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2023年新鮮出爐的可變剪切科研idea, 還不碼上！
都23年了還不會(huì)可變剪切？趕緊學(xué)起來(lái)
可變剪切時(shí)隔三年又出新思路？
提起可變剪切，公眾號(hào)的粉絲們可能不會(huì)太陌生。19年的時(shí)候還給大家總結(jié)了可變剪切的一系列發(fā)文（點(diǎn)擊查看原文：跪了，乳頭狀甲狀腺可變剪切又發(fā)了5+），這些文章都是基于剪切百分比值（PSI）做的研究。與之前研究可變剪切思路不同，今天的思路是從兩個(gè)與可變剪切息息相關(guān)的基因家族出發(fā) ：異質(zhì)核核糖核蛋白（hnRNP）家族、富含絲氨酸/精氨酸 (SR) 剪接因子家族（鏈接到：what，幾乎所有的腫瘤研究熱點(diǎn)都跟它有關(guān)）。
首先給大家科普下相關(guān)知識(shí)：
可變剪接（AS）
也叫選擇性剪接，廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)，AS從共同的基因產(chǎn)生多種不同RNA轉(zhuǎn)錄本以及結(jié)構(gòu)相似的蛋白亞型，是遺傳物質(zhì)多樣化表達(dá)的代表方式。AS在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。對(duì)比正常組織，腫瘤樣本存在廣泛的AS事件。異常的AS體可通過(guò)抑制凋亡、促進(jìn)耐藥、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)、推進(jìn)細(xì)胞周期循環(huán)等多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
異質(zhì)核核糖核蛋白（hnRNP）家族
是高等真核生物中含量最豐富的核蛋白，是一類(lèi)RNA結(jié)合蛋白。HnRNPA/B亞家族是hnRNPs的核心成員，與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。研究表明HnRNPA/B在多種腫瘤中高度表達(dá)，被確定為一種有前途的癌癥生物標(biāo)志物。HnRNPA/B促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的各種生物學(xué)過(guò)程，包括增殖，遷移和侵襲。
hnRNPA2/B1 在癌癥中的代表性分子機(jī)制
富含絲氨酸/精氨酸 (SR) 剪接因子家族
SRs的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生之間的關(guān)系主要是由于關(guān)鍵基因的可變剪接模式改變決定的。SRs的異常表達(dá)常導(dǎo)致上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移和血管生成等癌相關(guān)過(guò)程的改變。SR蛋白在癌細(xì)胞擴(kuò)增，凋亡等過(guò)程中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。
SRs與癌癥發(fā)生發(fā)展
可變剪切新思路
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那么接下來(lái)我們就看來(lái)看研究是如何展開(kāi)分析的（Journal of Translational Medicine；IF：8.440）
研究對(duì)象
急性白血病（AML）中異質(zhì)核核糖核蛋白家族（hnRNPs）、富含絲氨酸/精氨酸 剪接因子家族（SRs）的32個(gè)可變剪切因子
數(shù)據(jù)隊(duì)列
訓(xùn)練集：TCGA-LAML、GTEx
驗(yàn)證集：GSE14468, GSE37642-GPL96, GSE37642- GPL570, GSE71014
主要結(jié)果
hnRNP和SR家族的32個(gè)可變剪切因子（SF）遺傳編譯景觀(guān)
1、大部分SFs（27）在AML和normal樣本間存在異常表達(dá)（熱圖A）
2、32個(gè)SFs呈現(xiàn)低的突變頻率（突變瀑布圖B）
3、32個(gè)SFs的拷貝數(shù)變異頻率展示，eg.HNRNPU拷貝數(shù)擴(kuò)增表達(dá)增加（棒棒糖圖C）
4、32個(gè)SFs的染色體物理位置展示（圈圖D）
受hnRNP和SR家族的32個(gè)可變剪切因子介導(dǎo)的剪切調(diào)控模式
1、為了更好的識(shí)別SFs與AML生物學(xué)過(guò)程的關(guān)聯(lián)，使用SFs對(duì)AML樣本進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)，將AML分成了4個(gè)亞型（consensus matrix 熱圖A；驗(yàn)證SFs的聚類(lèi)結(jié)果t-SNE散點(diǎn)圖B）
2、4個(gè)不同的AML可變剪切亞型間SFs的表達(dá)差異，cluster-A的SFs表達(dá)普遍較低（熱圖C）
3、4個(gè)不同的AML可變剪切亞型間生存差異，cluster-D類(lèi)預(yù)后最好，cluster-C則相反（K-M曲線(xiàn)圖D）
4、每個(gè)SF在AML不同可變剪切亞型間表達(dá)也呈現(xiàn)出顯著差異（箱線(xiàn)圖E）
5、4個(gè)不同的AML可變剪切亞型間的突變差異，B組的突變頻率更高現(xiàn)（突變瀑布圖E）
不同AML剪切調(diào)控模式的生物學(xué)特征差異
1、4個(gè)不同AML可變剪切亞型間KEGG信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)hallmark 基因集GSVA分析，eg.cluster-A有更高的免疫反應(yīng)富集,不同的剪切模式在生物學(xué)過(guò)程、免疫學(xué)特性、臨床病理因素等方面存在明顯差異（聚類(lèi)熱圖A、B）
2、4個(gè)不同的AML可變剪切亞型間可變剪切事件（AS）差異，與其它亞型相比cluster-A差異的AS最多（韋恩圖C；熱圖D）
3、cluster-A可變剪切亞型AS事件主要為AP（可變啟動(dòng)子）和AT（可變終止子）（upset圖E）
4、對(duì)于cluster-A中的 AS事件對(duì)應(yīng)的209個(gè)基因進(jìn)行了KEGG通路富集分析，主要與RNA轉(zhuǎn)運(yùn)等通路相關(guān)（和弦圖F）
不同AML剪切調(diào)控模式的免疫相關(guān)特征差異及潛在用藥預(yù)測(cè)
通路富集分析表明不同剪接調(diào)控模式免疫相關(guān)通路存在顯著差異。因此，進(jìn)一步分析了模式之間的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、免疫功能活性和免疫檢查點(diǎn)表達(dá)差異
1、發(fā)現(xiàn)cluster-C富集了更多的炎性免疫細(xì)胞eg.M2巨噬細(xì)胞，CD8 + T細(xì)胞則最低（箱線(xiàn)圖A）
2、cluster-A呈現(xiàn)了更高的抗原呈遞細(xì)胞共刺激分子(APC)等免疫功能特征（箱線(xiàn)圖B）
3、免疫檢查點(diǎn)差異表達(dá)分析顯示，cluster-A中HAVCR2等表達(dá)水平顯著高于其他亞群（箱線(xiàn)圖C）
4、不同剪切調(diào)控模式與AML常用治療藥物的敏感性分析發(fā)現(xiàn)cluster-D對(duì)阿糖胞苷有更高的敏感性（箱線(xiàn)圖D）
5 、不同AML剪切調(diào)控模式中cluster-C對(duì)抗PD-1免疫治療更有效（submap分析熱圖D）
構(gòu)建和驗(yàn)證可變剪切相關(guān)的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型
不同可變剪切模式有不同的病理學(xué)特征和治療方式，cluster-A、B間SFs表達(dá)差異最大，cluster-C、D間預(yù)后差異最大，因此篩選了cluster-A、B 和cluster-C、D分別間的差異基因（與SFs和AML預(yù)后相關(guān)相關(guān)的基因）
1、cluster-A、B 和cluster-C、D差異基因交集，被認(rèn)為是與SFs和AML預(yù)后相關(guān)相關(guān)的基因（韋恩圖A）
2、基于cox回歸篩選預(yù)后相關(guān)的因子（森林圖B）
3、Lasso回歸分析確定最終構(gòu)建模型因子（lasso系數(shù)路徑圖C；lasso交叉驗(yàn)證曲線(xiàn)D）
4、預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的預(yù)測(cè)效能（K-M曲線(xiàn)圖E；ROC曲線(xiàn)）
5 、單因素和多因素cox回歸確定后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分能作為AML的獨(dú)立預(yù)后因子（森林圖G-H）
6 、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與剪切模式、生存狀態(tài)之間的關(guān)聯(lián)（沖積圖I；箱線(xiàn)圖J）
預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的驗(yàn)證以及構(gòu)建列線(xiàn)圖以預(yù)測(cè)AML的整體生存期
1、基于GEO的四個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列對(duì)可變剪切相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型預(yù)測(cè)效能進(jìn)行了獨(dú)立數(shù)據(jù)集驗(yàn)證（K-M曲線(xiàn)圖A-D；ROC曲線(xiàn)圖E-H）
2、為了更準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)AML的OS，結(jié)合臨床病理特征構(gòu)建了列車(chē)線(xiàn)圖（列線(xiàn)圖I）
3、時(shí)間依賴(lài)的校準(zhǔn)曲線(xiàn)驗(yàn)證列線(xiàn)圖的1，3，5年對(duì)AML的預(yù)測(cè)效能（校準(zhǔn)曲線(xiàn)圖J）
4、列線(xiàn)圖和其它臨床病理特征對(duì)AML的預(yù)測(cè)效能AUC比較，列線(xiàn)圖最高（折線(xiàn)圖K）
可變剪切因子SRSF10 在AML中顯著上調(diào)并且促進(jìn)了AML（實(shí)驗(yàn)）
在32個(gè)SFs中SRSF12和SRSF10在AML中顯著上調(diào)。因?yàn)镾RSF12是預(yù)后保護(hù)因子，因此僅對(duì)危險(xiǎn)因子SRSF10進(jìn)行深入研究，探索與 AML發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。
1、SRSF10在AML和正常樣本間的表達(dá)差異展示（箱線(xiàn)圖A）
2、SRSF10在TCGA泛癌中的表達(dá)差異，在AML中表達(dá)最高，預(yù)示著SRSF10可能參與血液腫瘤發(fā)生和發(fā)展（箱線(xiàn)圖B）
3、PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了SRSF10在AML比正常樣本中顯著高表達(dá)（柱狀圖CD）
4、構(gòu)建SRSF10過(guò)表達(dá)(oeSRSF10)和敲低(shSRSF10)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，PCR和WB實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SRSF10的mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（圖EF）
5、CCK8實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照相比，SRSF10過(guò)表達(dá)組（SRSF10-oe）細(xì)胞的增值能力更高；并且SRSF10敲低組（SRSF10-sh1和、SRSF10-sh2）與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖明顯減少(圖G)
6、EdU染色也顯示SRSF10-oe組細(xì)胞比對(duì)照組細(xì)胞有更多的DNA復(fù)制。然shSRSF10組DNA復(fù)制階段細(xì)胞少于對(duì)照組(圖7H，I)
7、V-FITC/PI 染色標(biāo)記凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SRSF10敲低組（SRSF10-sh1、SRSF10-sh2）細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組(圖J)
8、進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了SRSF10敲低后細(xì)胞周期的變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，SRSF10敲低組（SRSF10-sh1、SRSF10-sh2）細(xì)胞在 G1期的停滯更為明顯(圖K)
小結(jié)：
這篇研究是典型的干濕結(jié)合文章，沒(méi)有大規(guī)模測(cè)序也沒(méi)有很復(fù)雜的生信分析，典型的分型+預(yù)后模型思路，中科院二區(qū)8+期刊收錄
研究?jī)?nèi)容：可變剪切相關(guān)基因家族切入+不同的可變剪切模式功能、免疫學(xué)特征+不同表型不同個(gè)性化用藥治療+預(yù)后
分析結(jié)構(gòu)：分型+預(yù)后模型+實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
寫(xiě)在最后：?jiǎn)为?dú)依靠純生信就能輕易發(fā)文章的紅利時(shí)期已經(jīng)過(guò)去了，在生信分析卷不動(dòng)的時(shí)候，返璞歸真，找準(zhǔn)新穎貼合疾病的切入點(diǎn)+生信分析+簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)成為科研的必經(jīng)之路，畢竟生信分析也只是數(shù)據(jù)分析的手段而已，大量數(shù)據(jù)的深度學(xué)習(xí)訓(xùn)練總需要落地驗(yàn)證才能讓結(jié)果更可信。
可變剪切新思路
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