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阿爾茨海默癥 (AD) 目前被認(rèn)為是全世界最著名的癡呆癥形式，由于缺乏早期診斷以及有效的治療手段，患者預(yù)后較差。關(guān)于阿爾茨海默癥，研究人員從未停止過(guò)探索，今天小編就帶大家閱讀一篇2023年2月21日發(fā)表在Frontiers in Immunology（IF:8.786）的文獻(xiàn)吧！
Integration of bulk RNA sequencing and single-cell analysis reveals a global landscape of DNA damage response in the immune environment of Alzheimer’s disease
整合Bulk RNA測(cè)序和單細(xì)胞分析揭示了阿爾茨海默癥免疫環(huán)境中DNA損傷反應(yīng)的全局圖景
全文概述
本研究使用179個(gè) DNA 損傷反應(yīng) (DDR)調(diào)節(jié)因子評(píng)估了AD患者的DDR模式。進(jìn)行單細(xì)胞技術(shù)以驗(yàn)證認(rèn)知障礙患者的DDR水平和細(xì)胞間通訊。在采用WGCNA方法發(fā)現(xiàn)DDR相關(guān)lncRNA 后，共識(shí)聚類(lèi)算法用于將167名AD患者分組為不同的亞組。評(píng)估了不同亞型之間在臨床特征、DDR水平、生物學(xué)行為和免疫學(xué)特征方面的差異。為了選擇與DDR相關(guān)的lncRNA，使用了四種機(jī)器學(xué)習(xí)算法（ LASSO、SVM-RFE、RF和XGBoost）建立風(fēng)險(xiǎn)模型。AD的進(jìn)展與DDR水平高度相關(guān)。單細(xì)胞分析證實(shí)，認(rèn)知障礙患者的DDR活性較低，主要富含T細(xì)胞和B細(xì)胞?；诨虮磉_(dá)發(fā)現(xiàn)了DDR相關(guān)的lncRNA，并鑒定了兩種不同的異質(zhì)亞型（C1和C2）。 DDR C1屬于非免疫表型，而DDR C2被認(rèn)為是免疫表型。基于各種機(jī)器學(xué)習(xí)算法，發(fā)現(xiàn)了四個(gè)與DDR相關(guān)的lncRNA，包括 FBXO30-DT、TBX2-AS1、ADAMTS9-AS2和MEG3。基于4-lncRNA的 riskScore在診斷AD方面表現(xiàn)出較好的效能，并為AD患者提供了顯著的臨床優(yōu)勢(shì)。與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)患者表現(xiàn)出較低的DDR活性，并有著較高水平的免疫浸潤(rùn)和免疫學(xué)評(píng)分。用于治療低危和高危AD患者的前瞻性藥物還分別包括花生四烯基三氟甲烷和TTNPB（圖1）。
DDR相關(guān)基因在AD患者中的作用
在排除異常腦組織樣本后，共有150 個(gè)正常腦組織樣本和161個(gè)AD腦組織樣本。在已發(fā)表的研究中獲得的200個(gè)DDR相關(guān)調(diào)控基因，其中179個(gè)基因包含在合并數(shù)據(jù)集中。與正常組相比，在AD腦組織中觀察到51 個(gè)DDR調(diào)節(jié)因子的異常表達(dá)，表明AD患者與健康受試者之間的生物學(xué)行為存在顯著差異（圖2A）。富集分析表明，這些差異表達(dá)的DDR調(diào)節(jié)因子主要富集在DNA損傷修復(fù)相關(guān)過(guò)程中。
為了系統(tǒng)地闡明51個(gè)差異表達(dá)的 DDR調(diào)控因子之間的關(guān)系，作者將這些基因分為三種類(lèi)型，并生成了一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，顯示了這些DDR相關(guān)基因之間的相互作用，其中大部分顯示出實(shí)質(zhì)性關(guān)聯(lián)（圖2B）。隨后，為了進(jìn)一步說(shuō)明DDR和AD之間的關(guān)系，基于差異表達(dá)的DDR 調(diào)節(jié)因子，使用 ssGSEA 算法計(jì)算每個(gè)樣本的DDR分?jǐn)?shù)。發(fā)現(xiàn)AD患者在組合數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出顯著低于非AD個(gè)體的DDR評(píng)分（圖2C），這與其他三個(gè)外部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集的結(jié)果一致（圖2D–F）。這些結(jié)果表明，這些DDR調(diào)節(jié)基因之間的相互作用可能在保持基因組完整性方面發(fā)揮重要作用，而DDR 的失調(diào)可能是導(dǎo)致AD進(jìn)展的重要因素。
此外，作者進(jìn)一步分析了DDR與28個(gè)浸潤(rùn)免疫細(xì)胞亞群之間的相關(guān)模式（圖2G）。較低的DDR 評(píng)分代表較高水平的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，表明低DDR評(píng)分和高度浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的協(xié)同作用可能促進(jìn)AD的進(jìn)展。
在單細(xì)胞水平上對(duì)DDR進(jìn)行分析
為了研究AD中各種浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的DDR活性差異，將來(lái)自15個(gè)MCI/AD樣本和44個(gè)正常CSF樣本的70391個(gè)分選細(xì)胞劃分為12個(gè)簇，最終注釋了7種細(xì)胞類(lèi)型（圖3A–C）。每組的細(xì)胞類(lèi)型分?jǐn)?shù)顯示認(rèn)知障礙 (CI) 組中所有細(xì)胞類(lèi)型的百分比下降（圖3D）。圖3E展示了每種細(xì)胞亞型的前15個(gè)標(biāo)記基因的表達(dá)模式。然后使用“UCell”算法計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞的DDR分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明具有較高DDR分?jǐn)?shù)的細(xì)胞主要富集在正常樣本中，特別是在T和B細(xì)胞區(qū)域（圖3F-H），這與批量轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的結(jié)果一致。由于T細(xì)胞占最大比例，接下來(lái)進(jìn)一步探討了DDR在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)。提取并重新分析T細(xì)胞，共鑒定出12個(gè)簇（圖3I、J）。所有六種主要細(xì)胞類(lèi)型在對(duì)照組和CI組之間均存在顯著差異。 UCell算法結(jié)果顯示，除Tcm/Naive輔助T細(xì)胞外，所有T亞型的 DDR 分?jǐn)?shù)均不同程度上調(diào)（圖3K，L）。
認(rèn)知障礙進(jìn)展中的細(xì)胞間相互作用
隨后，作者進(jìn)行了CellChat分析，以探索認(rèn)知障礙進(jìn)展過(guò)程中的細(xì)胞間相互作用。交互次數(shù)和強(qiáng)度從正常到認(rèn)知障礙增強(qiáng)。與正常組相比，CI組中的巨噬細(xì)胞、ILC 和pDC細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型表現(xiàn)出更強(qiáng)的相互作用數(shù)量和相互作用強(qiáng)度。而DC 細(xì)胞和B細(xì)胞與正常組中的單核細(xì)胞和pDC細(xì)胞頻繁通訊（圖4A、B）。然后通過(guò)比較每個(gè)通路的相互作用強(qiáng)度，在對(duì)照組和CI組之間確定特定通路（圖4C）。此外，在認(rèn)知受損的CSF樣本中觀察到T細(xì)胞與其他細(xì)胞類(lèi)型之間的強(qiáng)通信概率。然而，CD40LG與ITGAM+ITGB2和ITGA5+IRGB1之間的通信是CI組所獨(dú)有的（圖4D）。
DDR相關(guān)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的探索
為了進(jìn)一步闡明DDR的調(diào)控模式，進(jìn)行了WGCNA分析，并根據(jù)組合數(shù)據(jù)集中 lncRNA的表達(dá)譜篩選了DDR相關(guān)的lncRNA。根據(jù)最優(yōu)軟閾值β，對(duì)聚類(lèi)樹(shù)狀圖的樣本進(jìn)行層次聚類(lèi)，得到10個(gè)不同顏色的lncRNA共表達(dá)模塊（圖5A）。在交集之后，最終篩選出33種常見(jiàn)的DDR相關(guān)lncRNA（圖5B），構(gòu)建DDR-lncRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖5C）。33個(gè)DDR 相關(guān)lncRNA在對(duì)照組和AD患者之間的不同表達(dá)模式，其中31個(gè)在AD患者中顯著上調(diào)，2個(gè)DDR相關(guān)lncRNA在健康個(gè)體中上調(diào)（圖5D）。
識(shí)別AD患者的DDR亞型
基于33個(gè)DDR相關(guān)lncRNA的表達(dá)圖譜，使用共識(shí)聚類(lèi)算法將AD樣本分為不同的亞型，每個(gè)亞型具有不同的DDR調(diào)控狀態(tài)（圖6A）。將167名AD患者被分為兩個(gè)亞型，包括74例C1和93例 C2。 tSNE分析揭示了C1和C2集群之間AD患者分布的顯著差異（圖6B）。DDR C2顯示出相對(duì)于DDR C1較低的DDR評(píng)分（圖6C），表明DDR C2患者缺乏DDR調(diào)節(jié)。然而，年齡和性別分布在DDR C1 和 DDR C2 亞型之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖6D、E）。熱圖表明，這些與DDR相關(guān)的lncRNA在不同的DDR簇之間明顯不同，并且大多數(shù)lncRNA在DDR C2中上調(diào)（圖6F）。
DDR亞型之間分子功能和通路的特征
DDR亞型之間進(jìn)行DEG分析，探究轉(zhuǎn)錄組學(xué)差異。共獲得2472個(gè)DEG（2859 個(gè)上調(diào)和1856個(gè)下調(diào)）。基于GSVA算法的功能注釋顯示DDR C2主要參與肌管分化、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體激活、細(xì)胞間連接、神經(jīng)元突起再生、細(xì)胞周期停滯和免疫反應(yīng)。相反，DDR C1與線粒體和氨基酸代謝、tRNA 和溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)以及蛋白質(zhì)定位相關(guān)的生物學(xué)功能密切相關(guān)（圖7A）。通路富集分析表明，DDR C2 主要由免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用和幾種經(jīng)典信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)（圖7B）。一致地，GSEA結(jié)果表明DDR C2中B細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、JAK-STAT信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和Notch信號(hào)通路上調(diào)（圖7C）。DDR C1的特征在于DNA復(fù)制、糖異生、溶酶體、氧化磷酸化和 RNA 降解（圖7D）。這些結(jié)果突出了亞型1和亞型2之間不同的分子功能和通路。
識(shí)別DDR亞型之間的免疫特征
為了更好地闡明DDR亞型之間免疫微環(huán)境的差異，首先全面研究了免疫浸潤(rùn)水平之間的相關(guān)性?；趕sGSEA、MCPcounter、xCell、ABIS和ESTIMATE方法的免疫細(xì)胞亞群熱圖如圖8A所示，這表明大多數(shù)類(lèi)型免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平主要分布在 DDR C2。接下來(lái)，進(jìn)一步研究了DDR表型與各種免疫調(diào)節(jié)劑和免疫檢查點(diǎn)之間的相關(guān)性。 DDR對(duì)AD免疫微環(huán)境影響的結(jié)果顯示，CD28和CD80等共刺激因子在DDR C2亞型中的表達(dá)水平顯著升高。此外，在DDR C2亞型中也可見(jiàn)抗原呈遞、細(xì)胞粘附、共抑制物、配體、受體等功能的表達(dá)增加。與DDR C2相比，DDR C1表現(xiàn)出更高的CD274和CX3CL1表達(dá)（圖8B）。此外，DDR C2還表現(xiàn)出更強(qiáng)的免疫得分，這表明對(duì)免疫療法的反應(yīng)更強(qiáng)（圖8C）。基于以上結(jié)果，作者認(rèn)為DDR C2是免疫相關(guān)亞型，DDR C1是一種代謝表型。
基于機(jī)器學(xué)習(xí)選擇特征的DDR相關(guān)lncRNAs
為了進(jìn)一步確定能夠準(zhǔn)確診斷AD的DDR相關(guān)lncRNA，使用四個(gè)機(jī)器學(xué)習(xí)模型（LASSO、RF、SVM-RFE和XGBoost），在33個(gè)DDR相關(guān)lncRNA的表達(dá)圖譜基礎(chǔ)上進(jìn)行特征選擇。使用LASSO分類(lèi)器最終篩選了15個(gè)具有非零系數(shù)的DDR相關(guān)lncRNAs（圖9A）。ROC曲線分析顯示，基于15個(gè)lncRNA的LASSO模型的AUC在訓(xùn)練集為0.745，在測(cè)試集為0.743（圖9B）。隨后，確定了9個(gè)lncRNA的組合在基于SVM-RFE模型預(yù)測(cè)AD發(fā)生方面表現(xiàn)出最高的準(zhǔn)確性（圖9C）。接下來(lái)采用Boruta特征選擇算法，共確定了14個(gè)重要的lncRNAs。這14個(gè)由Boruta算法篩選出來(lái)的特征被納入到RF模型中，在訓(xùn)練集中的AUC值為1，在測(cè)試集中為0.731（圖9D）。此外，對(duì)于AD的識(shí)別，XGBoost分類(lèi)器在訓(xùn)練集和測(cè)試集的AUC分別達(dá)到1和0.778（圖9E）。FBXO30-DT、ADAMTS9-AS2、TBX2-AS1和MEG3在LASSO、SVM-RFE、RF和XGBoost算法均有重要的作用，被確定為DDR相關(guān)lncRNAs（圖9F）。
風(fēng)險(xiǎn)模型和列線圖的建立
這四個(gè)不同的與DDR相關(guān)的lncRNAs被用來(lái)計(jì)算DDR相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)，使用它們相應(yīng)的LASSO模型系數(shù)：風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)=（-0.188478×FBXO30-DT）+（0.117249× ADAMTS9-AS2）+（0.129318×TBX2-AS1）+（0.320641×MEG3）。隨后，使用ROC曲線分析評(píng)估了風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)和臨床特征（年齡和性別）在預(yù)測(cè)合并數(shù)據(jù)集中的AD進(jìn)展方面的診斷功效。基于ROC曲線，預(yù)測(cè)模型的AUC值為0.712，年齡為0.558，性別為0.455，AD患者表現(xiàn)出明顯較高的riskScore（圖10A，B）。這些結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)可以比經(jīng)典臨床指標(biāo)更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)AD的進(jìn)展。由性別、riskScore和年齡構(gòu)成的提名圖顯示了這些特征在診斷AD方面令人滿(mǎn)意的預(yù)測(cè)結(jié)果（圖10C），計(jì)算的校準(zhǔn)曲線證明了列線圖的穩(wěn)健性（圖10D）。此外，DCA表明基于風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)的列線圖在臨床上是有益的（圖10E）。
低危和高危人群的臨床價(jià)值和分子通路
為了全面說(shuō)明AD的DDR 風(fēng)險(xiǎn)得分相關(guān)機(jī)制，作者建立了一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)模型，并根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)將總共167個(gè)AD樣本分為低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)組。這四個(gè)與DDR相關(guān)的lncRNAs在低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組之間有著不同的表達(dá)模式，其中MEG3、TBX2-AS1和ADAMTS9-AS2在高風(fēng)險(xiǎn)組的表達(dá)水平更高。而在低風(fēng)險(xiǎn)組中，F(xiàn)BXO30-DT的表達(dá)明顯較高（圖11A）。Sankey圖全面描述了低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組中不同亞型和臨床指標(biāo)比例的細(xì)節(jié)。高危組的DDR C2亞型樣本更多，而性別和年齡分布在低、高危組之間沒(méi)有明顯差異（圖11B-D）。此外，通過(guò)比較這兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)組之間的DDR分?jǐn)?shù)水平，低風(fēng)險(xiǎn)組的DDR分?jǐn)?shù)相對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)組要高（圖11E）。
GSEA顯示，高危組在自身免疫性疾病、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、ECM受體相互作用、JAK-STAT信號(hào)通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。和神經(jīng)活性配體受體相互作用中富集（圖11F），而低風(fēng)險(xiǎn)組在TCA循環(huán)、DNA復(fù)制、氧化磷酸化、戊糖磷酸鹽途徑、嘧啶和丙酮酸代謝以及RNA降解相關(guān)的通路調(diào)節(jié)中富集（圖11G）。
為了評(píng)估AD患者的個(gè)體化臨床治療，作者使用CMap數(shù)據(jù)庫(kù)分別探索了低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)人群的潛在治療藥物。對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)組來(lái)說(shuō)，前5個(gè)蘊(yùn)含個(gè)體化治療潛力的藥物如下。W-13, XAH-6809, TTNPB, butein, 和花生三氟甲烷（圖11H）。而vorinostat、alsterpaullone、STOCKIN-35874、花生醇三氟甲烷和TTNPB是對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)AD患者最有效的五種治療藥物（圖11I）。特別是花生醇三氟甲烷和TTNPB在低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的CMap得分分別最低，揭示了不同風(fēng)險(xiǎn)的AD患者的最佳治療效果。
不同AD風(fēng)險(xiǎn)患者之間免疫微環(huán)境和治療藥物的差異
根據(jù)ssGSEA、MCPcounter、xCell、ABIS和ESTIMATE算法，作者還探討了低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組的浸潤(rùn)細(xì)胞情況。在高危組中觀察到多種免疫細(xì)胞亞型（圖12A）。此外，免疫調(diào)節(jié)劑和免疫檢查點(diǎn)在不同風(fēng)險(xiǎn)的AD患者之間存在明顯的差異。相對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)的AD患者，低風(fēng)險(xiǎn)患者只顯示出HMGB1的高表達(dá)（圖12B）。此外，在低風(fēng)險(xiǎn)組可以觀察到免疫得分的明顯降低，表明對(duì)免疫治療的反應(yīng)性差（圖12C）。相關(guān)分析也表明，較高的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)與大多數(shù)類(lèi)型的免疫細(xì)胞呈正相關(guān)，并顯示出免疫的卓越浸潤(rùn)水平（圖12D）。
總結(jié)
文章到這里就要結(jié)束，作者整合bulk和單細(xì)胞數(shù)據(jù)探究DDR調(diào)節(jié)因子在AD患者中的影響，并構(gòu)建了診斷模型。文章思路清晰明了，也非常適合生信小白學(xué)習(xí)?，F(xiàn)在生信分析已經(jīng)成為研究過(guò)程中不可缺少的環(huán)節(jié)，想要更進(jìn)一步的小伙伴千萬(wàn)不要落下了，趕緊學(xué)習(xí)起來(lái)吧！
