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輕松上5分!——連接表型和基因型的橋梁“孟德爾隨機(jī)化”
孟德爾隨機(jī)化分析簡介
醫(yī)學(xué)研究中，因果關(guān)聯(lián)推斷旨在對可控的暴露因素與結(jié)局之間的因果關(guān)系進(jìn)行估計(jì)與評價(jià)，從而通過控制或干預(yù)暴露因素的水平改變相應(yīng)結(jié)局。例如特定暴露對于人群發(fā)病的影響效應(yīng)分析、特定藥物或手術(shù)方式作用于疾病的療效評估等。基于因果效應(yīng)的分析與評價(jià)，對于確定疾病病因及干預(yù)方式、控制疾病進(jìn)展或預(yù)后等方面均具有重要的指導(dǎo)意義.
孟德爾隨機(jī)化（MR）是基于全基因組測序數(shù)據(jù)、能有效減少偏倚、類似于RCT研究、用于揭露因果關(guān)系的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。MR可以用于評估因果推斷，以遺傳變異作為工具變量（IVs）來代表特定的暴露，以推斷暴露與結(jié)果之間的因果關(guān)系，將表型對表型的因果研究轉(zhuǎn)化成基因型的研究。優(yōu)勢在于：個(gè)體的遺傳變異先于疾病的結(jié)局，這樣便排除了由于逆向因果問題所帶來的混雜偏倚;現(xiàn)代生物信息技術(shù)對遺傳變異的測量能夠達(dá)到很高的精度，這很大程度上降低了由于測量誤差所帶來的估計(jì)偏倚。
單核苷酸多態(tài)性（SNPs）是MR分析中最常用的一種遺傳變異，主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異（轉(zhuǎn)換和顛換，二者之比為2 :1）所引起的DNA序列多樣性。一般而言,SNP是指變異頻率大于1 %的單核苷酸變異。SNP在人類基因組中的發(fā)生頻率比較高，有些SNP位點(diǎn)還會影響基因的功能，導(dǎo)致生物性狀改變甚至致病，是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據(jù)。因此被廣泛用于群體遺傳學(xué)研究和疾病相關(guān)基因的研究，在藥物基因組學(xué)、診斷學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中起重要作用。
基因座（基因組中特定的位點(diǎn)?；蜃梢允峭暾蚧騿蝹€(gè)核苷酸堿基對）中特定位點(diǎn)的單個(gè)核苷酸堿基已被不同的核苷酸取代，而出現(xiàn)在每個(gè)基因座上的不同可能的核苷酸稱為等位基因（Alleles）。如果一個(gè)基因座中存在多個(gè)不同的等位基因，我們可以將這個(gè)基因座稱為是具有多態(tài)性的。根據(jù)等位基因出現(xiàn)的頻率，可以進(jìn)一步分為主要的等位基因（major alleles）和次要等位基因（minor alleles）。給定SNP的群體中次要等位基因（最小等位基因）的比例稱為“次要等位基因頻率（最小等位基因頻率，MAF）”。MAF常用來作為篩選SNP的條件。
MR模型中，遺傳變異作為工具變量需滿足3個(gè)核心假設(shè)：
關(guān)聯(lián)性性假設(shè)：遺傳變異（Z）與暴露因素（X）之間存在穩(wěn)健的強(qiáng)相關(guān)關(guān)系（γ≠0）。獨(dú)立性假設(shè)：遺傳變異（Z）與影響“暴露因素（X）—結(jié)局（Y）”關(guān)系的混雜因素（U）獨(dú)立（φ1＝0）。排他性假設(shè)：遺傳變異只能通過暴露因素對結(jié)局產(chǎn)生作用，而不能通過其他路徑影響結(jié)局（φ2＝0）。
孟德爾隨機(jī)化分析流程為：
第一步：是找工具變量，作為工具變量的基因都是從別人的研究中挑出來的。所有的基因研究有個(gè)專門的庫叫做genome wide association studies (GWAS)?？梢赃x擇從GWAS原文中獲取、從已經(jīng)發(fā)表的MR文章中獲取、R program提取等方法；挑出來研究和暴露相關(guān)的基因SNPs。
第二步：估計(jì)的工具變量對結(jié)局的作用，工具變量對結(jié)局的作用也是從所有的研究中估計(jì)出來的整體效應(yīng)，這樣可以拒絕單個(gè)研究的偏倚。
第三步：合并多個(gè)SNP的效應(yīng)量，這個(gè)效應(yīng)量是我們得到暴露和結(jié)局因果效應(yīng)的前提。
第四步就是用合并后的數(shù)據(jù)進(jìn)行孟德爾隨機(jī)化分析和相應(yīng)的敏感性分析。
孟德爾隨機(jī)化分析的要求：1）、數(shù)據(jù)必須至少包括5列信息：SNP列；暴露的beta值；暴露的se值；結(jié)局的beta值；結(jié)局的se值。這里的beta值就是SNP對表型（暴露或者結(jié)局）的效應(yīng)量，se是beta值的標(biāo)準(zhǔn)誤（standarderror）。2）必須要保證暴露和結(jié)局的效應(yīng)等位基因（effect allele）一致，將暴露和結(jié)局的SNP等位基因方向協(xié)同，根據(jù)EAF大小，剔除不能判斷方向的palindromic（回型）SNP和incompatible SNP (A/G vs. A/C)；3）檢查是否有SNP與結(jié)局強(qiáng)相關(guān)。
敏感性分析的作用：1）評估結(jié)果是否穩(wěn)健，結(jié)論是否靠譜；2）評估結(jié)果是否有潛在的偏倚（比如基因多效性，數(shù)據(jù)異質(zhì)性）；3）評估是否存在某一個(gè)工具變量嚴(yán)重影響結(jié)局變量；敏感性分析主要用一下三個(gè)方法：1）基因多效性檢驗(yàn)；2）異質(zhì)性檢驗(yàn)；3）“l(fā)eave-one-out”法逐步剔除法，看每剔除一個(gè)SNP后，剩余SNP的效應(yīng)值變化大不大。
由于現(xiàn)有觀察性研究往往止步于相關(guān)性的判斷，無法很好的控制混雜因素和排除由于逆向因果關(guān)系，可能在同一問題上，不同的研究會得到不同結(jié)果，并引發(fā)爭議。MR非常適合在此類問題上做出基于因果效應(yīng)的分析與評價(jià)，對于確定疾病病因及干預(yù)方式、控制疾病進(jìn)展或預(yù)后等方面均有重要意義。
比如今天分享的文章，作者首先發(fā)現(xiàn)端粒長度與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性在臨床研究中存在爭議，且只有其中少數(shù)研究區(qū)分了雌激素受體（ER）不同的表達(dá)狀態(tài)（陽性或陰性）。后作者就此問題設(shè)計(jì)了孟德爾分析（MR），得到因果效應(yīng)關(guān)系。文章于2022/10/21發(fā)表在Frontiers in Oncology（IF 5.7）雜志，題為“Relationship between telomere length and the prognosis of breast cancer based on estrogen receptor status: A Mendelian randomization study”。
作者通過孟德爾隨機(jī)化（MR）分析，將與暴露因子（端粒長度）相關(guān)的遺傳變異作為工具變量（IVs）來評估暴露因子（端粒長度）和具有不同雌激素受體（ER）表達(dá)狀態(tài)的乳腺癌患者的預(yù)后的相關(guān)及因果關(guān)系。由于等位基因是隨機(jī)分配的，因此MR分析可以有效消除混雜因素的影響，并推斷暴露與結(jié)果之間的因果關(guān)系。因ER表達(dá)狀態(tài)有陽性和陰性表達(dá)兩種，作者先通過雙樣本MR分析了端粒長度對乳腺癌患者整體預(yù)后的影響。接下來，再分別評估了端粒長度與ER+和ER-乳腺癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。
背景
乳腺癌是全世界女性最常見的癌癥之一，占女性癌癥死亡率的15%。影響罹患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)和死亡率的危險(xiǎn)因素包括乳腺癌的一級家族史，較早初潮的年齡，較晚的初次生育年齡，較晚的絕經(jīng)年齡，超重或肥胖，口服避孕藥和外源激素的使用等。
雌激素受體（ER）是乳腺癌重要的預(yù)后指標(biāo)，大約70%的乳腺癌可以表達(dá)ER并對激素治療敏感，因而比ER陰性的患者具有更好的預(yù)后。端粒是TTAGGG的串聯(lián)重復(fù)序列，具有防止DNA雙鏈斷裂、染色體融合和降解的功能。在維持DNA結(jié)構(gòu)完整性和調(diào)節(jié)細(xì)胞復(fù)制方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。端粒隨著細(xì)胞分裂周期而縮短，是生物體細(xì)胞衰老的標(biāo)志。因此，端粒已被作為衰老和年齡相關(guān)疾?。ㄈ缧难芗膊。┌Y和糖尿?。┑纳飿?biāo)志物廣泛研究。
端粒長度與乳腺癌發(fā)病率和預(yù)后之間的關(guān)系尚不清楚。一些研究表明端粒長度與乳腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，而另外一些研究得到了不同結(jié)果。此外，只有少數(shù)研究基于ER表達(dá)狀態(tài)研究了端粒長度與乳腺癌發(fā)病率之間的關(guān)系，端粒長度與不同ER表達(dá)狀態(tài)的乳腺癌的預(yù)后的關(guān)系尚未被研究?，F(xiàn)有的研究得到不一樣的結(jié)果，可能是由于現(xiàn)有的觀察性研究不能完全排除反向因果關(guān)系和混雜因子，導(dǎo)致結(jié)論有偏差。孟德爾隨機(jī)化（MR）是一種可以解決這些局限性的方法。
材料和方法
1、數(shù)據(jù)收集
收集與暴露和結(jié)果相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。從MRCIEU GWAS數(shù)據(jù)庫獲得與端粒長度（暴露）相關(guān)的SNP。從乳腺癌協(xié)會聯(lián)盟（BCAC）進(jìn)行的大型薈萃分析數(shù)據(jù)集中收集了與不同狀態(tài)的ER的乳腺癌生存率相關(guān)的SNP。所有數(shù)據(jù)都屬于歐洲人群。
2、工具變量的提取
選擇SNP作為IVs，以評估端粒長度和乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性及因果關(guān)系。根據(jù)以下假設(shè)（1）關(guān)聯(lián)性假設(shè)：遺傳變異必須與暴露強(qiáng)相關(guān)（P<5×10-8）；（2）獨(dú)立性假設(shè)：遺傳變異不能與任何潛在的混雜因素相關(guān)；（3）排他性假設(shè)：遺傳變異僅通過暴露因素影響結(jié)果。
連鎖不平衡（LD）窗口設(shè)置為10000 kb，r2＜0.01，以確保所選遺傳變異的獨(dú)立性。LD指的是不同基因座（loci）的等位基因（allele）之間非隨機(jī)（nonrandom）的關(guān)聯(lián)，使用兩個(gè)參數(shù)r2和kb來衡量。r2：它是0~1之間的數(shù)據(jù)，越小則表示兩個(gè)SNP間是越是完全連鎖平衡的，也即這兩個(gè)SNP的分配是完全隨機(jī)的。kb：指考慮連鎖不平衡的區(qū)域長度，因在遺傳學(xué)上在染色體上距離很近的遺傳位點(diǎn)通常是“捆綁”在一起遺傳給后代的，這也就導(dǎo)致距離很近的位點(diǎn)之間的r2會很大。
根據(jù)PhenoScanner數(shù)據(jù)庫，檢查了這些SNP是否可能違反假設(shè)（2）和（3），排除了與乳腺癌生存密切相關(guān)的SNP（BMI，體重，吸煙，膽固醇）。使用MR多效性殘差和異常值檢驗(yàn)（MR-PRESSO）檢查了所選SNP的可能多效性。此外，為保證暴露和結(jié)局的效應(yīng)等位基因（effect allele）一致，將指代暴露和結(jié)局SNP等位基因方向協(xié)同，剔除不能判斷方向的palindromic（回型） SNP。所有數(shù)據(jù)均來自歐洲人口，這可以減少人口分層的影響。根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)排除了不適當(dāng)?shù)腎Vs，并使用多種方法來確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。
最后，包括104個(gè)SNP（乳腺癌總生存率），99個(gè)SNP（ER陽性乳腺癌生存率）和100個(gè)SNP（ER陰性乳腺癌生存率）用于進(jìn)一步研究。
反向方差加權(quán)（IVW）方法用于初步分析，以評估端粒長度與ER不同狀態(tài)的乳腺癌預(yù)后之間的因果關(guān)系。反向方差加權(quán)是將兩個(gè)或多個(gè)隨機(jī)變量聚合以最小化總和方差的方法，總和中每個(gè)隨機(jī)變量的權(quán)重與其方差成反比，方差通常用于組合獨(dú)立研究的結(jié)果。使用Wald比率方法計(jì)算每個(gè)SNP的暴露-結(jié)果效應(yīng)值。為了確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用了包括MR-Egger回歸，加權(quán)中位數(shù)，懲罰加權(quán)中位數(shù)和最大似然等多種方法。
敏感性分析
敏感性分析用來評估結(jié)果是否穩(wěn)健，結(jié)論是否靠譜，是否有潛在的偏倚（比如基因多效性：指一個(gè)基因影響多種表型；數(shù)據(jù)異質(zhì)性），是否存在某一個(gè)工具變量嚴(yán)重影響結(jié)局變量（一般用“l(fā)eave-one-out”法）；
多效性檢驗(yàn)：通過漏斗圖和MR-Egger截距測試，以檢測多效性的存在并評估結(jié)果的穩(wěn)健性。
異質(zhì)性檢驗(yàn)：通過IVW和MR-Egger檢驗(yàn)評估異質(zhì)性，P值<0.05表明研究中存在異質(zhì)性。MR-PRESSO R軟件包用于評估校正前后MR分析結(jié)果之間是否存在差異。
留一法（即leave-one-out法）：使用IVW和MR-Egger法，以評估去除一個(gè)SNP后，其余SNP的綜合效應(yīng)與主效應(yīng)是否一致，如果一致，則表明去除的單個(gè)SNP對MR分析沒有產(chǎn)生過度影響。
結(jié)果
1、孟德爾隨機(jī)化分析
MR分析顯示端粒長度與乳腺癌患者總體預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（OR=1.84, 95% CI=1.08-3.14, IVW方法），表明端粒長度是乳腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（圖1）。
圖1
端粒長度也與ER陰性乳腺癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)（OR=1.89, 95% CI=1.11-3.22,IVW法），表明端粒長度是ER狀態(tài)乳腺癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素（圖2）。
圖2
端粒長度與ER陽性乳腺癌（OR=0.99，95%CI=0.62-1.58，IVW法）的預(yù)后之間沒有類似的關(guān)系（圖3）。
圖3
為了確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性，還使用其他方法評估了相關(guān)性，這些方法的結(jié)果是一致的（圖 2和3）
敏感性分析
異質(zhì)性分析：IVW檢驗(yàn)（Q=100.710，P=0.545）和MR-Egger檢驗(yàn)（Q=99.691，P=0.545）在總?cè)橄侔?，ER陰性和ER陽性乳腺癌中均未觀察到明顯的異質(zhì)性。
多效性分析：MR-Egger截距檢驗(yàn)顯示P值>0.05，表明不存在水平多效性。MR-PRESSO測試確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性（表1）。
表1
留一法分別逐個(gè)剔除SNP后，對于剩下的SNP行效應(yīng)量估計(jì)，結(jié)果顯示剔除前和后的效應(yīng)量沒有較大的差異，提示沒有單個(gè)SNP對MR估計(jì)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。漏斗圖未見異常的估計(jì)值（圖S1和S2）。
圖S1（A）
圖S1（B）
圖S1（C）
圖S2(A)
圖S2(B)
圖S2(C)
四、討論與小結(jié)
這項(xiàng)研究表明，端粒長度與乳腺癌的預(yù)后有關(guān)，尤其是在ER陰性乳腺癌中；然而，端粒長度與ER陽性乳腺癌的預(yù)后之間沒有顯著相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)表明，長端?？梢灶A(yù)測ER陰性乳腺癌的不良預(yù)后。
其機(jī)制可能在于淋巴細(xì)胞在炎癥和腫瘤發(fā)生過程中受到刺激，并通過NF-kB途徑調(diào)節(jié)端粒酶，從而調(diào)節(jié)端粒長度。長端?？赡苁故軗p細(xì)胞存活更長時(shí)間，并繼續(xù)分裂，額外的突變可引發(fā)惡變。維持端粒長度是腫瘤持續(xù)生長所必需的，特別是在晚期腫瘤中。癌細(xì)胞可以通過重新激活上調(diào)端粒酶來維持其永生。另外，癌細(xì)胞可以逆轉(zhuǎn)端粒的磨損，以繞過衰老，這被稱為端粒途徑的替代性延長。
這項(xiàng)研究得到類似的結(jié)論，長端粒的遺傳易感性可能通過端粒維持途徑影響癌癥死亡率。其機(jī)制可能是由于免疫系統(tǒng)受到抑制時(shí)，乳腺癌細(xì)胞端?？s短的速度減慢，細(xì)胞凋亡減少。另一種解釋是端粒很短的細(xì)胞可能誘導(dǎo)衰老或凋亡，抑制細(xì)胞的增殖潛能，從而支持腫瘤抑制活性。端粒在癌癥中的具體功能機(jī)制尚不清楚。需要進(jìn)一步的研究來確定這些機(jī)制。激素也與端粒長度密切相關(guān)，因?yàn)榇萍に乜梢酝ㄟ^其對人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）的作用和hTERT的AKT依賴性磷酸化的轉(zhuǎn)錄后修飾直接參與端粒酶活化促進(jìn)。
看到這里是否對你有什么啟發(fā)呢？作者從一個(gè)臨床問題出發(fā)，查閱文獻(xiàn)后找出爭議點(diǎn)——分析爭議存在可能的原因——已經(jīng)有很多類似的文章了，怎么辦呢？那就根據(jù)疾病本身的基礎(chǔ)分類，將現(xiàn)有的研究范圍“細(xì)化”從而找出研究領(lǐng)域新的空白。
很多與癌癥預(yù)后相關(guān)結(jié)論，都可以巧妙利用這樣思路。通過將癌癥類型，研究人群等等的范圍“縮小”或者“擴(kuò)大”，從而挖掘出一個(gè)新的研究空白。更多思路，請聯(lián)系我們~
