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空間結(jié)構(gòu)的分析離不開相應的平臺，這篇文章使用的測序技術(shù)有Hi-C，ChIP-seq，ATAC-seq，CUT&Tag，F(xiàn)actory RNA-seq（新生RNA水平），這將RNAPII在基因表達中的作用與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中的作用協(xié)調(diào)展示。這篇文章發(fā)表在期刊期刊: Science Advances，在最近一年的影響因子為14.136比上一年增加了1.02。
背景知識：
哺乳動物染色體是三維實體。染色體構(gòu)象捕獲(3C)技術(shù)的發(fā)展和擴展深刻地更新了我們對真核染色體的空間組織及其功能和維持的理解。除了粘附素，另一個以轉(zhuǎn)移DNA而聞名的分子馬達是RNA聚合酶(RNAP)。然而，它對染色質(zhì)折疊的貢獻仍然存在爭議。不同的證據(jù)表明，RNAPII與染色質(zhì)的結(jié)合和空間相互作用的不同形成之間存在聯(lián)系。
TAD: topologically associated domain拓撲關(guān)聯(lián)域
結(jié)果解讀：
RNAPII是細胞存活所必需的，因此它的耗盡可能只是短暫的。因此，作者開發(fā)了一個人類DLD-1結(jié)直腸癌細胞系，其中最大的RNAPII亞單位RPB1的N端標記有一個微小AID(MAID)結(jié)構(gòu)域。作者用DOX/生長素處理2小時可使RNAPII蛋白水平降低60%以上，而用Western blotting評估，14小時的處理可使RNAPII蛋白水平降低80%以上，而不影響RNAPI或RNAPIII水平(Fig. 1A)。為了進一步描述細胞系，作者使用針對RPB1中mClover標簽的抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀測序(CHIP-SEQ)。聚合酶降解伴隨著轉(zhuǎn)錄起始點(TSSs)染色質(zhì)的顯著降低(Fig. 1B)，這與最近用小鼠胚胎干細胞(MESCs)發(fā)現(xiàn)的相似。作者還查詢了H3K27ac(標記活性染色質(zhì))和H3K27me3組蛋白修飾(標記兼性異染色質(zhì))。當RNAPII耗盡時，觀察到顯著的H3K27ac降低伴隨著H3K27me3水平的升高。接下來，作者探索在RNAPII耗盡時，間期染色質(zhì)的空間組織是否也發(fā)生了變化。作者將原位Hi-C應用于G1期分選的DLD-1-RPB1-MAID細胞、用生長素處理的細胞、不用生長素處理的14小時細胞和雷公藤甲素處理的細胞。G1細胞的使用消除了S/G2期細胞產(chǎn)生的異質(zhì)性，以生成更詳細的Hi-C圖。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，圖像只顯示出A-/B-compartments的邊際差異(Fig. 1, C and D)。在對照的4110個細胞中，小于20%的Hi-C數(shù)據(jù)在RNAPII缺乏的細胞中發(fā)生變化，TADS也只顯示了輕微的干擾(Fig. 1, E and F)。在生長素/雷公藤甲素處理的細胞中可以檢測到227個新的TADs，并在它們的邊界顯示出強化的絕緣現(xiàn)象(Fig. 1F)。TADS內(nèi)/周圍的交互信息文件顯示，以TAD內(nèi)部交互為代價，對其邊界的定義更強(Fig. 1G)。到目前為止，作者的數(shù)據(jù)與最近在mESCs中觀察到的結(jié)果相吻合。然而，作者也在生長素處理的細胞中檢測到>1500個loop。這些細胞明顯大于對照細胞或在不同條件下共享的細胞(Fig. 1, H and I)。其中，生長素和生長素/雷公藤甲素處理的細胞共有的805個loop也更大，并在錨定處表現(xiàn)出更高的絕緣性(Fig. 1, H到J)。為了理解這些更強的loop的出現(xiàn)，作者計算了它們形成的環(huán)域內(nèi)累積的新生RNA表達水平。與來自控制單元的所有l(wèi)oop或共享loop相比，這805個loop明顯更多地與頂部loop結(jié)構(gòu)域相關(guān)聯(lián)。總而言之，作者的數(shù)據(jù)揭示了間期急性RNAPII耗竭時TAD和loop組織水平上的微妙但可辨別的影響。
由于RNAPII缺失對異步化細胞群體中的間期染色質(zhì)組織沒有明顯影響，作者推測RNAPII缺失可能與有絲分裂后染色質(zhì)折疊的重建有關(guān)。這是基于兩個觀察結(jié)果：第一，對有絲分裂到G1轉(zhuǎn)變過程中染色質(zhì)折疊動力學的描述：在有絲分裂到G1轉(zhuǎn)變中，順式元件之間的接觸形成早而快，通常與CTCF/粘附素無關(guān)；第二，在轉(zhuǎn)變的早期，所有活性增強子和基因中，超過50%的基因表現(xiàn)出強烈的轉(zhuǎn)錄尖峰。為了研究有絲分裂退出后染色質(zhì)的重折疊，作者使用CDK1抑制劑RO3306（阻斷約90% G2細胞）在G2-M檢查點同步了MAID-RPB1細胞(Fig. 2, A和B)。然后通過有絲分裂將它們釋放到G1期。清除抑制劑6小時后，>70%的細胞重新進入G1期，并通過熒光激活細胞分選(FACS)收集(Fig. 2, A和B)。RNAPII的降解通過分級、全細胞印跡、Ser5磷酸化的RNAP的免疫熒光和新生RNA的5-乙炔基-UTP(EUTP)標記得到證實(Fig. 2C)。染色質(zhì)中豐富的SWI/SNF染色質(zhì)重構(gòu)體亞基的水平發(fā)生了變化，但CTCF的介入基本保持不變(Fig. 2C)。接下來，作者對經(jīng)生長素處理或不經(jīng)生長素處理的G1-REENTRY細胞進行了Hi-C實驗。結(jié)合3D-DNA FISH證實RNAPII降解引起染色體間互作增強而染色體內(nèi)互作減弱，compartment邊界明顯模糊(Fig. 2D)，A-和B-compartment節(jié)段之間>1 Mbp(百萬個基本配對)距離處的相互作用變得更強(Fig. 2E)。作者觀察強烈且廣泛的domain結(jié)構(gòu)、局部insulation和loop形成的缺失(Fig. 2, F和G)。在對照細胞中發(fā)現(xiàn)的所有4500個TAD中，insulation都減弱了。在沒有RNAPII的情況下，沒有重建的10%的TAD邊界中的insulation甚至更弱(Fig. 2H)。RNAP耗盡的REENTRY細胞也比對照細胞有更少和更大的TADS (Fig. 2I)，表明邊界坍塌和TAD合并。這些效應與RNAPII和活性組蛋白標記在TAD邊界的富集是一致的(Fig. 2J)。在loop水平上，RNAPII耗盡的細胞基本上丟失了1900個，同時出現(xiàn)了超過1150個新的和明顯更長的loop(Fig. 2K)。在對照和生長素處理的reentry細胞中檢測到的2443個loop在沒有RNAPII的情況下被削弱，同時在它們的錨定處也顯示出減少的insulation (Fig. 2, K - M)。作者再一次比較了無基因表達的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域和具有高分位數(shù)新生RNA水平的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域。作者發(fā)現(xiàn)，在這兩種情況下，insulation都明顯減弱(Fig. 2N)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，RNAPII與染色質(zhì)折疊的重建有關(guān)，并且它的耗盡會影響loop的形成。
考慮到拓撲異構(gòu)酶（TOP2A/B）對RNAPII動態(tài)的局限影響，研究者想確定G1-reentry細胞中TOP2缺失是否可以解釋RNAPII缺失所產(chǎn)生的影響，因而應用攜帶/未完全敲除TOP2B基因并純合表達mAID-tagged TOP2A的大腸癌細胞系HCT116。先驗證了生長素對TOP2A/B的降解作用，聯(lián)合FACS得到G1-reentry細胞，并分析新生RNA水平以及所有層級染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。多種數(shù)據(jù)分析表明RNAPII降解對染色質(zhì)重折疊造成的影響無法由TOP2A/B降解概括，而是以聚合酶為中心。
耗盡RNAPII的G1-reentry細胞的HI-C數(shù)據(jù)顯示A/Bcompartment混合、TAD侵蝕和loop的差別損失/增益。作者繼續(xù)研究了生長素處理后reentry細胞中CTCF/粘附素亞基水平的變化。Western blotting顯示染色質(zhì)上的CTCF、SMC1A或Rad21水平波動很小，這在免疫熒光定量中得到了證實(Fig. 3, A和B)。為了了解作者的發(fā)現(xiàn)是否是由于NIPBL和CTCF核分布的變化，作者對這些因素進行了超分辨定位。雙色dSTORM在對照組和生長素處理的G1-reentry細胞中產(chǎn)生了以下觀察結(jié)果。首先，當RNAPII耗盡時，NIPBL定位在較小的簇中。同時，作者在擴展和變形的簇中也觀察到了更多的局域化現(xiàn)象(Fig. 3C)。其次，CTCF簇的平均大小沒有改變，但在對照細胞中，50%的CTCF簇位于<129px2，而在生長素處理的細胞中，50%位于<82px2(Fig. 3C)。這些結(jié)果，以及染色質(zhì)上NIPBL/MAU2/WAPL水平的變化，暗示在沒有RNAPII的情況下，異常的粘附素(很可能)加載到染色質(zhì)上，并預測最終在CTCF結(jié)合位點的粘附素將會減少。為了驗證這一預測，作者在對照和生長素處理的reentry細胞中生成了SMC1A和Rad21 Cut&Tag數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)全基因組CTCF位點的粘附素信號顯著減少(Fig. 3D)。作者發(fā)現(xiàn)，CTCF位點讀數(shù)的減少伴隨著生長素處理的reentry細胞中映射到非活性TSSs的信號增加20%到30%，以及廣泛存在的基因間信號增加>11%(Fig. 3E)。因此，CTCF位點粘附素占有率的普遍減少會損害全基因組的loop形成(Fig. 3E)。值得注意的是，盡管通過ATAC-seq(測序分析)判斷出CTCF近端可及性沒有減少，這些變化還是發(fā)生了(Fig. 3F)。RNAP耗盡的TSSs中的ATAC-SEQ信號顯著增加(Fig. 3G)，染色質(zhì)上的TBP(TATA盒結(jié)合蛋白)水平也是如此(Fig. 3A)。
為了剖析RNAPII和粘附素重新裝載到染色質(zhì)之間的聯(lián)系，作者轉(zhuǎn)向染色質(zhì)折疊的電子模擬。假設大多數(shù)粘附素(90%)發(fā)生在RNAPII占據(jù)的TSSs處(隨機加載10%)，作者模擬了對照染色質(zhì)折疊。經(jīng)過多次迭代，作者的模型生成了一個類似于Hi-C數(shù)據(jù)的平均關(guān)聯(lián)地圖(Fig. 4, A和B)。作者觀察到了：loop的形成明顯被削弱(Fig. 4, C和D)，但更大的loop大小與作者的實驗結(jié)果相符(Figs. 2, K 、L和 3E)。因此，作者的模型表明，不能通過RNAPII結(jié)合位點加載粘附素，這足以解釋實驗觀察到的主要染色質(zhì)折疊差異。為了直接研究RNAPII和粘附素之間的相互作用，作者設計了一維模擬。作者觀察到oop的形成和錯綜復雜的區(qū)域劃分 (Fig. 4E)。RNAP的耗盡消除了區(qū)域化現(xiàn)象，loop頻率再次明顯降低。loop再次變大的同時，粘附素占有率降低。建模表明實驗中的主要染色質(zhì)折疊差異可以通過RNAPII結(jié)合位點無法加載黏連素來解釋，并且推斷出實驗中觀察到的效果可以通過RNAP占據(jù)位點的黏連素與轉(zhuǎn)錄活性和loop擠壓之間的相互作用之間的簡單關(guān)系來說明。
全文小結(jié)：
作者發(fā)現(xiàn)了環(huán)擠出對RNAPII的依賴性，RNAPII在退出有絲分裂后主導著基因組重組。這種依賴性可能說明了有絲分裂的重要性，因為TF與有絲分裂染色質(zhì)的關(guān)聯(lián)可以決定RNAP的定位、粘附素的加載和環(huán)的擠出。然而，聚合酶、TF和粘附素亞基在這一轉(zhuǎn)變過程中的確切相互作用仍有待進一步闡明。
參考文獻：
Zhang S, Ubelmesser N, Josipovic N, et al. RNA polymerase II is required for spatial chromatin reorganization following exit from mitosis. Sci Adv 2021; 7(43): eabg8205.
