亞群的顯著增加（圖4i），證實(shí)來自NSCLC腫瘤的刺激比來自對照組織的刺激更能誘導(dǎo)熱休克反應(yīng)。在轉(zhuǎn)分化的所有階段，與對照組相比，腫瘤組織中的分化模塊顯著增加（圖4g）。該模塊富含參與膠原形成和ECM組織的基因（圖4h），與肌成纖維細(xì)胞表型一致，上述數(shù)據(jù)表明，與對照組織樣本相比，腫瘤樣本中的纖維膠原蛋白上調(diào)。
5. 成纖維細(xì)胞表型的跨組織分析
研究者在PDAC、HNSCC和CRC數(shù)據(jù)集中，檢驗(yàn)這些成纖維細(xì)胞表型在癌癥類型中是否保守（圖5a）。然后使用概率機(jī)器學(xué)習(xí)模型將這些細(xì)胞分類為NSCLC中確定的三個(gè)亞群（圖5b, c）。這表明，在所有分析的癌癥類型中，外膜和肌成纖維細(xì)胞群具有很強(qiáng)的保守性; 而肺泡成纖維細(xì)胞在肺癌中更特異。
然后，通過多重免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在每種癌癥類型中，外膜成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞是主要的亞群（圖5d）。此外，正如在NSCLC中發(fā)現(xiàn)的，與所有三種腫瘤類型的腫瘤組織相比，對照組的外膜纖維細(xì)胞明顯更富集（圖5e），腫瘤組織中的肌成纖維細(xì)胞更富集（圖5f）。
6.多個(gè)NSCLC隊(duì)列的生存分析
作者利用CIBERSORTx對多個(gè)NSCLC隊(duì)列細(xì)胞比例的反卷積分析。每個(gè)成纖維細(xì)胞亞群的相對豐度被用于Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。發(fā)現(xiàn)具有高肌成纖維細(xì)胞特征的患者伴有不良預(yù)后 （圖6a-c）。并且，在三個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列中也得到了一致的結(jié)果 （圖6 d）。多因素cox回歸分析也顯示，該特征與疾病分期和患者年齡無關(guān)（圖6i）。并且，作者采用相同的方法分析，發(fā)現(xiàn)具有高肺泡成纖維細(xì)胞豐度的患者伴有較好預(yù)后（圖6e-g）。同樣，也在三個(gè)獨(dú)立驗(yàn)證集中得到了驗(yàn)證（圖6 h），該特征也與疾病分期和患者年齡無關(guān)（圖6j）。
7. 研究與LUAD主要預(yù)后特征的相關(guān)性
根據(jù)CIBERSORTx分析結(jié)果，不同形態(tài)亞型的LUAD成纖維細(xì)胞亞群豐度差異顯著（圖7b），同時(shí)scRNAseq （圖7c）和mxIHC （圖7a, d）的結(jié)果都顯示與中度/高分化（G1/G2）相比，低分化（G3）亞型腫瘤樣本中的肌成纖維細(xì)胞增加。
作者在bulk RNA-seq數(shù)據(jù)集中證實(shí)了這一點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)77%的TRU腫瘤為中度/高分化（G1/G2）， 69%的PP腫瘤為低分化（G3）。正如預(yù)期的那樣，肌成纖維細(xì)胞豐度在近端增殖[PP]腫瘤中最高;而肺泡和外膜成纖維細(xì)胞在終末呼吸單位[TRU]腫瘤中最為突出（圖7f）。此外，他們還發(fā)現(xiàn)帶有TP53突變的LUAD腫瘤中肌成纖維細(xì)胞豐度增加（圖7e）。
作者還使用CIBERSORTx檢測了免疫細(xì)胞亞群（LM22）的豐度及其與成纖維細(xì)胞亞群的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)肺泡成纖維細(xì)胞與多種靜息免疫細(xì)胞亞群相關(guān)（例如肥大細(xì)胞、CD4 +記憶T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞），此外還有單核細(xì)胞和B細(xì)胞（包括記憶和na?ve 亞群）。相反，肌成纖維細(xì)胞與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞和活化的CD4 +記憶T細(xì)胞相關(guān)（圖7g）。
四、總結(jié)
總之，這項(xiàng)對成纖維細(xì)胞異質(zhì)性的綜合分析表明，肺泡成纖維細(xì)胞是肺異性的，而外膜成纖維細(xì)胞與肌成纖維細(xì)胞則始終存在于不同的組織、癌癥和病理中。此外，肌成纖維細(xì)胞和肺泡成纖維細(xì)胞與LUAD的不同分子和免疫亞型相關(guān)，并且這些特征可以準(zhǔn)確地識(shí)別LUAD高風(fēng)險(xiǎn)患者。這些發(fā)現(xiàn)可以改善患者分層，并給予完善肺癌成纖維細(xì)胞靶向治療的提供了新策略。
