掃碼聯(lián)系客服
在當(dāng)前腫瘤研究中，腫瘤免疫微環(huán)境已成為重要的關(guān)注點(diǎn)。不過傳統(tǒng)組織測(cè)序方法不能有效識(shí)別和刻畫腫瘤微環(huán)境中各個(gè)免疫細(xì)胞的種類及其所處狀態(tài)。而單細(xì)胞具有更高的分辨率，因此越來越多的研究試圖將單細(xì)胞與組織相結(jié)合來探索腫瘤微環(huán)境。今天小編給大家分享一篇2022年12月發(fā)表在GENOME BIOLOGY（IF:17.906）雜志上，結(jié)合單細(xì)胞及bulk數(shù)據(jù)研究胃癌腫瘤免疫微環(huán)境的文章。
Parallel single-cell and bulk transcriptome analyses reveal key features of the gastric tumor microenvironment
單細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)錄組并行分析揭示胃癌腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵特征
一．文章背景
胃癌是全球第五大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因。此外，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境(TME)在多種癌癥中顯著影響患者的治療結(jié)果及臨床結(jié)局。不過胃癌中組成TME的細(xì)胞還沒有被廣泛地研究，因此該文章將單細(xì)胞和組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行并行分析，并揭示了胃癌腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵特征。
二．文章摘要
研究對(duì)24例未經(jīng)治療的胃癌患者的腫瘤及癌旁組織的單細(xì)胞及組織RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，并通過聚類非上皮細(xì)胞識(shí)別出胃癌TME中的81種細(xì)胞類型。研究發(fā)現(xiàn)胃癌中激活的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞過表達(dá)。此外，研究通過細(xì)胞間網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)和生存分析發(fā)現(xiàn)免疫抑制髓系細(xì)胞亞群和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與患者抗PD_1治療應(yīng)答缺乏和不良預(yù)后有關(guān)，而IFNγ激活的T細(xì)胞和表達(dá)HLA-II的巨噬細(xì)胞與治療應(yīng)答和總生存率增加有關(guān)。
三．文章的主要內(nèi)容及結(jié)果
1. 胃癌的腫瘤微環(huán)境
文章首先對(duì)胃癌的腫瘤微環(huán)境（TME）進(jìn)行了整體刻畫。研究對(duì)24例未經(jīng)治療的胃癌患者的腫瘤和癌旁樣本進(jìn)行組織RNA測(cè)序(RNA-seq)和全外顯子組測(cè)序以及單細(xì)胞RNA-seq (scRNAseq)測(cè)序(圖1a)。接著為了識(shí)別構(gòu)成胃癌TME的細(xì)胞類型，研究使用scRNA-seq數(shù)據(jù)，將96623個(gè)細(xì)胞聚類為11種主要細(xì)胞類型，并進(jìn)一步分為81種亞型(圖1b)。作者根據(jù)標(biāo)記基因的表達(dá)對(duì)主要細(xì)胞亞群進(jìn)行了注釋，主要識(shí)別出B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞、NK細(xì)胞、髓系細(xì)胞、肥大細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、壁細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及上皮細(xì)胞(圖1c)。
2. 腫瘤間質(zhì)存在活化的成纖維細(xì)胞
在這一部分作者對(duì)成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步分析。研究先將16492個(gè)成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞重聚類，識(shí)別出15個(gè)細(xì)胞亞群(圖2a)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)壁細(xì)胞與成纖維細(xì)胞明顯分離。研究對(duì)單個(gè)細(xì)胞亞群進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，每個(gè)細(xì)胞亞群有多個(gè)特異基因，突顯出胃成纖維細(xì)胞和壁細(xì)胞的異質(zhì)性(圖2b)。此外，研究也對(duì)惡性和非惡性樣本的成纖維細(xì)胞亞群進(jìn)行了比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌TME中靜息成纖維細(xì)胞亞群急劇減少(圖2b)。
3. CTHRC1陽性成纖維細(xì)胞特異基因的表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)
在這一部分作者對(duì)成纖維細(xì)胞特異基因的表達(dá)與臨床結(jié)局的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析。作者整合組織和單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)識(shí)別出各個(gè)細(xì)胞亞群中具有不同表達(dá)模式的上調(diào)(U)和下調(diào)(D)基因模塊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)上調(diào)和下調(diào)的基因模塊在單個(gè)成纖維細(xì)胞亞群中特異性表達(dá)(圖 2c)，其中U7與成纖維細(xì)胞增殖、基質(zhì)重塑和細(xì)胞遷移相關(guān)(圖2d)。此外，研究也發(fā)現(xiàn)來自U7的所有基因均在F13- CTHRC1激活的成纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)，并且與較差的生存相關(guān)(圖2e)。
4. 腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞將免疫吸引力轉(zhuǎn)換為血管生成通路
這一部分研究對(duì)胃癌中的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)分析。作者對(duì)數(shù)據(jù)中的3684個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行重聚類識(shí)別了9個(gè)亞群對(duì)應(yīng)于6種不同的內(nèi)皮細(xì)胞亞型(圖3a)，分別與動(dòng)脈、毛細(xì)血管、未成熟內(nèi)皮細(xì)胞、尖端細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和靜脈細(xì)胞相關(guān)(圖3b)。隨后研究對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞特異基因進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)兩類內(nèi)皮細(xì)胞中的血管生成和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)反應(yīng)通路增加，而抗原呈遞和免疫防御相關(guān)功能減少，表明胃癌中內(nèi)皮細(xì)胞的免疫細(xì)胞吸引力降低(圖3c)。由于血管新生對(duì)腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)至關(guān)重要，因此作者推測(cè)這些細(xì)胞類型可能與較差的生存有關(guān)，結(jié)果研究在TCGA胃癌隊(duì)列也確實(shí)觀察到SERPINE1表達(dá)與生存急劇惡化有關(guān)（圖3d）。
5. 巨噬細(xì)胞展示出炎癥二分類
研究在這一部分對(duì)胃癌TME中的髓系細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)刻畫。研究將數(shù)據(jù)集中的10546個(gè)髓系細(xì)胞重新聚類識(shí)別了15個(gè)亞群，并將這些亞群注釋為巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞或中性粒細(xì)胞(圖4a)。接著研究通過特異表達(dá)基因?qū)⒕奘杉?xì)胞亞群確定為促炎和抗炎或組織駐留巨噬細(xì)胞(圖4b)。研究也發(fā)現(xiàn)髓系細(xì)胞在胃癌TME中急劇增加，只有組織駐留巨噬細(xì)胞在健康胃組織中升高（圖c）。研究也發(fā)現(xiàn)促炎和抗炎基因特征的表達(dá)在所有患者樣本中均呈負(fù)相關(guān)(圖4d)。在TCGA胃癌隊(duì)列中，研究也觀察到抗炎特征與不良預(yù)后顯著相關(guān)(圖4e)。
6. 淋巴細(xì)胞向免疫抑制型和分化型轉(zhuǎn)移
接下來研究對(duì)胃癌中的淋巴細(xì)胞進(jìn)行了進(jìn)一步分析。研究首先觀察到CD8+ T細(xì)胞比例在腫瘤和正常樣本中幾乎沒有差異，而CD4+ T細(xì)胞在胃腫瘤樣本中顯著增加。接著作者將12905個(gè)CD4+ T細(xì)胞重新聚類為8個(gè)亞群，然后將這些亞群注釋為6種輔助性T細(xì)胞亞型，包括調(diào)節(jié)性、na?ve、中央記憶(CM)、效應(yīng)記憶(EM)和濾泡輔助性T細(xì)胞(圖5a)。此外，研究也將31705個(gè)CD8+ T細(xì)胞和2658個(gè)NK細(xì)胞聚成13個(gè)亞群，其中12個(gè)亞群對(duì)應(yīng)8種不同的CD8+ T細(xì)胞亞型，1個(gè)亞群對(duì)應(yīng)NK細(xì)胞亞型。研究觀察到這些CD8+ T細(xì)胞分別被注釋為na?ve、效應(yīng)細(xì)胞、效應(yīng)記憶細(xì)胞、表達(dá)CD45RA的效應(yīng)記憶細(xì)胞、駐留記憶細(xì)胞、耗竭性、上皮內(nèi)細(xì)胞和具有三級(jí)淋巴特征的CD8+ T細(xì)胞 (圖5b)。
5. 細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的潛在驅(qū)動(dòng)因素
這部分研究對(duì)胃癌腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用進(jìn)行了分析。研究基于單細(xì)胞數(shù)據(jù)中的配體和受體表達(dá)信息構(gòu)建了細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)。研究發(fā)現(xiàn)胃癌微環(huán)境在不同的細(xì)胞亞型之間存在廣泛的交流，其中F13-CTHRC1與許多細(xì)胞亞型顯著相關(guān)(圖6a，b)。研究也發(fā)現(xiàn)許多在胃癌中上調(diào)的基因參與了F13-CTHRC1以及內(nèi)皮細(xì)胞特異性的相互作用，而下調(diào)的基因沒有，這進(jìn)一步表明了腫瘤特異性細(xì)胞通訊程序的存在(圖6d)。此外，研究也觀察到F13-CTHRC1不僅能通過刺激血管生成促進(jìn)腫瘤重構(gòu)，還可能推動(dòng)抗炎巨噬細(xì)胞的發(fā)展(圖6c)。
6. 胃癌TME中的配體受體相互作用揭示了免疫逃避機(jī)制
研究在這一部分對(duì)胃癌TME中的7210個(gè)上皮細(xì)胞進(jìn)行了詳細(xì)分析。作者將這些細(xì)胞聚類成15個(gè)亞群，隨后通過copyKAT算法識(shí)別出惡性細(xì)胞。接著研究在細(xì)胞互作網(wǎng)絡(luò)中觀察到惡性細(xì)胞亞群與多種其他細(xì)胞類型關(guān)聯(lián)(圖6A)，主要的相互作用細(xì)胞類型是CD8+ T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。其中EP11-CLDN7和CD8+ T細(xì)胞之間的相互作用以LGALS9-HAVCR2和HVEM-CD160的相互作用為主，這兩者都是眾所周知的抑制CD8+ T細(xì)胞功能的檢查點(diǎn)，這表明胃癌腫瘤細(xì)胞具有免疫抑制功能。
7. 細(xì)胞類型特征可預(yù)測(cè)患者預(yù)后
這一部分研究分析了不同細(xì)胞亞群對(duì)患者預(yù)后的影響。研究使用單細(xì)胞數(shù)據(jù)作為參考，根據(jù)CibersortX推斷TCGA樣本中每種細(xì)胞亞型的比例，隨后評(píng)估了每種細(xì)胞亞型比例較高和較低的患者之間的生存差異，結(jié)果觀察到F13-CTHRC1和EN10-SERPINE1細(xì)胞比例較高的患者生存時(shí)間顯著縮短(圖7a, b)。相反，樹突狀細(xì)胞cDC1比例則對(duì)患者生存有顯著的正面影響(圖7c)。此外，作者在通訊網(wǎng)絡(luò)分析中發(fā)現(xiàn)M16-CLEC9A通過多種通訊信號(hào)與CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞群相互作用，其中最顯著的是XCL1/ XCL2-XCR1受體-配體軸(圖7d)。因此，結(jié)合這些負(fù)相關(guān)特征，研究在F13富集/M16缺失患者和F13缺失/M16富集患者之間觀察到更顯著的生存差異(圖7e)。
8. 整合免疫治療的胃癌組織RNA - seq數(shù)據(jù)揭示影響應(yīng)答的細(xì)胞及分子
在研究的最后一部分，作者對(duì)導(dǎo)致免疫檢查點(diǎn)抑制(ICI)治療耐藥的細(xì)胞類型和TME信號(hào)通路進(jìn)行了分析。研究收集了45例接受抗PD -1治療患者的組織RNA-seq數(shù)據(jù)，其中包括12例應(yīng)答患者和33例未應(yīng)答患者。接著研究通過差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)在12例有反應(yīng)患者和33例無反應(yīng)患者的樣本中，分別有696個(gè)和1382個(gè)基因顯著高表達(dá)(圖8a)。接著研究在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中根據(jù)應(yīng)答相關(guān)的基因進(jìn)行聚類，結(jié)果識(shí)別出8個(gè)應(yīng)答基因集及4個(gè)非應(yīng)答基因集（R1-R8，NR1-4，圖8b）。研究也發(fā)現(xiàn)這些基因集中包含一些顯著的細(xì)胞標(biāo)記基因，提示這些細(xì)胞對(duì)免疫治療應(yīng)答產(chǎn)生影響(圖8c，d)。接下來為了進(jìn)一步研究在胃癌TME中發(fā)現(xiàn)的11種主要細(xì)胞類型或81種亞型中是否有任何一種可用于預(yù)測(cè)免疫治療應(yīng)答，作者基于每種細(xì)胞類型的標(biāo)記基因構(gòu)建了二元分類模型預(yù)測(cè)治療結(jié)局，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T27周期CD8+ T細(xì)胞預(yù)測(cè)治療結(jié)局的效能最優(yōu)(圖8e)。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了。文章將組織數(shù)據(jù)及單細(xì)胞數(shù)據(jù)結(jié)合進(jìn)行分析，對(duì)胃癌的腫瘤微環(huán)境進(jìn)行了全面刻畫。研究對(duì)胃癌微環(huán)境中主要細(xì)胞類型的基因表達(dá)、功能、通訊及對(duì)生存和治療應(yīng)答的影響進(jìn)行了分析，做單細(xì)胞的小伙伴可以參考這種思路。
