今天小編給大家介紹一篇這個(gè)月剛發(fā)在Nature communication[IF:14.913]上的文章——利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)研究?jī)和窠?jīng)母細(xì)胞瘤的高低風(fēng)險(xiǎn)組的細(xì)胞差異。作者的研究表明，低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤有不同的細(xì)胞身份，代表兩種疾病實(shí)體。讓我們一起來(lái)看一下整體的研究思路吧！
Single-nuclei transcriptomes from human adrenal gland reveal distinct cellular identities of low and high-risk neuroblastoma tumors
一、研究背景：
神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種起源于腎上腺交感細(xì)胞系的兒童癌癥。這種惡性腫瘤占兒童癌癥病例的8 - 10%，占全世界兒童腫瘤死亡病例的15%。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床結(jié)局是異質(zhì)性的，它可能會(huì)朝向死亡進(jìn)展，但也有可能會(huì)自我消散。
年齡是神經(jīng)母細(xì)胞瘤最主要的風(fēng)險(xiǎn)因素，診斷時(shí)小于18個(gè)月的小孩往往具有更好的預(yù)后。然而，為什么診斷時(shí)患者的年齡是風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后最有力的預(yù)測(cè)因素？這一原因目前還不清楚。此前，有報(bào)道稱，小鼠中形成腎上腺髓質(zhì)的嗜鉻細(xì)胞大多數(shù)來(lái)自胚胎神經(jīng)嵴后代，特別是來(lái)自多能Schwann細(xì)胞前體。
二、數(shù)據(jù)和代碼
數(shù)據(jù)：
- 不同風(fēng)險(xiǎn)組的11個(gè)不同年齡的神經(jīng)母細(xì)胞瘤樣本（0-79個(gè)月）的數(shù)據(jù)
- 3個(gè)人類的健康腎上腺的數(shù)據(jù)
- 5個(gè)健康小鼠腎上腺的數(shù)據(jù)
代碼：https://github.com/oscarcbr/nc_nb_2021
三、研究結(jié)果
一)、出生后的人類和小鼠腎上腺細(xì)胞群相同，但在嗜鉻細(xì)胞上表現(xiàn)出差異
- 對(duì)來(lái)自三個(gè)不同患者的1536個(gè)人類腎上腺細(xì)胞、來(lái)自5個(gè)不同小鼠樣本的1920個(gè)腎上腺細(xì)胞進(jìn)行了單核Smart-seq2測(cè)序，選擇高質(zhì)量的細(xì)胞【人類：n = 1322；小鼠：n = 1763】。
- 用PAGODA 進(jìn)一步加工。通過(guò)來(lái)自文獻(xiàn)的多個(gè)特定marker鑒定人類和小鼠腎上腺細(xì)胞cluster的身份。在人類中，hC4被鑒定為嗜鉻細(xì)胞簇。在小鼠中，mC11和mC15被鑒定為嗜鉻細(xì)胞(Fig.1a；1b)。
- 通過(guò)比較人類和小鼠的特異性基因標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記相似，但兩種不同的嗜鉻細(xì)胞只能在小鼠中分化。其中，小鼠嗜鉻細(xì)胞群mC15與人類嗜鉻細(xì)胞群hC4共享一個(gè)更重要的特定基因marker(Fig.1c；1d)。
- 與小鼠的嗜鉻細(xì)胞相比，人類出生后嗜鉻細(xì)胞(hC4)表現(xiàn)出交感細(xì)胞標(biāo)記物PRPH的顯著表達(dá)(Fig.2a)。
Fig.1 單核/細(xì)胞分析揭示了人類和小鼠腎上腺(AG)的解剖學(xué)
二)、人出生后腎上腺膽堿能祖細(xì)胞群的鑒定
- 作者發(fā)現(xiàn)了一種人類出生后腎上腺特有的細(xì)胞群(hC1)，顯著表達(dá)各種祖細(xì)胞和遷移marker。并且呈現(xiàn)增殖性質(zhì)。利用偽時(shí)間進(jìn)行的RNA速率估計(jì)表明，這類細(xì)胞群體(hC1)是嗜鉻細(xì)胞(hC4)的主要來(lái)源(Fig.1e-h)。
- 為了驗(yàn)證人膽堿能祖細(xì)胞(hC1)的表達(dá)和空間背景，作者對(duì)0- 4歲兒童和成人的出生后腎上腺進(jìn)行了一系列RNAscope原位雜交(Fig.2b-e)。
- 作者首先闡明了髓質(zhì)(TH)、皮質(zhì)(CYP11B2)和包膜(RSPO3)各部分腺體的解剖結(jié)構(gòu)。為了識(shí)別屬于hC1祖細(xì)胞群的細(xì)胞，檢測(cè)了在hC1祖細(xì)胞群中顯著上調(diào)的標(biāo)記:NTRK2和CLDN11(Fig.2b-d)。
- 將膽堿能煙堿受體CHRNA7(即nAChR α7)與TH和CLDN11進(jìn)行了原位rna雜交。證實(shí)CLDN11+細(xì)胞具有膽堿能性質(zhì)(Fig.2e)
Fig.2人膽堿能前體(NTRK2+ CLDN11+)和嗜鉻細(xì)胞(TH+)在出生后人腎上腺(AG)中的定位
三)、不同風(fēng)險(xiǎn)組的神經(jīng)母細(xì)胞瘤在細(xì)胞群組成上存在差異
- 對(duì)11個(gè)不同臨床風(fēng)險(xiǎn)組和遺傳亞群的4224個(gè)人類NB細(xì)胞進(jìn)行單核測(cè)序，用PAGODA將高質(zhì)量的細(xì)胞(n = 3212)分成10個(gè)不同的簇(Fig.3a)。
- 不同臨床風(fēng)險(xiǎn)組和階段的神經(jīng)母細(xì)胞瘤樣本包含這些簇的不同細(xì)胞貢獻(xiàn)，反映了這些臨床組的臨床異質(zhì)性(Fig.3b)。
- 根據(jù)每一個(gè)cluster顯著上調(diào)的基因?qū)?0個(gè)亞群進(jìn)行重新聚類，分析各個(gè)亞群的顯著差異的基因(Fig.3c；3d)。
- 利用基于基因富集的方法，NB的去甲腎上腺素能簇(nC5, nC7, nC8和nC9)被證實(shí)與交感去甲腎上腺素能和ADR(即腎上腺素能)轉(zhuǎn)錄特征共享大量上調(diào)基因。與此相反，未分化的聚類nC3共享了大量具有神經(jīng)嵴細(xì)胞樣特征和MES(即間充質(zhì))特征的上調(diào)基因(Fig.3e)。
- 此外，每個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤簇的特定基因標(biāo)記與最近報(bào)道的8個(gè)GOSH 隊(duì)列腫瘤中6個(gè)細(xì)胞簇的標(biāo)記進(jìn)行了比較(Fig.3g)。
- 為了區(qū)分惡性和間質(zhì)細(xì)胞簇，進(jìn)行了基因組重排分析，并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(Fig.3h-3i)。
Fig.3兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的瘤內(nèi)異質(zhì)性
接下來(lái)，我們驗(yàn)證了神經(jīng)母細(xì)胞瘤簇中顯著富集的標(biāo)記物的表達(dá)(Fig.4)。RNAscope原位雜交在一例MYCN擴(kuò)增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤病例中，經(jīng)比較基因組雜交(CGH)20獨(dú)立證實(shí)，顯示TH、MYCN和ALK表達(dá)在腫瘤內(nèi)具有高度異質(zhì)性，腫瘤區(qū)域MYCN和ALK染色強(qiáng)烈，TH陰性。其他腫瘤區(qū)域顯示少量TH+陽(yáng)性、細(xì)胞核增大的細(xì)胞彌漫性染色，MYCN陽(yáng)性，ALK陰性，而其他區(qū)域不顯示TH、MYCN、ALK表達(dá)。此外，我們驗(yàn)證了間充質(zhì)標(biāo)記物PDGFRA的表達(dá)，該標(biāo)記物在高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤簇中顯著高表達(dá)。
Fig.4 RNA原位雜交驗(yàn)證高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤4期的瘤內(nèi)異質(zhì)性
四)、高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤中富集的細(xì)胞群類似于人類出生后的腎上腺祖細(xì)胞群
高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤通常發(fā)生于年齡大于18個(gè)月的兒童，通常起源于腎上腺。為了了解在高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)病例中觀察到的神經(jīng)母細(xì)胞瘤群體與正常的出生后和胚胎腎上腺組織之間的關(guān)系，我們對(duì)它們的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了對(duì)比分析(Fig5；6；7)。
- 在低危神經(jīng)母細(xì)胞瘤病例中，腎上腺素能標(biāo)記物的顯著表達(dá)在健康交感腎上腺細(xì)胞和腫瘤NOR人群中很常見(jiàn)（Fig.5a）。
- 與這一觀察結(jié)果一致的是，神經(jīng)母細(xì)胞瘤NOR簇的特定基因標(biāo)記與小鼠胚胎和人類的嗜鉻細(xì)胞和交感細(xì)胞簇以及人類和小鼠出生后的嗜鉻細(xì)胞簇顯著共享。
- 與神經(jīng)母細(xì)胞瘤NOR細(xì)胞相比，未分化的神經(jīng)母細(xì)胞瘤簇(nC3, nC2)與小鼠胚胎和出生后的交感細(xì)胞或嗜色細(xì)胞群體沒(méi)有共同的特定基因特征(Fig.5b-e)。
Fig.5來(lái)自神經(jīng)母細(xì)胞瘤的細(xì)胞簇與出生后健康的人和小鼠腎上腺具有相同的表達(dá)特征
- 為了支持這些發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)母細(xì)胞瘤NOR簇在小鼠和人類發(fā)育中的腎上腺中橋細(xì)胞、交感細(xì)胞和嗜鉻細(xì)胞，以及人類出生后嗜鉻細(xì)胞中表現(xiàn)出較高的marker 得分。tSNE顯示了人類出生后(Fig.6a)、胚胎腎上腺(Fig.6b)和小鼠胚胎腎上腺原細(xì)胞簇(Fig.6c)的特征基因評(píng)分。
- 對(duì)498例具有低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)特征基因表達(dá)的SEQC神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者進(jìn)行生存分析，KM曲線顯示，神經(jīng)母細(xì)胞瘤有顯著的差異（Fig.6h）。
- 在更大的隊(duì)列中，我們進(jìn)一步詳細(xì)分析了不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤簇的轉(zhuǎn)錄譜與生存率和診斷年齡之間的關(guān)系。分別比較了498例患者的風(fēng)險(xiǎn)組的差異表達(dá)（Fig.6e）、與診斷年齡顯著相關(guān)（Fig.6f）、與生存結(jié)果差異表達(dá)（Fig.6g）
- 條形圖展示了與nC9和nC3相關(guān)的特征基因與診斷時(shí)的年齡顯著相關(guān)，而與高生存率相關(guān)的特征基因則與年齡呈負(fù)相關(guān)(Fig.6h)。
Fig.6 來(lái)自神經(jīng)母細(xì)胞瘤和發(fā)展中的人類和小鼠腎上腺的細(xì)胞簇具有不同的表達(dá)特征，它們的表達(dá)與患者的生存和診斷年齡相關(guān)
- 作者進(jìn)一步研究了人類出生后腎上腺和神經(jīng)母細(xì)胞瘤簇的共性，并基于相互最近鄰匹配檢測(cè)進(jìn)行了對(duì)比分析，將來(lái)自人類腎上腺的細(xì)胞狀態(tài)投射到神經(jīng)母細(xì)胞瘤數(shù)據(jù)上（Fig7.ab）。
- 此外，作者還研究了胚胎小鼠腎上腺原、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和健康人類出生后腎上腺細(xì)胞群之間的關(guān)系。對(duì)所有群體(不包括皮層和免疫細(xì)胞)的轉(zhuǎn)錄相似性進(jìn)行了基于歐氏距離的分析(Fig7.cd)。該分析表明，這些細(xì)胞可以分為四組，即(1)腎上腺素能細(xì)胞，(2)未分化細(xì)胞，(3)間充質(zhì)細(xì)胞和(4)內(nèi)皮細(xì)胞
Fig.7 出生后和發(fā)育中的人類和小鼠腎上腺和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞群轉(zhuǎn)錄譜的共性
四、結(jié)果與展望
為了解神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床異質(zhì)性的轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ)，作者分析了來(lái)自不同風(fēng)險(xiǎn)組的11個(gè)腫瘤患者的3212個(gè)高質(zhì)量單細(xì)胞/核。并將它們與3456個(gè)人類和小鼠胚胎和出生后AG細(xì)胞進(jìn)行比較。在出生后的腎上腺中，嗜鉻細(xì)胞的再生方式仍是未知的。在這項(xiàng)研究中，作者鑒定了一群出生后人類腎上腺特有的細(xì)胞，這些細(xì)胞具有嗜鉻細(xì)胞的前體特征，通過(guò)計(jì)算RNA速度確定了祖細(xì)胞向嗜鉻細(xì)胞轉(zhuǎn)變的方向性。RNAscope ISH驗(yàn)證了它們的存在，并提示這一群體隨著年齡的增長(zhǎng)而下降。高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)細(xì)胞簇(nC3)有一個(gè)轉(zhuǎn)錄程序，隨著診斷年齡的改變而改變，并與患者較低的生存幾率相關(guān)。
因此，診斷時(shí)的年齡是一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)結(jié)果。這給我們今后的單細(xì)胞分析結(jié)合臨床特征提供了一個(gè)很好的思路——腫瘤的臨床異質(zhì)性可能是在單細(xì)胞層面具有不同的細(xì)胞身份，代表不同的疾病實(shí)體。
