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今天給大家?guī)硪黄?strong>成纖維細(xì)胞與胃癌免疫微環(huán)境相關(guān)的生信分析，研究思路設(shè)計精美，這就給各位解讀一下！
文章“成纖維細(xì)胞衍生的LPP作為胃癌治療反應(yīng)和治療靶點(diǎn)的生物標(biāo)志物”發(fā)表在《Mol Ther Oncolytics》，影響因子7.2分。
背景介紹
尋找到導(dǎo)致癌癥患者之間免疫檢查點(diǎn)抑制劑，如PD-1，PD-L1治療差異的原因，一直是眾多論文的點(diǎn)睛之筆。
腫瘤微環(huán)境與基因組異常改變聯(lián)合分析，可以體現(xiàn)出不同亞組癌癥患者之間的異質(zhì)性。
3、融合基因，是指兩個或者多個基因聯(lián)合起來，一起轉(zhuǎn)錄形成一個轉(zhuǎn)錄本。這個過程一般由于染色體易位、缺失等原因所致。慢性粒細(xì)胞白血病，其分子生物學(xué)特征就是檢測到BCR-ABL融合基因，該融合基因翻譯出的融合蛋白具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，會導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖、細(xì)胞凋亡受抑制。
3、脂質(zhì)瘤首選伴侶 （lipoma preferred partner， LPP） 在既往研究中被鑒定為高遷移基團(tuán)蛋白（高遷移基蛋白， HMGI-C）和混合血統(tǒng)白血病 （mixed lineage leukemia， MLL）的融合基因。LPP與HMGI-C的融合蛋白的表達(dá)會使NIH3T3細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。[1][2][3]
結(jié)果展示
GC中PD-L1和IFN-γ相關(guān)亞群
GC中PD-L1-和IFN-γ相關(guān)亞群
公共數(shù)據(jù)庫入選的胃癌隊列有，TCGA-STAD （n = 350）、GSE26899 （n = 93）、GSE26901 （n = 109）、GSE66229 （n = 300）和GSE28541 （n = 40），共計892個胃癌樣本。作者首先估計了腫瘤樣本中22種免疫細(xì)胞類型的豐度，發(fā)現(xiàn)七個類型的免疫細(xì)胞（CD8 + T細(xì)胞，激活CD4 +記憶T細(xì)胞，濾泡輔助T細(xì)胞，γδT細(xì)胞，激活NK細(xì)胞，M1 巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞）與PD1存在正相關(guān)，四個類型的免疫細(xì)胞（漿細(xì)胞，CD4 + 記憶T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，和M2巨噬細(xì)胞）與PD-L1表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān) （圖1A）。作者接下來選擇對IFN-γ進(jìn)行同樣的相關(guān)性分析，（IFN-γ是PD-L1轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子，由活化的T和NK細(xì)胞分泌），結(jié)果發(fā)現(xiàn)IFN-γ與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析結(jié)果與PD-L1具有一致性（圖1B）。
然后，作者通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法（LASSO），對5個隊列中PD1和IFN-g表達(dá)水平相關(guān)的免疫細(xì)胞進(jìn)行排序。鑒定出7種最相關(guān)的免疫細(xì)胞，包括靜息CD4 +記憶T細(xì)胞、活化CD4 +記憶T細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞、單核細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。作者選擇7種免疫細(xì)胞浸潤腫瘤的豐度對胃癌患者進(jìn)行無監(jiān)督聚類分層。結(jié)果顯示，胃癌患者被分為三個不同的亞組，分別為亞組A、B和C （圖1C）。值得注意的是，在胃癌A組中激活CD4 +記憶T細(xì)胞有較高的浸潤比例，亞組C則有較高的靜息CD4 +記憶T細(xì)胞。另外，PD-L1和IFN-γ的表達(dá)水平在三個亞組中都顯著不同，從A亞組到C亞組逐漸下降（圖1D和1E）。生存比較分析顯示，A亞組患者預(yù)后最差，而C亞組患者預(yù)后最好（圖1F）。
GC中PD-L1-和IFN-γ相關(guān)亞群的基因組特征
GC中PD-L1-和IFN-γ相關(guān)亞群的基因組特征
作者對由上一步得到的亞組分型的突變數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。不同亞組之間的腫瘤突變負(fù)荷存在顯著差異，A亞組的腫瘤突變負(fù)荷水平最高，C亞組的腫瘤突變負(fù)荷最低(圖2A)。分別取三個亞組中突變頻率最高的10個基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)五個基因（TTN、TP53、MUC16、CSMD3和LRP1B）在三個亞組中具有較高的突變頻率（圖2B）。作者還繪制了瀑布圖示每個亞組中突變頻率最高的基因(圖2C-E)。在所有三個亞組中，TTN和TP53是最常見的錯義突變。其中，亞組A的ARID1A移位突變和PIK3CA錯義突變均多于其他兩個亞組。B亞組和C亞組中，MUC16錯義突變更普遍。值得注意的是，A亞組中有同時突變發(fā)生率最高，如PIK3CA和ARID1A突變（圖2F），而在B亞組中存在更多的互斥突變事件（如ARID1A和TP53）（圖2G）。在C亞組中，大多數(shù)突變事件是相對獨(dú)立的，沒有交互作用(圖2H)。
另外，PD-L1和IFN-g的表達(dá)水平、腫瘤突變和生存結(jié)果在A亞組和C亞組顯著不同。A亞組17q21.31區(qū)（BRCA1）、4p16.1區(qū)（WDR1）擴(kuò)增顯著，3p14.2區(qū)（FHIT）缺失。C亞組1p31.1區(qū)（NEGR1）、3q29區(qū)（ATP13A4）擴(kuò)增，17p11.2區(qū)（FAM106A、USP32P2、CCDC144B）缺失。A、C亞組的之間進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，分別發(fā)現(xiàn)339、375個基因在兩組顯著上調(diào)。富集分析顯示，A亞組中上調(diào)的基因在抗原加工提呈、免疫細(xì)胞分化等免疫活性相關(guān)通路中富集，而C亞組中上調(diào)的基因則富集包括礦物質(zhì)吸收和胃酸分泌在內(nèi)的消化代謝途徑。
PD-L1- and IFN-γ-associated risk score for prognostication in GC
PD-L1-和IFN-γ相關(guān)風(fēng)險評分對GC預(yù)后的影響
作者從上述A、C亞組差異表達(dá)基因中，通過Cox回歸分析篩選出45個預(yù)后相關(guān)基因，其中保護(hù)性基因14個，危險性基因31個。然后利用LASSO算法篩選出9個有利基因和5個風(fēng)險基因作為最佳特征基因（圖3A）。
最終的風(fēng)險評分是根據(jù)簽名基因的表達(dá)及其系數(shù)制定的。根據(jù)風(fēng)險評分的最佳臨界值將患者分為生存結(jié)局明顯的低危組和高危組(圖3B和3C)。生存比較顯示，低危組的生存結(jié)果明顯優(yōu)于高危組。作者還使用另一個數(shù)據(jù)集GSE26899驗證了風(fēng)險評分的分層有效性，并發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖3D和3E）。
LPP as a hub node in PD-L1- and IFN-γ-associated lncRNA - miRNA-gene regulatory network
LPP作為PD-L1和IFN-γ相關(guān)的lncRNA - miRNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點(diǎn)
作者接下來構(gòu)建了一個PD-L1-和IFN-γ--相關(guān)的lncRNA - miRNA基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并從這個復(fù)雜的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中識別出關(guān)鍵分子。作者發(fā)現(xiàn)共有59個miRNA和19個lncRNA在A和C亞組之間存在異常表達(dá)(圖4A)。圖4B顯示了來自三個數(shù)據(jù)庫(即miRTarBase、miRDB和TargetScan)的異常表達(dá)的miRNA和mRNA之間的預(yù)測調(diào)控關(guān)系(miRNA-gene)。合并StarBase數(shù)據(jù)庫中的lncRNA-miRNA數(shù)據(jù)，得到最終的lncRNA-miRNA-基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò) (圖4C)?；诰W(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，作者確定LPP基因為該網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點(diǎn)。核心的子網(wǎng)如圖4D所示。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)LPP的表達(dá)從A亞組到C亞組開始逐漸下降(圖4E)，這與PD-L1和IFN-g的表達(dá)類似。高危組LPP表達(dá)高于低危組(圖4F)。提示LPP可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。
High expression of LPP is an independent risk factor for poor prognosis in GC
LPP高表達(dá)是胃癌預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素
TCGA泛癌探索LPP的轉(zhuǎn)錄水平(圖5A)。結(jié)果顯示LPP在4種腫瘤類型中顯著上調(diào)，在9種惡性腫瘤中顯著下調(diào)。LPP在胃癌中顯著過表達(dá)。獨(dú)立數(shù)據(jù)集GSE66229和GSE29272中也發(fā)現(xiàn)了一致的結(jié)果(圖5B和5C)。通過采用Maximally selected rank statistics算法，作者根據(jù)LPP表達(dá)水平將患者分為兩組(圖5D)。生存比較發(fā)現(xiàn)，LPP高表達(dá)組的生存率低于LPP低表達(dá)組(圖5E)。在另外兩個數(shù)據(jù)集GSE62254和GSE84437中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果(圖5F 5G)。多因素Cox回歸分析顯示，在上述3個數(shù)據(jù)集中，LPP高表達(dá)是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立因素。
Fibroblast-derived LPP associates with tumor progression and resistance to chemotherapy and immunotherapy in GC
成纖維細(xì)胞來源的LPP與胃癌的腫瘤進(jìn)展和化療和免疫治療的耐藥性有關(guān)
作者還使用HPA數(shù)據(jù)庫，采用胃癌免疫組化結(jié)果，觀察LPP蛋白在胃癌中的表達(dá)。LPP蛋白在腫瘤組織間質(zhì)成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，而在正常胃組織中幾乎未見表達(dá)。作者還發(fā)現(xiàn)高LPP表達(dá)與腫瘤實(shí)體中纖維母細(xì)胞浸潤增加相關(guān)(圖3B)。LPP的表達(dá)與6個成纖維細(xì)胞標(biāo)志物呈正相關(guān)，這些標(biāo)志物用于成纖維細(xì)胞的鑒定。如前文所述，LPP在CD4 +活化記憶T細(xì)胞高浸潤的A亞組中表達(dá)增高，患者的預(yù)后差。在C亞組中表達(dá)降低，表現(xiàn)為靜息CD4 +記憶T細(xì)胞浸潤率高，預(yù)后較好。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)LPP高表達(dá)與激活的CD4 +記憶T細(xì)胞浸潤水平以及較低的靜息的CD4 +記憶T細(xì)胞浸潤水平相關(guān)。
為了進(jìn)一步驗證成纖維細(xì)胞來源LPP的表達(dá)及其在胃癌進(jìn)展的過程中，作者臨床收集15對臨床標(biāo)本，采用免疫組化染色法驗證LPP蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示LPP蛋白在腫瘤炎癥中高表達(dá)。(圖6A和6B)。此外，作者由增加單細(xì)胞分析來豐富結(jié)果，結(jié)果顯示LPP在成纖維細(xì)胞中顯著富集 (圖6C和6D)。連續(xù)組織切片染色顯示LPP蛋白在成纖維細(xì)胞中受限表達(dá)，并且與內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD34等分布明顯不同(圖6E)。為了進(jìn)一步評估纖維母細(xì)胞來源的LPP在GC發(fā)展中的作用，我們建立了穩(wěn)定的LPP敲除成纖維細(xì)胞細(xì)胞系，用于體內(nèi)腫瘤生長實(shí)驗(圖6F)。結(jié)果顯示，注射GC細(xì)胞混合LPP敲除成纖維細(xì)胞的小鼠，其腫瘤體積比注射癌細(xì)胞混合對照的小鼠小(圖6G和6H)。這些結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞來源的LPP與胃癌的腫瘤生長有關(guān)。
為了研究成纖維細(xì)胞來源的LPP表達(dá)對化療反應(yīng)的影響，作者使用TCGA-STAD數(shù)據(jù)集評估GDSC數(shù)據(jù)庫中四種臨床使用的化療藥物(順鉑、多西他賽、吉西他濱和紫杉醇)的半最大抑制濃度(IC50)值。結(jié)果顯示LPP高表達(dá)患者四種化合物的IC50值均高于LPP低表達(dá)患者，提示LPP高表達(dá)患者基于化療對這些化合物的敏感性較低(圖7A 7D)。通過使用另一個數(shù)據(jù)集GSE62254，我們驗證了LPP高表達(dá)的患者比LPP低表達(dá)的患者獲益更少，無論是否在化療的條件下(圖7E 7H)。這些結(jié)果提示LPP高表達(dá)的GC患者對當(dāng)前化療方案的反應(yīng)較低。然后，作者進(jìn)一步使用GEO胃癌數(shù)據(jù)集，包括45名接受免疫治療的胃癌患者，研究了LPP表達(dá)與免疫治療反應(yīng)的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示LPP在反應(yīng)患者中的表達(dá)低于無反應(yīng)患者(圖8A和8B)。LPP高表達(dá)的患者比LPP低表達(dá)的患者反應(yīng)更低(圖8C)。作者還對另一個包含26名接受抗PD-1治療的黑色素瘤患者的隊列進(jìn)行了驗證，也獲得了類似的結(jié)果 (圖8D -F)。
此外，作者計算了腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)評分，以預(yù)測TCGA-STAD隊列中胃癌患者對免疫檢查點(diǎn)封鎖的反應(yīng)。結(jié)果顯示，LPP高表達(dá)患者的TIDE評分高于LPP低表達(dá)患者(圖8G)。根據(jù)患者的TIDE評分，將患者分為有響應(yīng)者和無響應(yīng)者兩組(圖8H)。我們發(fā)現(xiàn)高表達(dá)LPP組的有效率低于低表達(dá)LPP組(圖8I)。這些結(jié)果表明，LPP的高表達(dá)可增加胃癌患者的免疫逃逸和免疫治療抵抗的能力。
Underlying chemical compounds sensitive to GC patients with high LPP expression
LPP高表達(dá)的GC患者敏感的基礎(chǔ)化合物
通過GDSC數(shù)據(jù)庫，作者進(jìn)一步探索了對LPP高表達(dá)GC患者敏感的潛在化合物。根據(jù)每個TCGA-STAD樣品中138個化合物的IC50值，共有28個化合物被鑒定為GC患者高LPP表達(dá)的敏感藥物。這些化合物靶向于參與腫瘤發(fā)生的典型通路，如IGF1R、JNK和p38、PI3K/MTOR、細(xì)胞周期和凋亡調(diào)控信號通路。作者的發(fā)現(xiàn)有助于胃癌治療的藥物，并建立與化療和免疫治療聯(lián)合對抗耐藥性的靶。
總結(jié)
本篇范文，作者在5個胃癌公共數(shù)據(jù)集中找出與PD-1以及IFN-γ分子最相關(guān)的免疫細(xì)胞，根據(jù)這些免疫細(xì)胞的豐度，對TCGA胃癌患者進(jìn)行聚類分型，再走后面的差異基因，預(yù)后模型套路。數(shù)據(jù)集是固定的，作者只討論了胃癌，其它癌種，更換一下也可復(fù)現(xiàn)哦！
1. Petit MM, Fradelizi J, Golsteyn RM, et al. LPP, an actin cytoskeleton protein related to zyxin, harbors a nuclear export signal and transcriptional activation capacity. Molecular biology of the cell. 2000;111:117-129.
2. Dahéron L, Veinstein A, Brizard F, et al. Human LPP gene is fused to MLL in a secondary acute leukemia with a t(3;11) (q28;q23). Genes, chromosomes & cancer. 2001;314:382-389.
3. Fedele M, Berlingieri MT, Scala S, et al. Truncated and chimeric HMGI-C genes induce neoplastic transformation of NIH3T3 murine fibroblasts. Oncogene. 1998;174:413-418.
