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從生信的視角揭示癌癥的前世今生:癌前病變篇
今天分享的文章，于2023年3月13日，在Cell Discovery（IF=38）發(fā)表，題為“Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma”的研究論文，該研究通過單細胞測序聯(lián)合空間轉(zhuǎn)錄組，揭示了口腔粘膜癌前病變轉(zhuǎn)化為鱗癌過程中的腫瘤細胞發(fā)育分化與細胞互作，以及促癌機制。
總之，該研究數(shù)據(jù)和結(jié)果為進一步的OSCC研究和癌癥干預的潛在策略的發(fā)展提供了參考，為在癌前病變階段提前干預，為高危人群早期篩查和個性化預防措施的建立提供理論依據(jù)，具有重大臨床意義!
背景
單細胞RNA測序(scRNA-seq)能夠分離細胞亞群，并探索與疾病發(fā)展或治療相關的特定特征和因素，特別是在完全成熟的癌癥中。空間轉(zhuǎn)錄組學(ST)的最新進展已經(jīng)能夠同時獲取空間組織信息和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從而在特定組織或疾病發(fā)展過程中產(chǎn)生全面的、時空的基因表達視圖。該研究在上皮細胞中發(fā)現(xiàn)了一組啟動相關基因，以及啟動相關的成纖維細胞和免疫亞簇，它們的協(xié)同作用促進了癌變。
口腔粘膜白斑（OLK），特別是伴有中度至重度不典型增生的口腔白斑病是最常見的癌前病變之一，有助于口腔鱗狀細胞癌（OSCC）的發(fā)生。然而，癌前病變的細胞組成和空間組織以及這些因素如何促進人類OSCC的發(fā)生仍不清楚。
結(jié)果
1.正常，OLK和腫瘤的組織scRNA-seq和ST分析
用無監(jiān)督聚類識別細胞的11個主要簇，并由簇特異性標記基因注釋（圖1d–1e）。
將細胞類型的比例/豐度用熱圖展示,及特定細胞類型標記的代表性表達特征（圖1g,1h）。
2.上皮細胞高拷貝數(shù)變異(CNV)、FRA和mTORC1信號評分與OSCC起始的相關性
將整個上皮細胞根據(jù)表達狀態(tài)再次聚類(圖2a)。聚類結(jié)果顯示，大多數(shù)亞簇彼此之間的距離較近(C1)，小部分亞簇分散分布(C2)， C2中的大部分細胞來自T區(qū)(圖2a)。
CNV的統(tǒng)計評分顯示，DN和T區(qū)的上皮細胞CNV逐漸富集(圖2b)。在空間特征圖的DN和T區(qū)域證實了糖酵解、缺氧和DNA錯配修復等癌癥形成相關的通路的總體豐度趨勢(圖2c)。
GO分析顯示N、DN、T階段上皮細胞中表達趨勢增加的不同表達基因(DEGs)，發(fā)現(xiàn)OSCC起始過程中EMT、mTORC1、FRA通路逐漸富集(從N、DN到T組)(圖2d)。
ST數(shù)據(jù)的評分顯示了FRA和mTORC1通路的相似變化趨勢(圖2e, 2c)。
CellphoneDB分析顯示從DN期到T期，上皮細胞與周圍基質(zhì)細胞頻繁的細胞互作，然而在N期卻很少(圖2f)。
3.識別參與調(diào)節(jié)OSCC啟動過程的相關上皮標記物
通過scRNA-seq鑒定出8個啟動相關基因(8個基因集)，并使用ST圖進行驗證，包括:CTSC、FADD、ITGB4、LGALS1、LY6K、PMEPA1、TFAP2A和TGFβI(圖2g、2h、2i)。
值得注意的是，TFAP2A編碼FRA通路中的轉(zhuǎn)錄因子(TF)， LY6K編碼淋巴細胞抗原，CTSC是半胱氨酸組織蛋白酶家族的成員，LGALS1編碼半乳糖凝集素調(diào)節(jié)細胞-細胞/基質(zhì)相互作用(圖2h)。
通過ST特征圖和組織學染色驗證了TFAP2A在上皮細胞中隨OSCC起始逐漸升高的表達趨勢(圖2j, 2k)。
在體外OLK類器官中，敲除TFAP2A后，增殖減慢，其他啟動相關基因的表達降低(圖2l、2m)。這可能反映了TFAP2A在調(diào)控OSCC啟動中的潛在作用。
雖然TFAP2A和LY6K有望在DN階段識別或預防早期SCC，但仍需進一步評估其在OSCC起始中的臨床價值。
4.成纖維細胞亞簇主導OSCC起始，在空間上更接近上皮細胞
根據(jù)作者的數(shù)據(jù)和先前的研究，成纖維細胞被分為三個主要的亞群:Mesen_CAF、Infla_CAF和cycling_caf25,26(圖3a)。
Mesen_CAF亞群具有高度積累的細胞外基質(zhì)(ECM)基因(ASPN、POSTN和TNC)和間充質(zhì)促進TF (TWIST2)；Mesen_CAF同時富集生長因子，包括非經(jīng)典WNT通路(APCDD1、PMEPA1和WNT5A)和趨化因子標記物(CCL2和IL1R1)；Infla_CAF亞簇富集經(jīng)典基質(zhì)細胞衍生因子CXCL12，并表現(xiàn)出激素和代謝相關標記物(IGF1和CFD)的增強表達(圖3b)； Cycling_CAF居群小，富集MKI67、CDK1和UBE2C基因，這些基因均與細胞增殖有關。
這些亞簇表現(xiàn)出經(jīng)典CAF標記的強表達:DCN、FAP、PDGFR-α/β、S100A4和VIM27(圖3c, 3d)。
ST特征圖和相應的標記染色區(qū)域大小統(tǒng)計分析顯示，在OSCC起始階段，Mesen_- CAF標記的表達區(qū)域豐度比Infla_CAFs增加了3倍以上，并呈逐漸增加的趨勢(圖3e-3g)。Mesen_CAF廣泛分布于上皮區(qū)，而Infla_CAF則更多分布于板層區(qū)，提示Mesen_CAF參與了上皮細胞的癌變(圖3e, 3f)。
在這兩個成纖維細胞亞簇中，針對一些癌癥形成相關通路使用GO基因集富集，結(jié)果顯示Mesen_CAF在TGFβ、EMT、血管生成和PI3K-AKT-mTOR通路中富集(圖3h)。
CellphoneDB分析推斷這些細胞之間的細胞通訊，如CSF1-CSF1R, TNC-a4b1復合物和TGFβ-TGFβR相互作用，可能參與免疫細胞招募和激活，以及促進Mesen_CAF膠原的形成。綜上，scRNA-seq和ST數(shù)據(jù)都揭示了成纖維細胞亞簇在癌變中的作用。
5.免疫細胞亞群及細胞互作分析
通過空間特征圖，分析免疫細胞的分布，標記物染色區(qū)域定量結(jié)果顯示，LYZ(髓系細胞標記物)和CD14(單核細胞標記物)比CD4A和CD8兩種T細胞標記物更豐富，傾向于具有免疫耐受的“冷腫瘤”(圖4a, 4b)?；贖LA-DRs+和CD14 -為特征，鑒定了在髓系簇中的DC細胞，并進一步分類；基于CD68和CD14的高表達鑒定了單核細胞(圖4c)。
單核細胞亞簇中的Mono_INHBA和Mono_NLRP3在IL1B和IL6中高度富集，這兩種細胞都是促炎癥、血管生成和巨噬細胞極化為M2的關鍵調(diào)節(jié)因子(圖4d)；然而，Mono_INHBA亞群表現(xiàn)出高表達的抗炎因子(圖4d)；Mono_INHBA的混合表型與報道的單核細胞髓源性抑制細胞(M_MDSCs)具有高度相似性。
多重免疫組化(mIHC)染色進一步驗證了Mono_INHBA的富集，DN期的細胞分數(shù)最高(圖4f，4g)。
耗竭的CD8+ T細胞(CD8+ Tex)在DN期對Mono_INHBA的募集至關重要，因為Mono_INHBA在空間上更接近CD8+ Tex，它們通過CSF1-CSF1R相互作用對相互作用最強(圖4h)。
CellPhoneDB分析表明，Mono_INHBA通過INHBA-ACVR_1A/ 2a、SPP1-CD44和VEGFA-NRP1/ NRP2配體受體對與CAFs進行通信(圖4j)。
在體外，通過將THBS1添加到OLK類器官中來模擬它們的相互作用，結(jié)果表明THBS1促進上皮細胞增殖和上述啟動相關基因的表達(圖4k, 4l)。
所有結(jié)果均表明，Mono_- INHBA被招募到DN區(qū)域，并通過與整個生態(tài)系統(tǒng)的頻繁通信“啟動”癌癥的形成。
6.參與了癌前病變轉(zhuǎn)化為腫瘤期的免疫細胞亞群分析
在T區(qū)，Mesen_CAFs在每個個體中一個簇(cluster 2)的比例明顯增加(圖5a，5b)。
ST特征圖和統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示Mesen_CAF特征基因在腫瘤區(qū)域穩(wěn)定富集(圖5c)，Macro_NRG1和Macro_APOE的比例在每個個體中從DN期到T期都有所增加(圖5d, 5e)。
ST數(shù)據(jù)顯示M2-like巨噬細胞和血管生成通路從DN期到T期呈增加趨勢，并且與啟動相關基因上皮CTSC的表達水平高度相關(圖5f，5e)。
通過偽時間和RNA速度分析，預測了從組織駐留樣巨噬細胞Macro_SELENOP獲取Macro_APOE/NRG1的可能軌跡。ST特征和統(tǒng)計數(shù)據(jù)證實了OSCC啟動過程中TNFRSF4+ Tregs、TNFRSF4表達和占比的增加趨勢(、5k、5l)，CD8_Tem與TNFRSF4+ Treg從N期到T期，占比逐漸下降，說明它們在OSCC啟動過程中參與了免疫耐受(圖5i-5j)。
mIHC染色進一步證實了這些免疫細胞參與了DN期到t期轉(zhuǎn)變過程中(圖5m)?？傊?，這項研究揭示了CAF和免疫細胞亞簇在重塑OSCC起始階段從DN到T階段的微環(huán)境中的關鍵作用。
7.DN期周圍VEGF信號通路的空間調(diào)控
在CellphoneDB分析顯示上皮分泌的VEGFA自DN期起就與間質(zhì)細胞上的受體相互作用，VEGFA在N和DN區(qū)上皮上層高表達，但從DN到T區(qū)無層限制(圖6a，6b)。
在病理專家的指導下，根據(jù)角化過度和發(fā)育不良這兩種OLK的相同特征分別在上皮的上層和下層啟動，將N和DN區(qū)的上皮分為2部分，相互作用分析顯示與N和DN區(qū)域下層相比，VEGFA信號在上層表現(xiàn)出明顯的表達量增強(圖6c，6d)。
總的來說，轉(zhuǎn)錄組和染色結(jié)果表明，VEGFA和TGFβ1信號在OSCC起始中具有重要作用，在DN階段周圍VEGFA具有空間表達調(diào)控。
8.確定的免疫亞群在OSCC起始的臨床意義
mIHC染色證實，新生的輕度OLK具有輕度TGFβ信號，免疫抑制髓系細胞浸潤有限，而中重度不典型增生的OLK中則相反(圖7a，7b)。
動物實驗再次證實上述結(jié)果。在免疫健全的小鼠中建立了4-硝基喹啉-1氧化物(4NQO)誘導的致癌模型，探討這些已鑒定的細胞亞簇在體內(nèi)的功能，作者針對其功能進行了抗TGFβ和抗PD-1抗體的干預。分組和歸納方法顯示在流程圖(圖7c)。第20周時，作者發(fā)現(xiàn)所有治療組(抗PD -1/抗TGFβ/抗PD-1+抗TGFβ組)與未治療組相比，明顯表現(xiàn)出較輕的病變，表明這些抗體對OSCC啟動的干預作用(圖7d,7e,7f)。
以上數(shù)據(jù)表明，抗PD -1抗體和這些免疫抑制因子抑制劑對OSCC啟動的干預治療的有效性。
