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今天給大家分享一篇2022年9月26日發(fā)表在Nature Communications（IF: 17.694）上，基于RAS致癌通路預(yù)測(cè)肺腺癌對(duì)化療的治療反應(yīng)以及預(yù)后的文章。
RAS oncogenic activity predicts response to chemotherapy and outcome in lung
adenocarcinoma
RAS致癌通路預(yù)測(cè)肺腺癌對(duì)化療的治療反應(yīng)以及預(yù)后
一．研究背景
RAS癌基因在將近20%的人類(lèi)癌癥中發(fā)生突變，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動(dòng)因素。點(diǎn)突變主要發(fā)生在三種亞型HRAS、KRAS和NRAS的密碼子12、13和61中，并且點(diǎn)突變的發(fā)生會(huì)降低其編碼蛋白的GTPase活性，導(dǎo)致GTP結(jié)合的活性構(gòu)象的積累。其中，KRAS是最常突變的RAS亞型，在胰腺導(dǎo)管腺癌（88%）、大腸腺癌（50%）和肺腺癌（32%）中的發(fā)病率特別高。大量文獻(xiàn)報(bào)道KRAS的突變?cè)谀[瘤侵襲性、轉(zhuǎn)移和化療抵抗中起到重要作用。
在此，本研究提出了一種基于RAS調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的樣本分子分型方法，該方法可預(yù)測(cè)肺腺癌和其他實(shí)體腫瘤的化療治療療效以及預(yù)后反應(yīng)。作者推導(dǎo)出一個(gè)基因表達(dá)相關(guān)的特征稱(chēng)為RAS84，并應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建分類(lèi)器，根據(jù)患者腫瘤中RAS84的表達(dá)對(duì)患者進(jìn)行亞型分類(lèi)。使用這種方法，作者發(fā)現(xiàn)RAS轉(zhuǎn)錄活性可以預(yù)測(cè)肺腺癌和其他幾種實(shí)體腫瘤的臨床預(yù)后，但實(shí)際上，KRAS突變本身并不能很好地預(yù)測(cè)這些癌癥的臨床預(yù)后。當(dāng)將RAS84應(yīng)用于化療治療患者隊(duì)列時(shí)，該研究的分類(lèi)器預(yù)測(cè)RAS84表達(dá)水平最高的受試者治療療效較差。該方法將為研究大隊(duì)列患者中致癌RAS活性的影響提供可能性，并有助于預(yù)測(cè)與致癌RAS活性相關(guān)的治療敏感性，例如化療等。
二．研究結(jié)果
1、利用肺癌細(xì)胞系基因表達(dá)數(shù)據(jù)構(gòu)建RAS84
作者旨在測(cè)量腫瘤細(xì)胞中RAS通路的活性。因此，作者將已建立的特征映射到CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中的肺癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)，以確定哪些特征能夠準(zhǔn)確測(cè)量并排除樣本中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞致癌RAS活性。首先，作者通過(guò)去除細(xì)胞系中低表達(dá)或表達(dá)差異較小的基因來(lái)清除特征。為了進(jìn)行準(zhǔn)確分析，作者去除了KRAS以外（BRAF、EGFR、ERBB2、FGFR1、FGFR2、FGFR 3、HRAS、JAK2、KIT、NRAS和RET）具有致癌RAS通路突變的細(xì)胞系，因?yàn)檫@些突變可能也會(huì)驅(qū)動(dòng)RAS信號(hào)傳導(dǎo)并混淆分析。對(duì)于每個(gè)特征，將過(guò)濾后的CCLE肺癌細(xì)胞系特征表達(dá)矩陣分為三組。作者根據(jù)組內(nèi)特征基因的平均表達(dá)將簇命名為RAS-high和RAS-low以及Unclassified。隨后，作者使用KRAS突變?cè)赗AS-high和RAS-low組中的分布來(lái)評(píng)估RAS84捕獲RAS致癌活性的能力（圖1a）。為了強(qiáng)調(diào)檢測(cè)RAS致癌活性特征的特異性，作者還評(píng)估了RAS addiction signature和其他幾種致癌信號(hào)通路特征。RAS addiction signature來(lái)自依賴(lài)RAS信號(hào)維持細(xì)胞存活的KRAS突變細(xì)胞系。因此，這一特征更能代表RAS依賴(lài)性，而不是RAS致癌活性。作者確定“RAS pathway”、“KRASG13D134”和“HRAS”是RAS-high組中KRAS突變體富集的最佳體現(xiàn)（圖1a）。隨后，作者通過(guò)選擇驅(qū)動(dòng)RAS-high和RAS-low聚類(lèi)的基因來(lái)完善這三個(gè)特征。作者對(duì)這些組進(jìn)行了差異基因分析，以確定RAS-high組中上調(diào)的特征基因。從這些基因中，作者構(gòu)建了meta-RAS活性特征RAS84，并將其與CCLE肺癌細(xì)胞系數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比測(cè)試（圖1b）。RAS84成功地將42株KRAS突變株系中的36株放入RAS-high組，6株放入U(xiǎn)nclassified組（圖1c）。作者還觀察到“RAS pathway”和RAS84分類(lèi)之間的樣本標(biāo)記有很好的重疊，并且與其他特征相比有一些差異。然而，與其他RAS和致癌特征相比，RAS84從RAS-low組中分離出的KRAS突變細(xì)胞系在統(tǒng)計(jì)學(xué)上最顯著可靠（圖1d）。最后，作者進(jìn)行了差異分析，以確定RAS-high組的轉(zhuǎn)錄組變化，并發(fā)現(xiàn)RAS-high組在ERK1/ERK2/MAPK級(jí)聯(lián)通路中富集。
2. RAS84表達(dá)預(yù)測(cè)體外藥物敏感性和耐藥性
接下來(lái)，為了確定RAS84表達(dá)是否與抗癌藥物反應(yīng)相關(guān)，作者分析了從GDSC和CTRP數(shù)據(jù)庫(kù)下載的藥物敏感性數(shù)據(jù)，研究對(duì)象為RAS-high和RAS-low CCLE細(xì)胞系。作者確定了在這兩組中這些藥物具有不同的藥物反應(yīng)（圖2a）。
作者在表現(xiàn)出不同反應(yīng)的藥物中測(cè)試了富集的藥物靶項(xiàng)（圖2b）。并發(fā)現(xiàn)RAS-high細(xì)胞系對(duì)靶向ERK MAPK和EGFR信號(hào)的藥物敏感，也對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和降解藥物敏感，如HSP90抑制劑。相反，作者發(fā)現(xiàn)RAS-high細(xì)胞系對(duì)靶向DNA復(fù)制、有絲分裂和染色質(zhì)組蛋白乙?；乃幬锞哂心退幮浴NA復(fù)制和有絲分裂是常見(jiàn)的化療靶點(diǎn)，表明RAS84活性與體外化療耐藥相關(guān)。
隨后，作者還測(cè)試了KRAS突變（圖2c）和RAS通路突變依賴(lài)性藥物反應(yīng)（圖2d）。并發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變組僅對(duì)三種靶向ERK/MAPK信號(hào)的藥物敏感。在這些比較中，沒(méi)有觀察到對(duì)任何藥物的耐藥性。這一結(jié)果表明，RAS84比單獨(dú)存在KRAS突變或更廣泛的RAS通路突變體更好地捕捉RAS驅(qū)動(dòng)的藥物反應(yīng)，突顯了RAS84轉(zhuǎn)錄特征方法的重要性。
3. 肺腺癌中RAS84表達(dá)與KRAS突變相關(guān)
為了進(jìn)一步驗(yàn)證RAS84不僅僅局限于細(xì)胞系層面，作者將其應(yīng)用于TCGA LUAD表達(dá)數(shù)據(jù)?？紤]到與細(xì)胞系數(shù)據(jù)相比，患者腫瘤樣本中觀察到的特征表達(dá)的異質(zhì)性增加，因此將樣本分為五組（圖3a），發(fā)現(xiàn)RAS84表達(dá)最低組中具有很少的KRAS突變（6%）. 其他分組中均具有較高水平的KRAS突變，介于25%和45%之間（圖3b）。隨后，作者使用上述各種特征對(duì)患者進(jìn)行重新分組，發(fā)現(xiàn)RAS84在各組中對(duì)KRAS突變腫瘤進(jìn)行了最佳分離（圖3c）。作者通過(guò)RAS84基因特征的平均表達(dá)水平，從低到高分別標(biāo)記為RAG-0、RAG-1、RAG-2、RAG-3和RAG-4。為了確保RAS84表達(dá)主要是由腫瘤驅(qū)動(dòng)的，作者觀察了五個(gè)NSCLC樣本的基質(zhì)中RAS84的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)基質(zhì)中表達(dá)量最小。隨后，給每個(gè)患者分配了一個(gè)RAS84-Index（RI）值，定義為RAS84的平均表達(dá)基因。為了進(jìn)一步描述這些群體的特征，測(cè)試了是否有任何其他報(bào)道的基因組改變?cè)谖鍌€(gè)亞型中表現(xiàn)出非隨機(jī)分布。作者確定了富集于一個(gè)或多個(gè)RAG組中的八個(gè)常見(jiàn)突變（圖3d），并使用這些亞型相關(guān)突變來(lái)表征五個(gè)RAG組的特征（圖3a）。KRAS極少突變是RAG-0的特征，但有趣的是，該組包含大量腫瘤抑制突變體（KEAP1、RB1和TP53）以及CTNNB1突變體，這也可以解釋腫瘤是如何發(fā)生的。由于p53的高水平改變（約70%），將其稱(chēng)為P腫瘤。RAG-2和RAG-3中，除了頻繁的KRAS突變外，也具有許多EGFR突變，表明驅(qū)動(dòng)這些簇的基因通過(guò)上游受體酪氨酸激酶（RTK）激活誘導(dǎo)RAS通路激活。然而，除了高KRAS突變率和高RAS84表達(dá)外，RAG-1以STK11/LKB1突變?yōu)橹饕卣鳎↘L腫瘤），RAG-4的特征是CDKN2A突變（KC腫瘤）。TP53在幾個(gè)簇中經(jīng)常改變，RAG-3在RAG-0之后p53突變率最高（KP腫瘤）。而RAG-2與其他RAS活性簇相比，p53（TP53）改變水平適中（約40%），CTNNB1突變更多，但仍?xún)H約5%，稱(chēng)之為K腫瘤。
隨后在87名患者的獨(dú)立肺腺癌隊(duì)列（GSE40419）中驗(yàn)證了RAG中KRAS、EGFR和TP53突變的模式（圖3e）。但考慮到該隊(duì)列較小，不可能以穩(wěn)健的方式將所有特征的患者進(jìn)行聚類(lèi)，并沒(méi)有觀察到特定的KRAS氨基酸突變與RAG組之間的顯著關(guān)聯(lián)，這可能暗示在肺腺癌的情況下，特定的突變不會(huì)以不同的方式驅(qū)動(dòng)RAS活性異質(zhì)性（圖3b）。
為了確定RAS84表達(dá)是否反映RAS-MAPK信號(hào)活性，作者觀察了每個(gè)RAG內(nèi)ERK1/2（T202，Y204）和MEK1（S217，S221）的磷酸化水平。對(duì)349名TCGA-LUAD患者的TCPA RPPA數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)在所有的RAG中，相較于RAG-0其他RAG ERK1/2和MEK1的磷酸化水平都有所增加（圖3f）。作者還研究了哪些RAS84基因主要驅(qū)動(dòng)RAG活性。作者重點(diǎn)研究了各個(gè)簇間變異最大的基因，并通過(guò)相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)了七個(gè)能夠區(qū)分五個(gè)RAG的小基因簇（圖3g）。
4. RAS84表達(dá)主要是克隆性的
為了評(píng)估肺腺癌中RAS活性的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，作者將來(lái)自多區(qū)域TRACERx隊(duì)列的樣本（41例患者）分為五個(gè)RAS活性組，使用TCGA-LUAD分類(lèi)結(jié)果訓(xùn)練支持向量機(jī)（SVM）分類(lèi)器，并把TRACERx樣本按照RAG標(biāo)簽歸類(lèi)（圖4a）。
在41例患者中，28例（68%）有多區(qū)域RNA序列基因表達(dá)數(shù)據(jù)可用。在這28名患者中，16名（57%）患者的所有區(qū)域均位于同一RAG內(nèi)（圖4a）。12名（43%）患者的區(qū)域跨越RAG，表明某些患者存在一定程度的RAS活性異質(zhì)性。在這12名患者中，有9名患者的腫瘤區(qū)域的RAG是相鄰的（RAG-4/3:4；RAG-3/2:1；RAG-2/1:1；RAG-1/0:3）。其余三名患者（CRUK0017、CRUK0024和CRUK0060）跨越兩個(gè)以上相鄰的RAG，表明整個(gè)腫瘤的RAS活性存在一定程度的相關(guān)性和異質(zhì)性。CRUK0017跨越三個(gè)簇，RAG-3/2/0。據(jù)TRACERx報(bào)告，該患者為KRAS突變的亞克隆（PhyloCCF R1:0；R2:0.84；R4:0.65）。有趣的是，KRAS非突變區(qū)域?qū)儆赗AG-0?；颊逤RUK0024和CRUK0060都有兩個(gè)非相鄰的簇，即RAG-3/1。此外，作者還觀察到，與腫瘤間距離分布相比，這些跨越腫瘤的組內(nèi)RAS84的腫瘤內(nèi)距離仍然很?。▓D4b）。
隨后，作者在TRACERx肺腺癌隊(duì)列中發(fā)現(xiàn)，RAS84基因在腫瘤內(nèi)表達(dá)差異小和腫瘤間表達(dá)差異大組中富集（圖4c）。說(shuō)明RAS84在遇到樣本偏差時(shí)仍具有較強(qiáng)的魯棒性。
5. RAS84預(yù)測(cè)肺腺癌患者的生存率和化療反應(yīng)
突變的KRAS癌基因在許多臨床前模型中促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，但KRAS的突變狀態(tài)與患者生存率并沒(méi)有顯著的相關(guān)性（圖5a）。為了確定RAS84在肺腺癌中是否具有預(yù)后價(jià)值，作者進(jìn)行了單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，發(fā)現(xiàn)與RAG-0相比，RAG-4與不良預(yù)后相關(guān)（圖5b，c）。隨后，作者還將RAS84 RAS-Index（RI）值進(jìn)行單因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，并發(fā)現(xiàn)與預(yù)后顯著正相關(guān)，表明RAS84表達(dá)增加是總體生存率差的預(yù)測(cè)因子（圖5d）。隨后，作者還對(duì)RAG進(jìn)行多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析，模型中除了RI值包括TNM分期、性別和年齡等，并且發(fā)現(xiàn)RAG是預(yù)后的重要預(yù)測(cè)因子，特別是RAG-4、RAG-3和RI與不良預(yù)后顯著相關(guān)（圖5e-h）。
此外，與已經(jīng)發(fā)表的特征比較發(fā)現(xiàn)在校正其他預(yù)后預(yù)測(cè)因子的多變量分析中，只有RAS84顯著預(yù)測(cè)預(yù)后（圖5i）。這表明RAS84在早期肺腺癌中具有超出已知臨床預(yù)測(cè)因子的預(yù)后質(zhì)量，并進(jìn)一步表明RAS通路活性促進(jìn)了人肺腺癌的腫瘤進(jìn)展。
鑒于在體外觀察到化療耐藥表型，作者使用TEMPUS腺癌患者隊(duì)列進(jìn)行了PFS多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析。作者選擇接受一線化療的患者，并使用相關(guān)的RNA-seq數(shù)據(jù)和SVM分類(lèi)器對(duì)患者腫瘤進(jìn)行分類(lèi)。發(fā)現(xiàn)RAG是化療后PFS的顯著預(yù)測(cè)因子。簡(jiǎn)而言之，與RAG-2相比，RAG-3和RAG-4患者的PFS較差（圖5j）。最后，與其他已發(fā)表的RAS特征對(duì)進(jìn)行對(duì)比也發(fā)現(xiàn)RAG-3以及RAG-4具有比較高的風(fēng)險(xiǎn)（圖5k）。
6. RAS84預(yù)測(cè)不同癌癥類(lèi)型的RAS-MAPK通路活性
RAS活性在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中的重要程度因不同組織而異，已知一些癌癥主要由RAS突變驅(qū)動(dòng)（例如胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌），而其他癌癥則不是（例如葡萄膜黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腎癌）。為了確定RAS84如何確定RAS活性在不同癌癥類(lèi)型中的差異，作者在泛癌分析中對(duì)所有32種TCGA實(shí)體腫瘤進(jìn)行了量化。為了比較不同癌癥的樣本，計(jì)算了每個(gè)樣本的RI值（圖6a）。根據(jù)每個(gè)癌癥的平均RI值分布確定了兩個(gè)不同的癌癥人群（圖6b）。在RAS高度活躍組中，發(fā)現(xiàn)已知RAS驅(qū)動(dòng)的前五種RAS突變癌癥中的四種（胰腺癌（PAAD）71%，結(jié)腸腺癌（COAD）50%，直腸腺癌（READ）49%和肺腺癌（LUAD）31%）。作者還發(fā)現(xiàn)KRAS突變主要富集在該組中。在高RI組中發(fā)現(xiàn)的其他癌癥包括胃腺癌（STAD）（8.9%）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）（8.3%）、頭頸部鱗癌（HNSC）（5.8%）、宮頸鱗癌和宮頸腺癌（5.2%）、肺鱗癌（3.5%）和食管癌（1.2%）。為了解釋高RAS活性組中存在這些癌癥，作者研究了RAS通路改變狀態(tài)與隊(duì)列中平均RI之間的相關(guān)性（圖6c）。胃癌（STAD）、膀胱癌（BLCA）、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSC）、食管癌（ESCA）和肺鱗狀細(xì)胞瘤（LUSC）的RAS通路改變率均高于50%，均在99%的置信區(qū)間內(nèi)，表明RAS以外的RAS途徑改變是這些癌癥的驅(qū)動(dòng)因素。
皮膚黑色素瘤（SKCM）和甲狀腺癌（THCA）的平均RIs低于其RAS通路改變率的預(yù)測(cè)值（圖6c）。有趣的是，NRAS是這兩種癌癥中RAS的主要突變亞型。然而，RAS突變與SKCM中的RI不相關(guān)，卻在THCA中顯示出顯著的負(fù)相關(guān)（圖6d），表明突變的RAS不是這些癌癥中RAS通路活性的主要驅(qū)動(dòng)因素。有趣的是，THCA和SKCM的BRAF突變比例最高（57%和50%），其次是結(jié)腸（10%）。并且發(fā)現(xiàn)BRAF突變與高RI值顯著相關(guān)（圖6e）表明BRAF是這兩種癌癥中致癌RAS通路活性的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證RAS84表達(dá)可以預(yù)測(cè)單個(gè)癌癥中RAS突變體的高RAS活性，觀察了每個(gè)隊(duì)列RI值與RAS突變（KRAS、NRAS、HRAS）的關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)PAAD、LUAD、HNSC、THYM、BRCA、UCS等中RAS突變與RI之間存在顯著正相關(guān)（圖6d），進(jìn)一步強(qiáng)化了RAS84可以預(yù)測(cè)這些癌癥中RAS活性的觀點(diǎn)。對(duì)于THCA和TGCT這兩種癌癥，觀察到RAS突變與RI呈負(fù)相關(guān)。如前所述，THCA具有較高的BRAF突變水平，有一些NRAS突變，但很少有KRAS突變。TGCT的特點(diǎn)是KRAS（8%）和NRAS（3%）突變水平低。RAS野生型組中較高的RI活性表明，這些樣本中可能存在RAS信號(hào)的強(qiáng)烈激活物，例如自分泌生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，或突變數(shù)據(jù)中不明顯的突變體中的負(fù)反饋環(huán)。
為了確定RAS84在除LUAD以外的其他癌癥中是否具有預(yù)后作用，作者對(duì)RAS高度活躍癌癥組中的隊(duì)列進(jìn)行了總體生存率與RI值的Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，并且確定了PAAD與CESC中RAS84表達(dá)與預(yù)后的顯著相關(guān)性（圖6f，g）。
三、總結(jié)
這篇文章開(kāi)發(fā)了一種新的基因特征RAS84，可以很好地用于捕獲肺腺癌中的RAS通路致癌活性。使用RAS84特征不僅可以很好地將肺腺癌患者進(jìn)行分層還可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后以及化療反應(yīng)。相較于其他特征構(gòu)建文章，該研究首先以體外細(xì)胞系特征構(gòu)建為切入點(diǎn)，后結(jié)合不同中心的肺腺癌研究隊(duì)列進(jìn)行特征驗(yàn)證，區(qū)分腫瘤亞型，進(jìn)行細(xì)致的解析刻畫(huà)，是有助于臨床決策的。因此，小編認(rèn)為這種分析方式和角度是很值得嘗試的?。?！
