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“滴血驗癌”之ctDNA如何真正發(fā)揮臨床價值？
哈嘍，大家好，聽說過“滴血驗癌”這種黑科技嗎？是驚天騙局？還是醫(yī)學奇跡？今天小編就和大家談談這個話題，用事實說話！我們先詳細解讀1篇近期剛發(fā)表在《Nature Communications》雜志上的文章，題目為“Circulating tumor DNA reveals complex biological features with clinical relevance in metastatic breast cancer”。通過這篇文章的學習，相信大家會對ctDNA在乳腺癌中的臨床價值有所了解。在推文的最后，小編還會給大家分享幾篇關(guān)于ctDNA在不同腫瘤類型中的最新研究，希望能拋磚引玉，對大家有所啟發(fā)。
導讀
基因組測序為精確腫瘤學帶來了許多新的生物標志物和治療可能。體細胞基因突變、擴增和基因融合檢測可以在多種癌癥類型中提供靶向治療的靶點。早在1948年，研究人員就發(fā)現(xiàn)我們細胞內(nèi)的DNA并不是都呆在我們的細胞核內(nèi)，這些DNA也會游離到血液中來，這些在血液中的DNA被稱之為“細胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）”，包括正常細胞釋放到血液中DNA，也包括腫瘤細胞釋放到血液中DNA。顧名思義，腫瘤細胞釋放到血液中的DNA，隨血液在全身循環(huán)，故被稱為“循環(huán)腫瘤DNA（circluting-tumor DNA，ctDNA）”。對血液樣本中的腫瘤DNA（如ctDNA）進行測序（即液體活檢），能夠在任何給定時間內(nèi)獲得一些基于腫瘤的遺傳信息，這種方法可避免實體腫瘤侵入性活檢及相關(guān)并發(fā)癥。目前“滴血驗癌”的檢測原理，正是通過檢測血液中的ctDNA，來檢測癌癥信號。
雖然，鑒定單個腫瘤的DNA變化在臨床上可行，但癌癥是高度復雜性疾病，除了在臨床上鑒定腫瘤DNA改變，往往還需要額外的生物學信息來完善患者預后、預測治療獲益。在癌癥早期，基于多基因轉(zhuǎn)錄組信息的預后檢測是有效的，并被臨床指南所推薦；在癌癥晚期，基于轉(zhuǎn)錄組的分析正成為一種有前景的預后和預測工具。遺憾的是，晚期癌癥患者的組織樣本不易獲得，此外，轉(zhuǎn)移器官或部位的類型可能會影響從轉(zhuǎn)錄組中獲得的表達模式，不能反映患者腫瘤的異質(zhì)性。
為解決上述難題，2019年，西班牙IDIBAPS生物醫(yī)學研究所的作者報道了一種基于監(jiān)督學習的綜合計算方法，其利用來自DNA拷貝數(shù)改變（CNA）的數(shù)據(jù)預測基于RNA的腫瘤表達特征值。具體而言，作者發(fā)現(xiàn)了150個基于DNA的多特征標簽，可追蹤各種乳腺癌生物學過程，具有較高的預測性能。這一發(fā)現(xiàn)為使用血液中ctDNA信息來獲取單一基因改變和腫瘤部分以外的臨床相關(guān)信息提供了可能。
今天分享的這篇文獻正是該團隊延續(xù)了前期的工作，進行了更深入的分析，從而證明復雜的腫瘤表型特征可以在ctDNA中被識別，并可能與晚期乳腺癌的臨床相關(guān)。基于ctDNA的多基因標記方法為發(fā)現(xiàn)和鑒定生物標志物開辟了潛在途徑，特別是在液體活檢變得普遍的晚期疾病場景中。
知識補充
乳腺癌是一種非常復雜的疾病，因此也產(chǎn)生了非常多的專業(yè)名詞，為了便于非乳腺癌領(lǐng)域的小伙伴理解，在進入正文之前進行簡單知識補充，熟悉乳腺癌的小伙伴可直接略過本節(jié)。
1.乳腺癌分型
被診斷乳腺癌后，最重要的問題之一，就是知道到底是哪一種乳腺癌。具體而言，就是要知道分型和分期。乳腺癌的分型有兩大方法，一是病理分型，二是分子分型。
2.基于ER、PR、HER2及Ki67的臨床分型
雌激素受體 （ER）、人類表皮生長因子受體 2（HER2）、孕激素受體（PR）是常見乳腺癌免疫組化指標，也是最經(jīng)典的乳腺癌分型系統(tǒng)。根據(jù)它們表達的陽性和陰性，形成了不同的組合，如下。
理論上，根據(jù)3個基因的表達狀態(tài)不同，應該有2x2x2=8種，分為三陰性、三陽性、二陽性（3種），一陽（3種），但這種分型方法臨床意義不大，因此較少用。
實際情況是，ER和PR合稱激素受體（HR），乳腺癌被分為3種，
不難看出，除了上述5種（1+1+3）情況，還有3種情況目前在臨床上并沒有被明確定義（即表格中沒有著色的部分）。臨床上根據(jù)PR表達水平高低，進一步將HR陽性分為Luminal A型（PR高表達，PR++，＞20%）和Luminal B型（PR低表達，PR+或PR-，＜20%）。有趣的是，三陽性乳腺癌也被定義為Luminal B型。
此外， Ki-67 （增殖指數(shù)）是與細胞增殖有關(guān)的指標，陽性率越高，腫瘤生長越快，組織分化越差，對化療也越敏感。Ki-67是Luminal A和B型分類診斷的關(guān)鍵，Ki-67<14%為低表達。所以針對Luminal A/B分型來講，最準確的評判標準應如下圖：
3.基于PAM50分型
PAM50全稱是“Prediction Analysis of Microarray 50”，2009年由Parker提出的[1]，只需要測定50個基因的表達量即可對乳腺癌病人進行初步分類（具體是哪50個基因，感興趣的小伙伴可以自行查閱，此處不贅述）。PAM50可揭示傳統(tǒng)分子分型中的ER和HER2異質(zhì)性問題，但因為PAM50分子分型需要使用芯片技術(shù)，價格昂貴以及未在國內(nèi)授權(quán)等原因，目前在國內(nèi)臨床實踐中應用較少。
PAM50乳腺癌分型:
Luminal A(管腔A型)：激素受體陽性、HER2陰性、低表達Ki-67。腫瘤進展慢，有相對更好的預后。
Luminal B(管腔B型)：激素受體陽性、HER2陽性或陰性、高表達Ki-67。腫瘤進展比管腔A型快，預后稍差。
Basal-like(基底樣)：激素受體陰性、HER2陰性。在年輕和非裔美國女性患者中普遍存在BRCA1基因突變。
HER2-enriched (HER2富集型)：激素受體陰性、HER2陽性。比管腔型進展快，預后差。但通常使用靶向HER2蛋白的藥物后有良好的治療效果。
4.分型、治療與預后
不同類型的乳腺癌，無論從治療方法，還是預后都是非常不同的。以最經(jīng)典的基于ER、PR、HER2的臨床分型為例：
1）激素受體陽性乳腺癌（HR陽性乳腺癌）：乳腺癌中最常見的一類，占60%~70%，也是發(fā)展最緩慢的一種亞型，整體預后較好。治療方法主要采用手術(shù)+化療+內(nèi)分泌治療。因為這類乳腺癌的生長離不開激素，因此通過藥物抑制體內(nèi)雌激素活性，通常能很好地抑制癌癥生長。最常用的藥物是抗雌激素（比如他莫昔芬）或芳香化酶抑制劑。
2）HER2陽性乳腺癌：占乳腺癌的20%，這種亞型的乳腺癌過量表達癌蛋白HER2。這種類型比上一種生長更快，也更容易轉(zhuǎn)移。對于這類病人的治療通常是手術(shù)+化療+HER2靶向藥治療。
3）三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）：最少見，大概只占10%，但這是最讓人頭痛的一類，預后最差。一方面，它激素受體或HER2都是陰性，因此內(nèi)分泌治療和HER2靶向治療對它都無效，一般只能靠化療藥物，效果不理想。另一方面，它又恰巧是所有乳腺癌中最惡性的一種，發(fā)展迅速，容易轉(zhuǎn)移和復發(fā)。
5.CDK4/6抑制劑治療
CDK4、CDK6是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶，在某些情況下，CDK4、CDK6過渡表達，導致細胞過度增殖（腫瘤發(fā)生）。因此一旦CDK4、CDK6過度表達時，即在人身上出現(xiàn)腫瘤：比如乳腺癌?？谷橄侔┧悸分痪褪牵和ㄟ^抗CDK4、CDK6來抑制細胞進入增殖周期，達到抑制腫瘤細胞增殖的目的，即針對CDK4、CDK6的靶向藥物——CDK4、CDK6抑制劑。
假如病人得了乳腺癌，免疫組化提示：CDK4、CDK6過表達，則可通過CDK4、CDK6抑制劑達到抗腫瘤作用。當然不是所有的CDK4、CDK6陽性病人都可選擇CDK抑制劑治療。我們還是以ER、PR、HER2的臨床分型為例：
1）激素受體陽性乳腺癌，尤其是ER陽性：內(nèi)分泌治療是主要手段之一，內(nèi)分泌治療在某些情況下回產(chǎn)生耐藥，而研究表明CDK4/6可能是逆轉(zhuǎn)ER陽性乳腺癌患者內(nèi)分泌耐藥的潛在治療靶點。
2）HER2陽性乳腺癌： 迄今還沒有相關(guān)的臨床研究數(shù)據(jù)能夠證實CDK4 /6抑制劑在 HER-2陽性乳腺癌患者中的確切療效。
3）三陰性乳腺癌（TNBC）：CDK4 /6抑制劑對大部分 TNBC 患者的療效并不佳。 目前為止還沒有足夠證據(jù)能夠證明， TNBC 患者可從CDK4 /6抑制劑的治療中獲益。
可見，CDK4 /6抑制劑目前主要用于ER+ /HER2-患者，一線內(nèi)分泌治療本身就可給部分患者帶來較好的臨床預后，并且毒副反應較小，而聯(lián)合CDK4/6抑制劑提高療效的同時，也必將增加了毒副反應及治療成本，因此對此類患者選擇CDK抑制劑時需權(quán)衡利弊。
數(shù)據(jù)來源
為了證明ctDNA可以追蹤復雜的腫瘤表型，將150個先前定義的基于DNA的多特征標簽應用于Plasma-1隊列，該隊列數(shù)據(jù)集其由246個血漿樣本組成，進行0.5X淺層全基因組測序（shWGS）。其中，大多數(shù)樣本（n = 209）來自174例晚期HR+/HER2-乳腺癌患者。除此之外，還有其他臨床亞型的樣本，包括來自16名晚期HER2陽性（HER2+）患者的19個血漿樣本，來自16名晚期三陰性乳腺癌（TNBC）患者的17個血漿樣本，以及來自1名晚期HR和HER2狀態(tài)未知患者的血漿樣本。
根據(jù)ichorCNA工具，246個血漿樣本中有178個的腫瘤細胞分數(shù)（TF）≥3%，表明其存在腫瘤。在TF≥3%的血漿樣本中，檢測了514個DNA片段的信號，確定了先前報道的150個DNA標簽的得分，旨在預測腫瘤RNA和蛋白質(zhì)表型。與預期一致，作為一個連續(xù)變量，TF被發(fā)現(xiàn)與每個樣本中CNA片段數(shù)量具有很強的相關(guān)性。
結(jié)果解讀
1.基于血漿和組織DNA的特征
在8周（或8周以上）時間范圍內(nèi)，使用血漿ctDNA（經(jīng)TF調(diào)整）檢測了150個DNA標簽與54例患者腫瘤組織DNA的相關(guān)性。在150個DNA標簽中，腫瘤和血漿之間的平均相關(guān)系數(shù)為0.40（范圍為0.02至0.66），40個DNA標簽（26.7%）的相關(guān)系數(shù)≥0.50。8周內(nèi)獲得血漿和腫瘤的27例患者中，相關(guān)系數(shù)≥0.50的DNA標簽數(shù)為63（42%，8周以上DNA標簽數(shù)比例為19.3%），包括所有患者中相關(guān)系數(shù)≥0.50的40個標簽中的36個。兩個高度相關(guān)的DNA標簽是UNC_8q_Amplicon和UNC_Scorr_P53_Mutation。以上結(jié)果表明，在不同的時間點和DNA測序方法之間，ctDNA和腫瘤DNA特征存在中度關(guān)聯(lián)。
為進一步證明血漿中基于CNA的數(shù)據(jù)可以用于識別與組織中相似的生物學狀態(tài)，作者計算了54個配對樣本（腫瘤組織與血漿）中基于CNA的514個DNA片段信號的患者內(nèi)部相關(guān)性。結(jié)果顯示，57%的患者血漿與組織之間存在大于0.50的相關(guān)系數(shù)；當對29例血漿TF>10%的患者進行評估時，該相關(guān)系數(shù)增加到83%。上述結(jié)果表明，血漿ctDNA能夠可靠地從腫瘤組織中捕獲CNA信號，盡管ctDNA的數(shù)量可能會影響完其預測能力。
2.基于ctDNA的數(shù)據(jù)與基于組織RNA表達的數(shù)據(jù)
對血漿中TF≥3%的108例患者，從福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)組織標本中基于PAM50亞型獲得了RNA的表達數(shù)據(jù)。為了進一步探討ctDNA與RNA表達之間的關(guān)聯(lián)，作者評估了6個基于PAM50 RNA的組織標簽與150個基于ctDNA的標簽（通過TF調(diào)整）的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)基于ctDNA的標簽與已知的生物學特征（基于PAM50亞型分類的生物學特征）呈正相關(guān)或負相關(guān)。如，基于ctDNA的RB-LOH標簽（富集于E2F靶基因，追蹤腫瘤增殖率），與基于PAM50 RNA的Basal樣、HER2富集和增殖特征呈正相關(guān)，而與基于PAM50 RNA的Luminal A特征呈負相關(guān)。
3.基于ctDNA的標簽和腫瘤組織ER和HER2狀態(tài)
為了評估基于ctDNA的標簽與ER或HER2狀態(tài)之間的關(guān)系，作者在TF≥3%的178個樣本中選擇了ER和HER2 狀態(tài)已知的177個樣本進行分析。與預期一致，基于ctDNA追蹤管腔生物學特征的標簽在ER陽性(ER+)乳腺癌患者中富集，基于ctDNA追蹤HER2過表達和擴增的標簽在HER2陽性（HER2+）乳腺癌患者中顯著富集。總之，這些結(jié)果表明基于ctDNA的分析可以捕獲并預測特定的腫瘤表型特征。
4.轉(zhuǎn)移性HR+/HER2-疾病中的ctDNA信號
為評估每個基于ctDNA的標簽與患者預后的相關(guān)性，作者分析了124例接受內(nèi)分泌治療和CDK4/6抑制劑治療的晚期HR+/HER2-乳腺癌患者的基線治療前血漿樣本 （CDK-Validation-1隊列）（圖7a）。在150個基于ctDNA的標簽（經(jīng)TF調(diào)整）中，有36個和37個分別與無進展生存期（PFS）和總生存期（OS）顯著相關(guān)；有27個與PFS和OS均有明顯關(guān)聯(lián)。其中，基于ctDNA追蹤RB-LOH高評分的標簽被發(fā)現(xiàn)是與不良預后和治療反應相關(guān)的頂級生物標志物之一（圖7b-c）。由于RB缺失是對CDK4/6抑制劑耐藥的已知機制，作者決定關(guān)注這個特征，它由224個拷貝數(shù)組成。多變量分析顯示，RB-LOH標簽與PFS和OS相關(guān)，與TF、CDK4/6抑制劑的類型、治療方案、內(nèi)臟疾病的存在和轉(zhuǎn)移位點的數(shù)量無關(guān)（圖7d）。此外，作者還檢測了RB-LOH標簽16個特征的平均ctDNA信號（圖7e）。最后，作者在接受內(nèi)分泌治療和CDK4/6抑制劑治療的7例晚期HR+/HER2-乳腺癌患者的配對血漿樣本中評估了150個基于ctDNA標簽(經(jīng)TF調(diào)整)的評分(即基線和疾病進展后的治療后評分)(圖7f)。
5.基于ctDNA對轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者分型
為確定150個基于ctDNA的標簽（經(jīng)TF調(diào)整）是否可以識別具有臨床相關(guān)性的乳腺癌亞型，作者對178個TF≥3%血漿樣本中的150個標簽進行了無監(jiān)督的分層聚類分析，共確定了四個主要聚類（圖8a）。與其他聚類相比，標簽PAM50 Luminal A和HER2-enriched在聚類3中存在差異表達(圖8b)。作者還評估了4種聚類與CDK4/6聯(lián)合治療反應和內(nèi)分泌治療敏感性之間的關(guān)系（圖8c）。接下來，作者評估了4個聚類在CDK-Validation 1和2隊列中的預后價值。與聚類1相比，聚類2、3和4的PFS明顯較差，聚類3還與更差的OS顯著相關(guān)（圖8d）。
6.組織樣本中基于 ctDNA的腫瘤分型
為了探討將基于血漿ctDNA確定的腫瘤分型應用于基于腫瘤組織DNA分型時的表現(xiàn)，作者使用來自公開數(shù)據(jù)庫的兩個數(shù)據(jù)集（METABRIC、MSK-IMPACT）作為驗證隊列，將基于ctDNA分型的預測因子（圖8a）應用于上述隊列，在兩個隊列中都確定了4個主要聚類，這些聚類顯示了跨染色體的DNA信號（圖9a-b）。與其他聚類相比，METABRIC隊列中的PAM50非管腔亞型和TP53體細胞突變均在聚類3中富集(圖9c-d)。最后，在MSKCC隊列中，分析了4個主要聚類與乳腺癌患者生存預后的關(guān)系(圖9e)。
本章小結(jié)
作者先前通過對TCGA早期乳腺癌數(shù)據(jù)集的計算機輔助監(jiān)督學習分析，已確定了150個基于DNA拷貝數(shù)的多特征預測因子。在該最新研究中，作者使用轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的血液樣本預測了復雜的腫瘤表型，探索了上述預測因子是否適用于ctDNA液體活檢。結(jié)果表明，復雜的腫瘤表型性狀可以在ctDNA中鑒定，并可能提供臨床價值。總而言之，基于ctDNA的多基因標記方法為生物標志物的發(fā)現(xiàn)、驗證和其在腫瘤學中的應用帶來了新的機會。
文獻延伸
1.NEJM：ctDNA指導結(jié)腸癌化療
這是第一項基于ctDNA的結(jié)腸癌術(shù)后輔助治療隨機對照試驗，作者發(fā)現(xiàn)采用ctDNA水平指導的Ⅱ期結(jié)腸癌輔助治療，即對術(shù)后ctDNA陽性患者采取輔助治療，而對ctDNA陰性患者不采取輔助治療，與傳統(tǒng)臨床病理指導的治療方法相比有著相似的復發(fā)預防效果，但能顯著減少輔助治療的應用。Ⅱ期結(jié)腸癌患者的術(shù)后輔助化療決策一直是臨床上的一大難題，這項研究為Ⅱ期結(jié)腸癌患者的術(shù)后輔助治療決策提供了直接依據(jù)。該成果在2022年6月發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學雜志》（NEJM）上。
2.Nat Med：ctDNA可以預測非小預后并指導靶向治療
紀念斯隆·凱特林癌癥中心（MSKCC）的研究人員在一項大型前瞻性NSCLC國際隊列中，驗證了ctDNA陽性結(jié)果與更低的總生存率（OS）有關(guān)，且獨立于臨床病理特征和腫瘤代謝體積，接受ctDNA測序后匹配的靶向治療的患者相比未接受的，OS更高?？傊?，這項研究表明，ctDNA一方面可以作為一個獨立的OS預測因素，另一方面還可以指導NSCLC患者的靶向治療用藥，改善患者預后。該成果在2022年11月發(fā)表在《自然·醫(yī)學》（Nature Medicine）雜志。
3.Ann Onc：ctDNA在四種常見癌癥中的預后價值：真實世界結(jié)果研究
這是一項真實世界研究，樣本來自美國多腫瘤隊列，覆蓋的疾病類型包括轉(zhuǎn)移性去勢抵抗前列腺癌（mCRPC）、轉(zhuǎn)移性乳腺癌（mBC）、晚期（IIIB-IV期或進展/復發(fā)）非小細胞肺癌（aNSCLC）以及轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（mCRC），證實了血漿 ctDNA具有預測晚期腫瘤患者生存預后的潛在價值，并指導臨床圍繞預期的治療結(jié)果進行個體化干預。該成果2022年10月發(fā)表在《Annals of Oncology》雜志上。
結(jié)語
通過今天的分享，我們可以知道，“滴血驗癌”并不是驚天騙局，而是有跡可循。在不久的將來，人們可能不再是談“癌”色變，通過滴血驗癌這種無創(chuàng)方式進行早篩，盡早發(fā)現(xiàn)，盡早治療，彼時，恐怕這種黑科技才能真正稱得上是醫(yī)學奇跡吧！準確點講，滴血驗癌的對應的專業(yè)名詞應該是“液體活檢”，指一種非侵入式的血液測試來監(jiān)測腫瘤或轉(zhuǎn)移病灶釋放到血液中的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）和循環(huán)腫瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）碎片的方法。閱讀至此的小伙伴，僅2022年就有多篇關(guān)于ctDNA的重磅研究，我們做科研是不是也可以借一借這"東風"呢？
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