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現(xiàn)在我們已經(jīng)進(jìn)入單細(xì)胞數(shù)據(jù)的時(shí)代了，而大家最關(guān)心的應(yīng)該是和自己科室相關(guān)的話題了。不同臨床科室面對(duì)的科學(xué)問題千差萬別。毫無疑問，在各個(gè)科室要開展單細(xì)胞課題，需要結(jié)合文獻(xiàn)案例來付出更多的時(shí)間來參悟， 在這里我以人體八大系統(tǒng)為基礎(chǔ)并結(jié)合案例來看一看單細(xì)胞課題在各類科室如何展開~
目錄（上）
一、單細(xì)胞優(yōu)勢(shì)及開展流程
二、心血管科
三、呼吸科
四、運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)科
五、神經(jīng)科
一、單細(xì)胞優(yōu)勢(shì)及開展流程
使用傳統(tǒng)的基因表達(dá)分析技術(shù)，如定量PCR、微陣列、RNA測(cè)序，但是這些測(cè)量很有可能產(chǎn)生誤差，尤其是在具有高度異質(zhì)性的不同細(xì)胞類型。當(dāng)然在對(duì)細(xì)胞膜蛋白標(biāo)記定義的多種細(xì)胞類型的樣本進(jìn)行分析時(shí)，也可以首先使用熒光或磁珠輔助的方法對(duì)靶細(xì)胞群體進(jìn)行分類，并單獨(dú)進(jìn)行分析，但這樣費(fèi)錢啊~ 而且不能完全辨別細(xì)胞異質(zhì)性的全譜。因?yàn)橐粋€(gè)細(xì)胞群體往往是異質(zhì)性的。比如你想研究某個(gè)細(xì)胞群的基因表達(dá)狀態(tài)，想測(cè)它的mRNA，看表達(dá)譜。問題是，細(xì)胞群不可能都有相同的基因變異，而且不太可能都處于相同的狀態(tài)（不如細(xì)胞周期、分化狀態(tài)等）。那么用傳統(tǒng)方法去測(cè)，弄出來的數(shù)據(jù)不能精細(xì)代表每一簇細(xì)胞，一些稀有的亞型的特征或者比較重要的狀態(tài)就會(huì)被抹平。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)的出現(xiàn)，通過高分辨率和深度分析樣本中的每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，解決了這一局限。scRNA-seq能夠非常高的分辨率和準(zhǔn)確性對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性進(jìn)行評(píng)估，識(shí)別新的細(xì)胞狀態(tài)和群體，并闡明發(fā)育和分化過程中的動(dòng)態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)變。由于這些原因，scRNA-seq技術(shù)對(duì)各個(gè)研究領(lǐng)域產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響。如癌癥，發(fā)育，進(jìn)化，免疫等領(lǐng)域單細(xì)胞都是解析異質(zhì)性的一大利器。
下面我介紹一下單細(xì)胞測(cè)序的工作流程
單細(xì)胞RNA測(cè)序的一般實(shí)驗(yàn)工作流程始于將感興趣的器官或組織解離為活的單細(xì)胞，這需要一個(gè)微小的消化方案，使細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞質(zhì)量最大化，同時(shí)將消化持續(xù)時(shí)間和細(xì)胞死亡降至最低。培養(yǎng)的細(xì)胞同樣被分離并制備成單個(gè)細(xì)胞。然后，通過各種單細(xì)胞捕獲方法捕獲準(zhǔn)備好的細(xì)胞。對(duì)單細(xì)胞RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增和文庫制備。隨后進(jìn)行下一代測(cè)序以產(chǎn)生讀數(shù)，這些讀數(shù)與參考基因組對(duì)齊，處理以進(jìn)行質(zhì)量控制，最后進(jìn)行分析。
二、心血管科 · 單細(xì)胞
心臟異常和疾病對(duì)人類健康的無情威脅促使人們尋求對(duì)心臟的新知識(shí)。細(xì)胞異質(zhì)性成為心臟生理學(xué)和病理學(xué)機(jī)制研究中的一個(gè)主要焦點(diǎn)。成人心臟的細(xì)胞復(fù)雜性還有很多未知之處。最近的研究解釋了某些細(xì)胞類型在心臟生理學(xué)和疾病中的功能。例如，巨噬細(xì)胞(MPS)被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)電傳導(dǎo)，并在小鼠心臟衰老和心肌梗死中發(fā)揮重要作用。人類心臟細(xì)胞圖譜中仍然缺乏，這可能是與人類心臟組織的可獲得性有限有關(guān)。在這里我介紹一篇人類心臟組織的單細(xì)胞測(cè)序相關(guān)的文章。
文獻(xiàn)案例：《單細(xì)胞重建成人心力衰竭和恢復(fù)期間的細(xì)胞圖譜》[2]
這篇文章發(fā)表在期刊: Nature Cell Biology，這本期刊在最近一年的影響因子為 28.824。中科院大類: 生物學(xué) 1區(qū) 中科院小類: 1區(qū) 細(xì)胞生物學(xué)。
結(jié)果解讀：
作者使用了兩種分離方法：富含CM-enriched消化法和regular消化法，前者產(chǎn)生高質(zhì)量和高純度的CMs，后者最適合剩下的心肌細(xì)胞類型。優(yōu)化的CM分離方法獲得了典型的桿狀形態(tài)、高活力、清晰的條紋和具有CM標(biāo)記α-Actinin2的細(xì)胞。為了全面了解正常成人心臟的細(xì)胞組成，作者使用無監(jiān)督聚類t-SNE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃分，并根據(jù)其各自的分子特征將整個(gè)群體分為5種主要細(xì)胞類型，包括心肌細(xì)胞（CMs）、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、成纖維細(xì)胞(FBS)、巨噬細(xì)胞（MPs）和平滑肌細(xì)胞（SMCs）。
為了深入了解心房（A）和心室CMs（V）之間的分子差異，作者應(yīng)用非監(jiān)督聚類對(duì)t-SNE識(shí)別的所有3894個(gè)CMs進(jìn)行了劃分。心房和心室CMs各形成五個(gè)不同的亞群(LA1-5和LV1-5)；房室群(LA和LV中都有的細(xì)胞)是唯一的例外。免疫組織化學(xué)染色證實(shí)LA CM亞簇(LA1和LA2)和LV CM亞簇(LV1和LV3)的存在。接下來，作者檢查了LV CMs、LA CMs和AV共享CMs中的DEGs。雖然LA CMs和LV CMs都表現(xiàn)出獨(dú)特的表達(dá)模式，反映了它們的功能，但AV CMs沒有表現(xiàn)出顯著的功能富集。LA CMs和LV CMs對(duì)肌肉收縮的影響最大，然而，收縮相關(guān)基因的表達(dá)譜在這兩個(gè)compartment之間是不同的。LV CMs在代謝過程中表現(xiàn)出顯著的富集。相比之下，LA CMs更多的參與在細(xì)胞信號(hào)和通訊、發(fā)育和免疫過程中。
由于NCMs已知在心臟內(nèi)穩(wěn)態(tài)和紊亂中起關(guān)鍵作用，作者試圖確定其在成人心臟中的組成。通過t-SNE將ECs、FBS、MPS和SMC分別劃分為4、3、3和4個(gè)亞簇。亞簇相對(duì)均勻地分布在LA和LV之間。GO分析表明，EC亞簇3(EC3)富集到與核糖體生物發(fā)生、細(xì)胞因子產(chǎn)生和趨化因子分泌相關(guān)的功能，而EC4與免疫應(yīng)答、細(xì)胞-基質(zhì)粘附和細(xì)胞連接組裝相關(guān)。通用EC標(biāo)記PECAM1與EC3標(biāo)記ACKR1的共同定位證實(shí)了該EC亞型的存在。此外，MP2與免疫反應(yīng)高度相關(guān)，而MP3則參與電偶聯(lián)。FB1和SMC1都與細(xì)胞外基質(zhì)組織有關(guān)，這表明在成人心臟中這兩種細(xì)胞類型之間存在功能重疊。FB1與LA中其他細(xì)胞類型的相互作用頻率最高，而EC3(ACKR1+)在左心室中的頻率最高，這表明這些亞型利用不同的細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞中樞來維持體內(nèi)平衡。
小編總結(jié)：
作者在LA和LV中發(fā)現(xiàn)了意想不到的CM多樣性，其特征是在每個(gè)亞型中優(yōu)先表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記、分泌蛋白、細(xì)胞骨架基因和轉(zhuǎn)錄因子。不同的亞群也表達(dá)了一組不同的與收縮和代謝相關(guān)的基因，這表明這些亞群在維持心臟功能方面具有不同的作用。在今后的研究中，系統(tǒng)地確定CM和NCM亞簇在生理和疾病中的空間定位和功能將是非常重要的。
三、呼吸科 · 單細(xì)胞
肺是呼吸系統(tǒng)中最常見的器官，肺發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而微妙的過程，由多達(dá)40種細(xì)胞類型的空間和協(xié)調(diào)的促進(jìn)發(fā)育形成。肺細(xì)胞系的發(fā)育起源和異質(zhì)性一直是幾十年來研究的焦點(diǎn)。然而，由于肺組織存在復(fù)雜性和異質(zhì)性，研究單個(gè)細(xì)胞類型中基因表達(dá)的細(xì)微變化時(shí)非常困難?？焖侔l(fā)展的單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)能夠?qū)ι镞^程中的復(fù)雜細(xì)胞動(dòng)力學(xué)進(jìn)行觀察。
文獻(xiàn)案例：《單細(xì)胞RNA測(cè)序顯示早期肺腺癌（攜帶EGFR突變）異質(zhì)性腫瘤和免疫細(xì)胞群》[3]
這篇文章發(fā)表在期刊: Oncogene，在最近一年的影響因子: 9.867，中科院大類: 醫(yī)學(xué) 1區(qū)
中科院小類: 1區(qū) 生化與分子生物學(xué)。
結(jié)果解讀：
經(jīng)10×Genomics單細(xì)胞3’rna文庫構(gòu)建和測(cè)序后，從組織中制備單細(xì)胞懸液，構(gòu)建scrna-seq文庫。作者對(duì)所有7個(gè)腫瘤樣本和5個(gè)匹配的肺組織的單細(xì)胞進(jìn)行了無監(jiān)督的聚類，并用UMAP對(duì)其進(jìn)行可視化處理，檢索到32個(gè)不同的簇。為了鑒定不同的細(xì)胞類型，作者分析了典型標(biāo)記在每個(gè)簇中的表達(dá)以及差異表達(dá)基因的富集。這樣就可以將這些細(xì)胞群分為腫瘤細(xì)胞、支氣管/肺泡上皮細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
由于免疫成分可以對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到至關(guān)重要的影響，作者研究了LUAD早期樣本中免疫浸潤(rùn)的特征。作者將所有的髓系細(xì)胞分成14個(gè)不同的亞群，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)(~90%)的髓系細(xì)胞是表達(dá)CD68的巨噬細(xì)胞。與正常組織中的巨噬細(xì)胞相比，TAMs高表達(dá)APOE和SPP1。TAMs中富集的DEGs與細(xì)胞外基質(zhì)分解、低氧反應(yīng)、正向調(diào)節(jié)膽固醇外流以及對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素1B(IL1B)的反應(yīng)等途徑有關(guān)。然后作者用抗CD68和抗Ki67抗體通過免疫組化證實(shí)了這些增殖性巨噬細(xì)胞的存在。為了了解LUAD早期TAMs的極化，作者檢測(cè)了傳統(tǒng)的經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1)和替代活化巨噬細(xì)胞(M2)特征基因在這些簇中的表達(dá)。腫瘤組織和正常肺組織的巨噬細(xì)胞均未表現(xiàn)出特異性的M1或M2特征。但是，它們具有M1和M2簽名基因的類似表達(dá)水平。雖然早期LUAD中的TAMs似乎表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)生的基因，但它們還沒有明顯的M1和M2極化。
所有T細(xì)胞的無偏聚類在腫瘤樣本和正常組織之間沒有顯示任何不同的T細(xì)胞簇，所以作者決定檢查每個(gè)簇中T細(xì)胞亞型標(biāo)記的表達(dá)。作者發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤(rùn)的T細(xì)胞高表達(dá)調(diào)節(jié)性和耗竭性標(biāo)志物，如TIGIT、LAYN、FOXP3和CTLA4，而正常組織中的T細(xì)胞高表達(dá)效應(yīng)性和幼稚T細(xì)胞標(biāo)志物。作者還鑒定了增殖性T細(xì)胞亞型，它既表現(xiàn)出效應(yīng)性T細(xì)胞的特征，又表現(xiàn)出功能障礙的標(biāo)志。
拷貝數(shù)量變化CNV異常的細(xì)胞被鑒定為惡性細(xì)胞。在功能富集分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將其劃分為8簇。這些簇分別富含低氧、糖酵解、氧化磷酸化、翻譯起始、細(xì)胞周期和抗原提呈等途徑。由于腫瘤細(xì)胞同時(shí)高表達(dá)近端和遠(yuǎn)端上皮祖細(xì)胞標(biāo)志物，腫瘤細(xì)胞由不同細(xì)胞系表達(dá)譜的異質(zhì)群體組成。
小編總結(jié)：
利用scRNA-seq技術(shù)(10×Genomics)，作者同時(shí)、全面地分析了腫瘤標(biāo)本中不同的細(xì)胞亞群。并且鑒定了不同的腫瘤細(xì)胞亞群及其TME成分，表明LUAD在腫瘤發(fā)生的早期就已經(jīng)出現(xiàn)了異質(zhì)性。這項(xiàng)工作為了解亞洲患者中攜帶EGFR突變的早期LUAD患者的異質(zhì)性和免疫細(xì)胞圖譜提供了有價(jià)值的資源。
四、運(yùn)動(dòng)關(guān)節(jié)科 · 單細(xì)胞
在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中，其典型的代表之一為骨骼肌細(xì)胞，下面我將從骨骼肌細(xì)胞的角度講述在運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)單細(xì)胞測(cè)序如何開展。在生理?xiàng)l件下，成人骨骼肌的細(xì)胞循環(huán)率相對(duì)較低。骨骼肌是運(yùn)動(dòng)、體溫和新陳代謝的重要組織。它也是哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的最具再生能力的組織之一，能夠在各種創(chuàng)傷和病理?xiàng)l件下再生。雖然衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)是損傷后肌纖維再生的主要參與者，但成功的肌肉愈合需要其他細(xì)胞類型的參與，這些細(xì)胞類型直接或間接地促進(jìn)了這一過程。在這種情況下，免疫細(xì)胞和纖維/成脂前體細(xì)胞在清除損傷組織的方面起著重要的作用，同時(shí)也幫助干細(xì)胞發(fā)揮其再生的作用。在過去的幾十年里，人們對(duì)肌肉再生過程中發(fā)生的復(fù)雜細(xì)胞交互進(jìn)行了詳細(xì)的研究。然而，到目前為止，大多數(shù)研究主要依賴于通過少數(shù)幾個(gè)特異性標(biāo)志物的表達(dá)來鑒定大量細(xì)胞群體，并分類進(jìn)行體外分析。因此，由于缺乏合適的技術(shù)來解決這個(gè)問題，人們對(duì)肌肉細(xì)胞群體的異質(zhì)性知之甚少。直到最近，確定單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的技術(shù)的發(fā)展才得以揭示這種異質(zhì)性的程度及其在肌肉生理學(xué)和病理學(xué)上的可能意義。
文獻(xiàn)案例：《骨骼肌再生過程中細(xì)胞群動(dòng)態(tài)的高維單細(xì)胞定量分析》[4]
這篇文章發(fā)表在期刊: Cells，在最近一年的影響因子: 6.6，中科院大類: 生物學(xué) 3區(qū)
中科院小類: 3區(qū) 細(xì)胞生物學(xué)。
結(jié)果解讀：
wt：野生型模型 mdx model：肌營(yíng)養(yǎng)不良癥小鼠模型
作者試圖確定兩種小鼠模型中不同的單個(gè)核細(xì)胞群體的特征，并監(jiān)測(cè)細(xì)胞群體在再生過程中的豐度變化。在wt肌肉中，分離的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量在損傷后增加，在第3天達(dá)到峰值，第10天恢復(fù)到接近基線水平。相反，與組織學(xué)分析中觀察到的mdx肌肉的彈性一致，mdx小鼠受損的肌肉中沒有檢測(cè)到這種反應(yīng)，在整個(gè)再生過程中，mdx小鼠的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量保持不變。
應(yīng)用Cytofkit中t-SNE算法，對(duì)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了降維處理，圖2A中14個(gè)抗原的讀數(shù)被用作t-SNE算法的輸入。這種方法產(chǎn)生了wt骨骼肌中單個(gè)核細(xì)胞群體抗原表達(dá)譜的二維圖，并導(dǎo)致識(shí)別出15個(gè)不同的細(xì)胞簇。通過將15個(gè)已識(shí)別的簇的表達(dá)譜與文獻(xiàn)中描述的細(xì)胞類型的表達(dá)譜進(jìn)行匹配，將其進(jìn)一步分組為8種細(xì)胞類型。巨噬細(xì)胞、肌源性祖細(xì)胞(MPS)、纖維/成脂前體細(xì)胞(FAP)、內(nèi)皮祖細(xì)胞、外周細(xì)胞樣細(xì)胞、間充質(zhì)樣細(xì)胞，剩余的三個(gè)非豐富簇的表達(dá)譜不能與已經(jīng)描述的任何肌肉細(xì)胞類型匹配，因此被歸為“其他”。當(dāng)作者分析不同時(shí)間點(diǎn)的樣品時(shí)，還可以監(jiān)測(cè)CTX損傷（肌肉損傷）后細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。事實(shí)上，圖2C中的情況并不是一成不變的，因?yàn)椴煌?xì)胞群體的相對(duì)豐度在再生過程中發(fā)生了變化。通過比較不同時(shí)間點(diǎn)的二維t-SNE圖可以更好地理解這些。在這里，用與細(xì)胞密度有關(guān)的顏色，從藍(lán)色(低密度)到紅色(高密度)，以了解再生過程中細(xì)胞群體比例的顯著變化。
在動(dòng)態(tài)肌修復(fù)中，大約60%的單個(gè)核細(xì)胞暴露了CD45抗原。這個(gè)細(xì)胞隔室在受損后數(shù)量增加，在第1天和第3天達(dá)到高峰。在生理?xiàng)l件下，一小部分造血細(xì)胞也表達(dá)F4/80+抗原，這是一種泛巨噬細(xì)胞標(biāo)志物。肌源性祖細(xì)胞(MPS)和纖維/成脂祖細(xì)胞(FAPs)未表達(dá)CD45抗原。作者的單細(xì)胞分析顯示，從第3天到第10天，兩種細(xì)胞類型的數(shù)量都翻了一倍以上。FAP群隨著再生過程的進(jìn)展而變得更多，在CTX損傷后5-10天達(dá)到最大擴(kuò)張，并在第20天恢復(fù)到幾乎對(duì)照組的水平，CD31簇4被認(rèn)為是肌內(nèi)皮細(xì)胞亞群，包含高水平表達(dá)α7整合素抗原的細(xì)胞?？傮w而言，內(nèi)皮細(xì)胞在損傷后的最初幾天，它們的數(shù)量明顯減少，然后在再生過程接近尾聲時(shí)，超過了體內(nèi)平衡水平。外周細(xì)胞樣這一群體的豐度遵循一個(gè)受再生過程控制的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，而且與經(jīng)典內(nèi)皮細(xì)胞的情況也非常相似。
作者進(jìn)一步的目的是描述mdx營(yíng)養(yǎng)不良肌肉對(duì)急性損傷的反應(yīng)和隨后的再生過程。從mdx小鼠未損傷和ctx損傷的骨骼肌中分離單個(gè)核細(xì)胞，步驟描述的wt相同。然而，通過比較不同簇中的抗原表達(dá)譜，作者將每個(gè)簇與一種主要的肌肉單個(gè)核細(xì)胞類型相關(guān)聯(lián)，并將其與wt中觀察到的相匹配。正如在損傷后恢復(fù)的wt肌肉中觀察到的那樣，在mdx模型中，不同細(xì)胞群的相對(duì)數(shù)量在損傷后和再生過程中也發(fā)生了變化。
作為一個(gè)整體，CD45+隔室中的細(xì)胞數(shù)量在再生過程中沒有明顯變化，然而，細(xì)胞在隔室內(nèi)的不同種群中的分布是高度動(dòng)態(tài)的。在急性損傷前，mdx肌肉中已有大量的巨噬細(xì)胞，在wt模型中觀察到，ctx治療后早期顯著增加，在第20天恢復(fù)到mdx基線水平，約占單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的30%。另一方面，M2巨噬細(xì)胞在損傷后早期保持不變，直到再生過程后期才增加。雖然MAP的數(shù)量在急性損傷后的第一天就下降了，并在隨后的時(shí)間恢復(fù)到未受干擾的水平，但在整個(gè)再生過程中，F(xiàn)AP保持在一個(gè)恒定的高水平。內(nèi)皮祖細(xì)胞的cd31表達(dá)細(xì)胞，數(shù)量首先下降了大約三倍，在再生過程的后期才恢復(fù)。這與在wt中觀察到的情況不同。外周細(xì)胞樣群也表現(xiàn)相似，在損傷后立即數(shù)量下降，然后緩慢恢復(fù)，但在第20天沒有達(dá)到完全恢復(fù)。
小編總結(jié)：
骨骼肌在受損時(shí)具有驚人的自我修復(fù)能力。通過應(yīng)用降維技術(shù)，如t-SNE算法，作者生成了二維地圖，提供了對(duì)重建過程的可視化描述。并在單細(xì)胞水平上描述了野生型(wt)和肌營(yíng)養(yǎng)不良(mdx)小鼠模型急性損傷后肌肉單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)。通過檢測(cè)wt或mdx小鼠注射毒素后1、3、5、10和20天的肌肉單個(gè)核細(xì)胞樣本來監(jiān)測(cè)再生過程。
五、神經(jīng)科 · 單細(xì)胞
神經(jīng)損傷可能導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛，神經(jīng)病理性疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。周圍神經(jīng)損傷可誘導(dǎo)一系列的細(xì)胞和分子反應(yīng)，包括基因調(diào)控、軸突變性、衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞和Schwann細(xì)胞的激活、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等。損傷背根神經(jīng)節(jié)基因表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)已被廣泛研究，并可能是神經(jīng)病理性疼痛的重要觸發(fā)因素。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)是一種檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)大技術(shù)。scRNA-seq被應(yīng)用于體感神經(jīng)元的異質(zhì)性檢測(cè)和背根節(jié)（DRG）神經(jīng)元類型的鑒定。分析scRNA-seq數(shù)據(jù)的算法揭示了復(fù)雜生物過程中單細(xì)胞基因表達(dá)的動(dòng)力學(xué)。因此，scRNA-seq可以為我們提供對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的動(dòng)態(tài)進(jìn)展的更深層次的洞察力。
案例解讀：《體感神經(jīng)元的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析揭示神經(jīng)病理性疼痛的時(shí)間發(fā)展》[5]
這篇文章發(fā)表在期刊: Cell Research，在最近一年的影響因子: 25.617，中科院大類: 生物學(xué) 1區(qū) 中科院小類: 1區(qū) 細(xì)胞生物學(xué)。
結(jié)果解讀：
作者打算確定成年小鼠在神經(jīng)病理性疼痛條件下背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄。嚙齒類動(dòng)物受到單側(cè)SNI（保留性神經(jīng)損傷），可引起明顯而持久的機(jī)械性痛覺超敏。作者在SNI后6小時(shí)、24小時(shí)、2天(2天)、7天和14天的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)分離自同側(cè)L4和L5背根節(jié)的細(xì)胞進(jìn)行10x Genomics scRNA-seq。DRG細(xì)胞可分為9種主要類型，具有不同的分子標(biāo)記。
為了探索正常和神經(jīng)病理性疼痛條件下DRG神經(jīng)元的異質(zhì)性，作者根據(jù)其轉(zhuǎn)錄特征對(duì)DRG神經(jīng)元進(jìn)行了重新分類。兩個(gè)對(duì)照樣本的神經(jīng)元在t-SNE圖上均勻分布。用不同的分子標(biāo)記對(duì)19個(gè)神經(jīng)元簇進(jìn)行了無偏鑒定。代表性基因被用來注釋這些簇。
作者使用Seurat通過10×Genomics將來自對(duì)照組和SNI組 14d的數(shù)據(jù)與使用Smart-seq2技術(shù)的數(shù)據(jù)進(jìn)行集成。結(jié)果，作者確定了18個(gè)簇，在所有神經(jīng)元類型中，Smart-seq2檢測(cè)到的基因數(shù)量都多于10×Genomics學(xué)檢測(cè)到的基因數(shù)量，然后，作者將18個(gè)簇與之前的報(bào)告進(jìn)行了匹配，大多數(shù)簇與之前的結(jié)果是一致的。作者的數(shù)據(jù)顯示，PROKR2在~1.7%的DRG神經(jīng)元中表達(dá)，而Smr2在~1.6%的DRG神經(jīng)元中表達(dá)。RNAScope分析表明，Cldn9與Zcchc12在DRG神經(jīng)元中沒有共表達(dá)。DCN幾乎只在神經(jīng)元胞體外表達(dá)，而只有~1%的DRG神經(jīng)元表達(dá)DCN。Rxfp1在~1%的DRG神經(jīng)元中特異性表達(dá)，而在其他細(xì)胞中不表達(dá)。DCN和Rxfp1在DRG神經(jīng)元中的表達(dá)與Zcchc12的表達(dá)一致。因此，用10×Genomics scRNA-seq鑒定了稀有的DRG神經(jīng)元簇。
為了研究SNI誘導(dǎo)的新生神經(jīng)元類型的發(fā)育和進(jìn)展，作者將t-SNE圖按時(shí)間點(diǎn)拆分。1-16簇的神經(jīng)元在各時(shí)間點(diǎn)均呈均勻分布。SNI之后出現(xiàn)了三個(gè)新的簇，命名為SNIIC1-3。SNIIC可能在SNI后很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)消失。在這三個(gè)SNI誘導(dǎo)的神經(jīng)元簇中鑒定出數(shù)百個(gè)DEGs。用雙熒光ISH結(jié)果驗(yàn)證，在SNI24h和SNI2d，ATF3和Gfra3在~5%的DRG神經(jīng)元中共表達(dá)，在SNI 2d時(shí)，ATF3和Gfra3在~12%的DRG神經(jīng)元中共表達(dá)。此外，SNIIC1和SNIIC3也用Gal（一種有助于軸突再生和調(diào)節(jié)神經(jīng)病理性疼痛的神經(jīng)肽）標(biāo)記。因此，作者的數(shù)據(jù)表明SNIIC2神經(jīng)元只是暫時(shí)存在的。
小編總結(jié)：
最近，10×Genomics scRNA-seq已被應(yīng)用于定義神經(jīng)元規(guī)范的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對(duì)于神經(jīng)元的范疇來講，我們應(yīng)該首先對(duì)處理組的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行了10×Genomics scRNA-seq。首先，確定了與處理組密切相關(guān)的新聚類簇。然后，結(jié)合表面標(biāo)志物分析新聚類簇。此外，如果我們還想加深文章的層次，還可以重建了與神經(jīng)元類型相關(guān)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后，再檢測(cè)了功能基因的表達(dá)變化，揭示了相關(guān)的分子是一個(gè)新的潛在的治療靶點(diǎn)。這樣一篇高分的文章就出現(xiàn)了~
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