單細(xì)胞測(cè)序助力免疫紅細(xì)胞亞群

導(dǎo)讀

眾所周知，紅細(xì)胞是動(dòng)物體內(nèi)血細(xì)胞中數(shù)量最多、作用最強(qiáng)的細(xì)胞。它能夠攜帶氧氣和二氧化碳，使人體內(nèi)部碳氧量保持平衡。紅細(xì)胞被認(rèn)為是非免疫細(xì)胞，非免疫細(xì)胞也可以在人體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。然而，紅系細(xì)胞在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中免疫調(diào)節(jié)功能的分子和細(xì)胞機(jī)制仍然不清楚。

背景知識(shí)

下文中，作者對(duì)來(lái)自人卵黃囊、胎肝、早產(chǎn)兒臍血(UCB)、足月臍帶血(UCB)和成人骨髓(BM)的紅系細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究，發(fā)現(xiàn)紅系前體的經(jīng)典和免疫亞群具有不同的分化軌跡。在整個(gè)人類個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，免疫紅系細(xì)胞從卵黃囊到成年骨髓都存在，但在體外不能從人類胚胎干細(xì)胞中產(chǎn)生。與經(jīng)典紅系前體細(xì)胞相比，這些免疫紅系細(xì)胞具有紅系和免疫雙重調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，免疫紅系細(xì)胞與各種免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞相互作用更頻繁。

結(jié)果解讀

scRNA-seq分析確定了一個(gè)有免疫傾向紅系亞群

作者首先對(duì)卵黃囊（YK）、胎肝（FL）和足月新生兒臍帶血（UCB）不同發(fā)育階段進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。然后，作者在每個(gè)發(fā)育階段從這些定義的紅系簇中提取Gypa表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞(Gypa⁺)，用于進(jìn)一步分析。Gypa⁺細(xì)胞主要由紅系前體細(xì)胞組成，包括前紅細(xì)胞、嗜堿性紅細(xì)胞、多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞，Gypa⁺紅系前體的降維和無(wú)監(jiān)督聚類產(chǎn)生了表達(dá)紅系特異性基因(GypA、HBE1、HBG2和HBB)的四個(gè)主要簇(C1-C4) (圖1a-c)。為了研究這些簇的生物學(xué)相關(guān)性，作者用每個(gè)簇的特征基因進(jìn)行了GO富集分析。C1與mRNA分解代謝、翻譯啟動(dòng)和RNA剪接有關(guān)(圖1d，e)；C3具有活躍的細(xì)胞周期，核分裂和有絲分裂細(xì)胞周期過(guò)程顯著富集(圖1d，e)；C3具有氧氣轉(zhuǎn)運(yùn)和珠蛋白基因表達(dá)(圖1d，e)，表明C3中的細(xì)胞比C1和C2中的細(xì)胞成熟。C4獨(dú)特地富集到了與免疫活性有關(guān)的條目，如抗原處理和呈遞(例如，HLA-DRA、HLA-E和CD74)(圖1e)。RNA速率分析有助于通過(guò)區(qū)分未剪接和剪接mRNAs來(lái)預(yù)測(cè)單個(gè)細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)，這表明紅系細(xì)胞從C1到C3(圖1f)逐漸成熟，這與紅系成熟評(píng)分一致。而C4紅系細(xì)胞顯示出不同的發(fā)展軌跡(圖1F)，這通過(guò)PAGA (partition-based graph abstraction，該軌跡分析可以估計(jì)了集群之間的連通性)軌跡分析(圖1G)進(jìn)一步驗(yàn)證。綜上所述，對(duì)紅系前體細(xì)胞的scRNA-seq分析可以將有核紅系細(xì)胞分為經(jīng)典紅細(xì)胞簇(C1-C3)和免疫紅細(xì)胞團(tuán)簇（C4）。

YS、FL和UCB紅系前體細(xì)胞的獨(dú)特特征

為了研究人類紅系細(xì)胞在不同發(fā)育階段中的分子變化，作者對(duì)來(lái)自不同發(fā)育階段的細(xì)胞進(jìn)行了比較分析。如圖2a-c，差異表達(dá)基因（DEGs）的GO富集分析表明YS、FL和UCB中C1、C2和C3在代謝過(guò)程的特征。其中，金屬硫蛋白基因MT2A、MT1G和MT1H以及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZNT(SLC30A)和ZIP(SLC39A)的表達(dá)是YS-C3細(xì)胞的特征(圖2c，d)?；蚣患治?GSEA)和基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)證實(shí)了與金屬離子穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因在YS-C3細(xì)胞中的高表達(dá)(圖2e)。此外，YS-C3細(xì)胞還富集到了與糖酵解、核糖體生物發(fā)生和G2/M期轉(zhuǎn)變相關(guān)的基因(圖2f-h)。另外，通過(guò)比較分析，作者發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的YS紅系細(xì)胞可能是支持胚胎發(fā)育的關(guān)鍵金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體，也可能是確保向胚胎提供金屬供應(yīng)的儲(chǔ)存庫(kù)。

圖2 YS、FL和新生兒uCB經(jīng)典紅系前體細(xì)胞的獨(dú)特發(fā)育特性

在hESC衍生的紅細(xì)胞生成中，缺乏免疫傾向的細(xì)胞

人類胚胎干細(xì)胞(hESC)向紅系分化可用于研究早期胚胎紅細(xì)胞的生成。為此，作者用白細(xì)胞介素3(IL-3)、干細(xì)胞因子(SCF)、促紅細(xì)胞生成素(EPO)和地塞米松誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向紅系分化。在分化第14天，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GypA⁺CD71⁺細(xì)胞（圖3a）。將第4天、第11天和第16天的Gypa⁺紅系細(xì)胞整合在一起進(jìn)行分析，并將其劃分為三個(gè)簇(hESC-C1至hESC-C3)(圖3b)。特征基因和GO富集分析表明，hESC-C1細(xì)胞與核糖體生物合成相關(guān)(如RPL3、RPS2和RPL12)，而hESC-C3細(xì)胞與氧運(yùn)輸和氣體運(yùn)輸有關(guān)(如HBA1、HBA2和HBG2) (圖3c，d)。在hESC-C1和hESC-C3細(xì)胞中大量表達(dá)的特征基因概括了體內(nèi)C1和C3簇的特征(圖3e)。相關(guān)分析表明，hESC來(lái)源的紅系細(xì)胞與YS和FL來(lái)源的紅系細(xì)胞關(guān)系更密切(圖3f)。與YS-C1至YS-C3細(xì)胞相比，hESC-C1至hESC-C3之間顯示出更高的凋亡率、有絲分裂和鐵死亡 (圖3g，h)。相反，在YS-C1到Y(jié)S-C3細(xì)胞中表達(dá)的基因在一些生物學(xué)過(guò)程中高度富集，如蛋白質(zhì)折疊、RNA分解代謝過(guò)程和線粒體翻譯延長(zhǎng)(圖3g，h)?？傮w而言，hESC來(lái)源的紅系細(xì)胞部分概括了體內(nèi)胚胎紅系細(xì)胞的特征，但未能表現(xiàn)出免疫特征。

圖3 體外培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞與YS、FL和UCB來(lái)源的紅系細(xì)胞的比較分析

免疫紅系細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能

CD71⁺或CD71⁺VISTA⁺有核紅系細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞間直接相互作用或分泌細(xì)胞因子(例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β))來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)(圖4a)。作者在C4亞群中檢測(cè)到VSIR(編碼VISTA)和TGFB1的高表達(dá)，以及IL1B、IL7和TNFSF10等細(xì)胞因子基因的表達(dá)(圖4b)。在C4細(xì)胞中，與免疫受體活性相關(guān)的基因的表達(dá)普遍較低(圖4c)，這表明它們產(chǎn)生免疫信號(hào)并將其傳遞給其他細(xì)胞。接下來(lái)，作者使用單細(xì)胞調(diào)控網(wǎng)絡(luò)推理和聚類(SCENIC)來(lái)識(shí)別經(jīng)典紅系簇(C1-C3)和免疫紅系簇(C4)中的主要調(diào)節(jié)子和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRN)（圖d-e）。為了在實(shí)驗(yàn)中捕獲免疫紅系細(xì)胞，作者篩選了在C4細(xì)胞中高表達(dá)和特異表達(dá)的表面標(biāo)記。CD63在C4細(xì)胞中的表達(dá)最高(圖4f)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，Gypa⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞在FL和UCB中分別占2.58%和6.36% (圖4G-I)。FL組織切片的免疫組織化學(xué)(IHC)染色檢測(cè)Gypa⁺紅系前體細(xì)胞CD63的表達(dá)(圖4J)。作者對(duì)分選的FL Gypa⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq。非監(jiān)督聚類劃分了不同的經(jīng)典簇和免疫簇(圖4k)。免疫簇中的細(xì)胞比經(jīng)典簇中的細(xì)胞有更高的免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，占免疫表型定義的GypA⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞室總數(shù)的77.9%(圖4 l，m)。因此，免疫紅系C4細(xì)胞在免疫表型定義的GypA⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞室中高度富集。此外，免疫組化染色檢測(cè)到FL組織切片中GypA⁺CD63⁺細(xì)胞表達(dá)免疫標(biāo)志性蛋白，如HLAE和TNF-β(圖4n)。為了深入了解免疫紅系前體細(xì)胞的功能，分離了UCB-GypA⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞，與外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)，在經(jīng)LPS處理的GypA⁺CD71⁺CD63⁺-PBMC培養(yǎng)中，促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加，包括IL-8、IL-6、腫瘤壞死因子、MIP-1α和MIP-1β(圖4o)。將GypA⁺CD71⁺CD63⁺和GypA⁺CD71⁺CD63^?細(xì)胞與CD11b⁺PBMC共培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色顯示，與GypA⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD11b⁺細(xì)胞中腫瘤壞死因子的表達(dá)增加(圖4p，q)。綜上所述，免疫偏向的紅系前體發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，參與免疫細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

免疫紅系細(xì)胞在成人骨髓中持續(xù)存在

為了研究成人骨髓中免疫紅系細(xì)胞亞群的存在，作者從7名健康人的骨髓中分離出GypA⁺ITGA4⁺SLC4A1^+/?紅系前體細(xì)胞。ScRNA-seq鑒定了四個(gè)轉(zhuǎn)錄簇，命名為BM-C1至BM- C4(圖5a，b) 。BM-C4中的DEGs和GO富集分析表明潛在的免疫相關(guān)功能(圖5c)。在BM-C4中高表達(dá)的基因主要與白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、淋巴細(xì)胞激活和吞噬功能的調(diào)節(jié)相關(guān)(圖5c，d)。與經(jīng)典紅系BM-C1至BM-C3簇相比，關(guān)鍵免疫功能基因以及表面標(biāo)志在BM-C4細(xì)胞中高表達(dá)(圖5e)。在成人骨髓中發(fā)現(xiàn)Gypa⁺CD71⁺CD63⁺免疫紅系細(xì)胞(圖5f，g)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色顯示CD11b⁺細(xì)胞與BM Gypa⁺CD71⁺CD63⁺細(xì)胞共培養(yǎng)后TNF表達(dá)增強(qiáng)(圖5h，i)。對(duì)YS、FL、UCB和BM不同發(fā)育階段免疫紅系細(xì)胞的比較分析表明，與成人BM相應(yīng)群體的特征相比，YS、FL和新生兒UCB階段的免疫紅系細(xì)胞具有更大的相似性(圖5j-k)?？傮w而言，具有免疫調(diào)節(jié)功能的免疫前體出現(xiàn)在YS中，并在成年BM中持續(xù)存在

免疫--紅系細(xì)胞主動(dòng)與免疫細(xì)胞相互作用

CD71⁺紅系細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用可以通過(guò)直接的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用來(lái)介導(dǎo)，但很少有配體-受體對(duì)CD71⁺紅系細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞類型的相互作用。為了闡明紅系免疫細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的潛在機(jī)制，作者使用CellPhoneDB對(duì)免疫紅系細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞群體表達(dá)的潛在配體-受體對(duì)進(jìn)行了廣泛的研究，該工具可以從單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)集中預(yù)測(cè)兩種細(xì)胞之間的相互作用?？傮w而言，在所有發(fā)育階段中，免疫紅系和免疫細(xì)胞之間比經(jīng)典紅系和免疫細(xì)胞呈現(xiàn)出更顯著地的細(xì)胞-細(xì)胞間相互作用(圖6a)。具體來(lái)講，細(xì)胞-細(xì)胞相互作用分析證實(shí)了免疫紅系細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間的相互作用(圖6b、c)。另外，與經(jīng)典的紅系細(xì)胞不同，免疫紅系細(xì)胞不僅與巨噬細(xì)胞活躍地相互作用，而且與其他免疫細(xì)胞相互作用 (圖6d-e)。但在不同發(fā)育階段，作者僅在YS免疫紅系細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間檢測(cè)到強(qiáng)烈相互作用(圖6f)。這些數(shù)據(jù)表明，免疫紅系細(xì)胞與各種免疫細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的、活躍的相互作用，這可能是其免疫調(diào)節(jié)功能的基礎(chǔ)。

圖6 免疫紅系前體細(xì)胞與免疫細(xì)胞陣列之間的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。

全文總結(jié)：

該研究構(gòu)建了人類有核紅細(xì)胞從胚胎到成年的全面細(xì)胞圖譜，揭示了人類早期胚胎紅細(xì)胞獨(dú)特的分子特征；還成功鑒定和驗(yàn)證了免疫紅細(xì)胞亞群的存在，開拓了有核紅細(xì)胞的新功能研究領(lǐng)域，免疫紅細(xì)胞亞群作為免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的新成員，有望進(jìn)一步研究它們?cè)诟鞣N疾病中的免疫調(diào)節(jié)作用。

參考文獻(xiàn)

1. Xu C, He J, Wang H, et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies an immune-prone population in erythroid precursors during human ontogenesis. Nat Immunol. 2022.