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在過去的十年，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA-seq）技術(shù)徹底改變了人們對(duì)細(xì)胞異質(zhì)性的認(rèn)識(shí)。從最初的只能應(yīng)用于少量的細(xì)胞，到現(xiàn)在能夠?qū)?shù)千至數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，scRNA-seq對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了重要影響，并成為該領(lǐng)域重要的研究工具。不過，盡管最先進(jìn)的scRNA-seq技術(shù)已經(jīng)足夠敏感，可以高精度地量化和確定細(xì)胞狀態(tài)，但大多數(shù)方法依賴于條形碼寡核苷酸引物與聚腺苷化轉(zhuǎn)錄本poly（A）序列雜交，來(lái)進(jìn)行RNA捕獲和互補(bǔ)DNA（cDNA）合成，這導(dǎo)致一些序列無(wú)法被檢測(cè)到，阻礙了非編碼RNA的差異表達(dá)和選擇性剪切（AS）及選擇性啟動(dòng)子(AP)等層面的分析。因此，小編今天和大家介紹的一篇6月27日剛剛發(fā)表在Nature Biotechnology（IF：68.164）雜志上的文章，文章介紹了最新開發(fā)的 ‘vast transcriptome analysis of single cells by dA-tailing’ （VASA-seq）測(cè)序方法，這一測(cè)序方法能夠克服上述不足。
VASA-seq方法可以在基于平板和液滴微流控的scRNA-seq中捕獲非聚腺苷化和聚腺苷化的轉(zhuǎn)錄組。目前，VASA-seq是唯一一種結(jié)合了高靈敏度、全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組覆蓋和高通量的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)。文章將VASA-seq應(yīng)用于發(fā)育中的小鼠胚胎的3萬(wàn)多個(gè)單細(xì)胞，通過分析整個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)了許多基于非編碼RNA的細(xì)胞類型標(biāo)記，并通過檢測(cè)非聚腺苷化組蛋白基因進(jìn)行了體內(nèi)細(xì)胞周期分析。此外，研究人員還將VASA-seq與其他流行的scRNA-seq技術(shù)進(jìn)行比較，揭示了VASA-seq的優(yōu)勢(shì)。總之，VASA-seq是一種具有高度敏感性的、可擴(kuò)展的單細(xì)胞技術(shù)，其在未來(lái)可能有助于揭示當(dāng)前mRNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)無(wú)法捕獲的生物學(xué)信息。接下來(lái)就讓我們一起來(lái)了解下這一未來(lái)可期的新的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的廬山真面目吧。
High-throughput total RNA sequencing in single cells using VASA-seq
基于VASA-seq進(jìn)行單細(xì)胞高通量全長(zhǎng)RNA測(cè)序
一．背景知識(shí)
單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)是研究樣本中單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征的領(lǐng)先技術(shù)。目前，至少有20種以上的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，這些技術(shù)在RNA捕獲效率、偏差、規(guī)模和成本方面存在顯著差異。目前具有代表性的兩個(gè)主流技術(shù)為Smart-seq2和10X Genomic，這兩種方法都存在各自的不足，例如Smart-seq2每次測(cè)序的細(xì)胞數(shù)量相對(duì)較少并存在 pcr 偏好，測(cè)序成本也比較高；而10X Genomic的缺點(diǎn)是一般只能檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄本600nt以內(nèi)的信息，其他信息會(huì)丟失。因此，小編今天和大家分享另一個(gè)高靈敏度、高通量、單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法VASA-seq，其是一種能夠?qū)渭?xì)胞的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序的新技術(shù)。
二．主要方法
1. 基于平板（VASA-plate）和液滴微流控（VASA-drop）的VASA-seq工作流：基于平板的技術(shù)主要步驟包括：384孔板細(xì)胞分選、細(xì)胞裂解和RNA碎裂、RNA修復(fù)和逆轉(zhuǎn)錄及second-strand合成。基于液滴微流控的技術(shù)主要流程包括：液滴產(chǎn)生裝置的設(shè)計(jì)、液滴注射裝置的設(shè)計(jì)、微流控模子的光刻、軟光刻技術(shù)、電池加載和液滴收集及回注室制造、微流體設(shè)備操作、聚丙烯酰胺珠條碼、油包水乳液中細(xì)胞包埋、細(xì)胞裂解和RNA碎裂、首次注射RNA和poly(A) 尾、二次注射用于逆轉(zhuǎn)錄。
2. VASA-drop和10x Chromium的FASTQ文件預(yù)處理：研究中VASA-drop的原始讀數(shù)使用Python腳本進(jìn)行預(yù)處理。對(duì)于每個(gè)Read1，提取UMI和細(xì)胞特異性條形碼。作者為每個(gè)可能的條形碼繪制了log10(read數(shù))的直方圖，并將其擬合到一個(gè)多項(xiàng)式函數(shù)，該函數(shù)顯示了兩個(gè)或三個(gè)最小值，作者使用log10(read)的最大值最小的位置作為閾值:只有read高于此閾值的條形碼用于下游分析。
3. VASA-plate的FASTQ文件預(yù)處理：VASA-plate流程中 中Read1從一個(gè)6 nt長(zhǎng)的UFI或UMI開始，然后是一個(gè)8 nt長(zhǎng)的細(xì)胞特異性條形碼，有384個(gè)細(xì)胞特異性條形碼，每個(gè)條形碼對(duì)應(yīng)384孔板中的一個(gè)孔。
4. 數(shù)據(jù)映射：研究中將Read2分配給接受的條形碼，并使用TrimGalore與默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行修整，接著將修剪后的reads映射到小鼠或人類rRNA。其余的reads映射到小鼠GRCm38基因組或人類GRCh38基因組。
5. 小鼠的VASA-seq文庫(kù)及10x Chromium文庫(kù)和單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的scRNA序列分析：VASA-seq研究中Scrublet和Scanpy包與自定義代碼一起使用。分析中有85 - 95%的轉(zhuǎn)錄本屬于蛋白質(zhì)編碼基因，13%的轉(zhuǎn)錄本屬于lncRNA, 5%的轉(zhuǎn)錄本屬于小RNA的細(xì)胞保留。未剪切和剪切的蛋白編碼基因在計(jì)數(shù)表中被作為不同的條目。組蛋白基因轉(zhuǎn)錄總數(shù)在35以上的細(xì)胞被認(rèn)為處于s期。通過t檢驗(yàn)確定細(xì)胞周期基因，分析s期和非s期細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)。接下來(lái)，選擇平均log表達(dá)在0.0125 ~ 5之間的高變量基因，并排除細(xì)胞周期基因。對(duì)于所有時(shí)間點(diǎn)，作者選擇了前50個(gè)主成分，構(gòu)建一個(gè)連接最近鄰細(xì)胞的有向圖，并將有向圖轉(zhuǎn)換為無(wú)向圖，得到二維UMAP，并分析簇之間的差異基因表達(dá)。小鼠的10x Chromium文庫(kù)和單個(gè)時(shí)間點(diǎn)的scRNA序列分析與VASA-seq相似。
6. 10x Chromium與VASA-seq胚胎數(shù)據(jù)的比較：為了進(jìn)行比較，作者只在基因體的80% 3’端進(jìn)行reads映射，生成VASA-seq和10x Chromium的計(jì)數(shù)表，并只使用兩種技術(shù)中表達(dá)的基因進(jìn)行比較。從合并的VASA 10x Chromium數(shù)據(jù)集通過PCA進(jìn)行降維。在組合PCA空間中計(jì)算細(xì)胞之間的距離，對(duì)于給定的簇和參考技術(shù)，獲得了該簇中的細(xì)胞與它們?cè)谀繕?biāo)技術(shù)中對(duì)應(yīng)的第一個(gè)最近鄰之間距離的背景直方圖。最后，將目標(biāo)技術(shù)中的每個(gè)細(xì)胞分配到參考技術(shù)中其最近鄰的簇中。VASA-seq和10x Chromium之間的等效簇被定義為具有相同10x Chromium和VASA簇分配的細(xì)胞組。為了給每個(gè)等效簇分配一個(gè)胚層，研究使用了已發(fā)表的10x Chromium數(shù)據(jù)的注釋。
7. VASA-drop小鼠胚胎數(shù)據(jù)的UMAP：作者首先構(gòu)建一個(gè)有向圖，對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)中的每個(gè)細(xì)胞，找到來(lái)自同一時(shí)間點(diǎn)和前一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞子集中最近的前30個(gè)鄰居。為此，將子集中的所有細(xì)胞投影到最近時(shí)間點(diǎn)的PCA空間，并計(jì)算距離。接下來(lái)，提取無(wú)向圖并將數(shù)據(jù)投影到二維UMAP中。
8. 擴(kuò)展轉(zhuǎn)錄組注釋：研究中每個(gè)細(xì)胞的FASTQ文件被用來(lái)重建轉(zhuǎn)錄組和量化AS事件。作者使用基于Hisat2及StringTie2和其他自定義腳本實(shí)現(xiàn)了一個(gè)自定義計(jì)算工作流。首先，通過一個(gè)Python腳本刪除PCR重復(fù)，然后，根據(jù)之前獲得的Leiden簇對(duì)讀數(shù)進(jìn)行分組，并使用HISAT2映射到參考小鼠基因組GRCm38。對(duì)每個(gè)簇的比對(duì)進(jìn)行組裝，然后使用StringTie2合并。接下來(lái)使用gtfcompare將得到的GTF文件與輸入的轉(zhuǎn)錄組注釋進(jìn)行比較，其將編碼為k、m、n、j、x、i或y的三個(gè)或三個(gè)以上外顯子的新轉(zhuǎn)錄本附加到輸入轉(zhuǎn)錄組注釋中，擴(kuò)展了原始注釋轉(zhuǎn)錄本集。最后，為了進(jìn)一步提高潛在的新轉(zhuǎn)錄本的質(zhì)量，作者實(shí)施了額外的自定義過濾步驟，并使用MicroExonator獲得了一個(gè)轉(zhuǎn)錄組注釋，隨后使用自定義腳本進(jìn)行處理。
9. 跨細(xì)胞類型的AS事件的量化：分析中擴(kuò)展轉(zhuǎn)錄組注釋的最終GTF使用Whippet來(lái)量化亞型和AS事件。作者通過MicroExonator的下游模塊運(yùn)行Whippet，使用scRNA-seq數(shù)據(jù)分析AS事件，該數(shù)據(jù)允許將細(xì)胞隨機(jī)聚合成偽塊，并跨細(xì)胞類型對(duì)AS進(jìn)行兩兩比較。為了確定不同細(xì)胞類型之間AS譜，作者使用PAGA根據(jù)基因表達(dá)計(jì)算細(xì)胞簇之間的連通性。然后，比較了連通性≥0.05的72對(duì)簇。在每次比較中，每個(gè)簇中的細(xì)胞被隨機(jī)匯集，形成至少三個(gè)不同的偽塊。為了展示檢測(cè)到的AS事件對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響，研究使用drawProteins 包繪制了UniProt中標(biāo)注的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和其他特征的比例圖。
三．文章的主要內(nèi)容
1. VASA-seq可以在單細(xì)胞中使用平板或液滴檢測(cè)非聚腺苷化和聚腺苷化轉(zhuǎn)錄本
文章首先對(duì)VASA-seq進(jìn)行了總體介紹，VASA-seq第一步是從單細(xì)胞裂解物中分離RNA分子，然后進(jìn)行末端修復(fù)和poly（A）引入，實(shí)現(xiàn)在條形碼寡聚dT探針中合成cDNA。此外，一種獨(dú)特的片段識(shí)別器 （UFI）允許對(duì)具有鏈特異性的分子進(jìn)行精確定量，利用體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增條形碼cDNA，并清除擴(kuò)增后的核糖體RNA（rRNA）。VASA-seq的后續(xù)流程則類似于CEL-seq。研究人員將VASA-seq工作流應(yīng)用于平板（VASA-plate）和液滴微流控（VASA-drop）兩種技術(shù)。其中基于平板的技術(shù)是廣泛可用的；基于液滴微流控的技術(shù)可用于高通量捕獲細(xì)胞群體，操作時(shí)間更少，試劑成本更低。在基于液滴微流控的流程中，研究團(tuán)隊(duì)還優(yōu)化了三種微流控芯片，實(shí)現(xiàn)更高通量（圖1）。
2. VASA-seq的條形碼混合、生物型檢測(cè)、基因體覆蓋及敏感性
在文章的第二部分，為了驗(yàn)證VASA-drop微流控處理過程中液滴室的完整性，研究人員利用小鼠胚胎干細(xì)胞（mESCs）和人類HEK293T細(xì)胞進(jìn)行了物種混合實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有3.08%的異型雙倍率。然后，作者也使用HEK293T細(xì)胞，將VASA-seq方法與廣泛使用的10x Chromium液滴平臺(tái)、高度敏感的Smart-seq和總RNA-seq Smart-seq-total平板工作流程進(jìn)行了比較(圖1e、f)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VASA-drop和VASA-plate在蛋白質(zhì)編碼基因體中均表現(xiàn)出均勻覆蓋。相比之下，10x Chromium的大部分讀取位于3端附近。對(duì)于包含UMI的讀數(shù)，Smart-seq對(duì)5端有較大的偏差，對(duì)于其余的讀數(shù)則對(duì)3端有較大的偏差，這在Smart-seq-total中也可以觀察到(圖1e)。蛋白質(zhì)編碼基因是所有方法中檢測(cè)率最高的生物型。然而，VASA-plate和VASA-drop檢測(cè)到的長(zhǎng)非編碼RNA(lncRNAs)都是10x Chromium、Smart-seq和Smart-seq-total的兩倍。并且只有VASA-seq和Smart-seq-total檢測(cè)到短非編碼RNA (sncRNAs)。然后，作者分析了每種方法對(duì)所有注釋基因的檢測(cè)靈敏度和飽和率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VASA-drop顯示出最高的敏感性，其次是VASA-plate，兩者的基因檢出率均高于Smart-seq和10x Chromium，并優(yōu)于Smart-seq-total(圖1f)。同樣，兩個(gè)VASA-seq工作流程都顯示了對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的卓越檢測(cè)?？傊?，VASA-seq結(jié)合了10x Chromium液滴微流控平臺(tái)的高通量、Smart-seq方法的高靈敏度和Smart-seq-total的廣譜捕獲非編碼RNA。此外，該方法保持了整個(gè)基因體的均勻覆蓋。
3. VASA-seq擴(kuò)展了小鼠胚胎中細(xì)胞類型特異性標(biāo)記基因的列表
在這一部分，作者使用VASA-seq的上述優(yōu)勢(shì)來(lái)擴(kuò)展和改進(jìn)當(dāng)前的小鼠發(fā)育圖譜。作者使用VASA-drop生成了小鼠原腸發(fā)育和早期器官發(fā)生的單細(xì)胞總RNA-seq圖譜，共對(duì)小鼠胚胎植入后E6.5、E7.5、E8.5和E9.5期的33662個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序(圖2a)。作者將VASA-seq數(shù)據(jù)集直接與使用10x Chromium平臺(tái)生成的參考數(shù)據(jù)集進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，VASA-seq檢測(cè)到的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本比例略低，但lncRNAs和轉(zhuǎn)錄因子(TFs)檢測(cè)到的水平要高出2-3倍，且sncRNAs僅在VASA-seq數(shù)據(jù)集中被捕獲(圖2b)?？偟膩?lái)說，兩種方法在不同的時(shí)間點(diǎn)上都發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)基因(圖2c)，但部分基因僅在VASA-seq數(shù)據(jù)集中檢測(cè)到。接下來(lái)，作者為了探索VASA-seq圖譜是否為不同的細(xì)胞類型提供了更多的標(biāo)記基因，識(shí)別了VASA-seq和10x Chromium中都存在的等效細(xì)胞簇，并通過差異基因表達(dá)分析對(duì)它們進(jìn)行比較(圖2d,e)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在10x Chromium和VASA-seq數(shù)據(jù)集之間共有的43個(gè)等價(jià)簇，總的來(lái)說，VASA-seq檢測(cè)可到更多的差異上調(diào)基因，表明VASA-seq可以擴(kuò)展已知標(biāo)記基因的列表，特別是對(duì)于未拼接的蛋白編碼基因和lncRNA基因。
4. 組蛋白基因作為周期細(xì)胞的體內(nèi)標(biāo)記物
在這一部分，作者為了進(jìn)一步識(shí)別VASA-seq固有的全局基因特征，通過比較所有基因在等效簇和時(shí)間點(diǎn)的平均表達(dá)值來(lái)進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。該分析發(fā)現(xiàn)VASA-seq中一個(gè)顯著高表達(dá)的基因子集，包括許多組蛋白基因。作者推斷，組蛋白基因表達(dá)可以進(jìn)一步用于識(shí)別細(xì)胞周期狀態(tài)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)典型組蛋白基因在s期強(qiáng)烈上調(diào)。分析發(fā)現(xiàn)與10x Chromium相比，VASA-seq細(xì)胞組蛋白基因總表達(dá)的直方圖顯示其呈雙峰分布(圖3b)。作者也進(jìn)一步將不同時(shí)間點(diǎn)的所有細(xì)胞嵌入到單個(gè)UMAP中，并在數(shù)據(jù)集上可視化組蛋白基因的總表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高組蛋白表達(dá)的細(xì)胞與從低組蛋白表達(dá)的細(xì)胞明顯分離，這是使用標(biāo)準(zhǔn)scRNA-seq細(xì)胞周期評(píng)分方法無(wú)法檢測(cè)到的特征。此外，VASA-seq數(shù)據(jù)集中組蛋白表達(dá)的雙峰分布使細(xì)胞被分為s期或非s期(圖3d)。接著作者通過從數(shù)據(jù)集中移除細(xì)胞周期基因，回歸出細(xì)胞周期的影響，并產(chǎn)生了一個(gè)具有減少細(xì)胞周期模式的改進(jìn)UMAP(圖3d)。接著作者對(duì)回歸數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類，并根據(jù)差異基因表達(dá)獲得的標(biāo)記為每個(gè)聚類分配一個(gè)細(xì)胞類型注釋(圖3e)。接下來(lái)，作者探索某些細(xì)胞類型是否循環(huán)更頻繁，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠胚胎中每種細(xì)胞類型處于s期的細(xì)胞比例為65±11%。然而，一些細(xì)胞類型顯示s期細(xì)胞比例較高(圖3f)。作者還發(fā)現(xiàn)從E6.5到E8.5，只有滋養(yǎng)外胚層的s期細(xì)胞比例未發(fā)生改變(圖3g)。其他細(xì)胞類型的s期細(xì)胞數(shù)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上都有所減少(圖3g)。此外，作者發(fā)現(xiàn)10個(gè)單注釋基因(圖3h)和14個(gè)多注釋基因在至少一種細(xì)胞類型中顯著上調(diào)。部分組蛋白基因具有胚層和細(xì)胞型特異性表達(dá)(圖3i，)。總之，VASA-seq能夠檢測(cè)到大量的組蛋白基因，這些基因在整個(gè)數(shù)據(jù)集是魯棒的。
5. VASA-seq增加內(nèi)含子覆蓋率可以提高RNA速度評(píng)估
VASA-seq檢測(cè)到的大量未剪切轉(zhuǎn)錄本表明，使用該方法可以增強(qiáng)RNA速度譜，該速度譜是利用每個(gè)基因的未剪切與剪切計(jì)數(shù)之比計(jì)算的。因此，在這一部分作者以隨機(jī)模式使用scVelo包計(jì)算所有細(xì)胞在全部四個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的速度和置信值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UMAP中，速度矢量方向明確地遵循了連續(xù)的時(shí)間點(diǎn)和細(xì)胞類型的進(jìn)展，再現(xiàn)了之前描述的小鼠胚胎發(fā)育的軌跡(圖4a)。接著為了與同等的10x Chromium數(shù)據(jù)集進(jìn)行對(duì)比，研究使用E6.5、E7.5和E8.5時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了重復(fù)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與10x Chromium相比，VASA-seq的RNA速度矢量總體上有更高的可信度(圖4b)。接下來(lái)，作者提取了對(duì)RNA速度矢量有顯著貢獻(xiàn)的基因，發(fā)現(xiàn)VASA-seq檢測(cè)到大量額外的基因(圖4c)。對(duì)于兩種方法共有的基因，作者用scVelo的預(yù)測(cè)對(duì)基因相位圖的擬合度(r2)進(jìn)行量化(圖4d)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在擬合優(yōu)度方面，VASA-seq的擬合優(yōu)度優(yōu)于10x Chromium數(shù)據(jù)。接下來(lái)為了確定這些測(cè)量是否能夠?qū)崿F(xiàn)更準(zhǔn)確的軌跡預(yù)測(cè)，作者將來(lái)自10x Chromium數(shù)據(jù)集的速度矢量投影到UMAP上，該分析揭示了血液成熟過程中的不同軌跡(圖4e)。作者利用scVelo的動(dòng)態(tài)模型對(duì)E7.5和E8.5的血細(xì)胞類型進(jìn)行潛在時(shí)間預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)10x Chromium數(shù)據(jù)集軌跡具有不一致性(圖4f,g)。而VASA-seq沒有這些觀察結(jié)果，VASA-seq準(zhǔn)確地報(bào)告了物理采樣時(shí)間點(diǎn)的血液成熟情況(圖4h)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了使用VASA-seq可以進(jìn)行更敏感的RNA速度測(cè)量來(lái)識(shí)別跨細(xì)胞類型的軌跡。此外作者認(rèn)為基于VASA-seq對(duì)非編碼基因體捕獲，可以確定跨組織的lncRNA動(dòng)力學(xué)。這些觀察結(jié)果無(wú)法在10x Chromium數(shù)據(jù)集中復(fù)現(xiàn)，因?yàn)闊o(wú)法檢測(cè)到這些lncRNA的未剪切分子。可見VASA-seq具有更好的能夠指導(dǎo)分化軌跡和識(shí)別新的基因表達(dá)動(dòng)力學(xué)的RNA速度矢量。
6. AS在小鼠原腸和早期器官發(fā)生中的綜合分析
VASA-seq大規(guī)模分析全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組的能力可幫助研究人員識(shí)別跨細(xì)胞類型的AS模式。每個(gè)剪切節(jié)點(diǎn)都與不同類型的AS、不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或不同的多聚腺苷化事件相關(guān)。因此，在這一部分為了檢測(cè)不同細(xì)胞類型的差異剪切點(diǎn)（Differentially included splicing nodes, DISNs），研究人員通過兩兩比較來(lái)檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞的穩(wěn)定AS變化。作者將分析重點(diǎn)放在檢測(cè)到DISNs最多的15對(duì)比較中，發(fā)現(xiàn)它們主要富集在涉及心臟形態(tài)發(fā)生、早期原腸、胚胎外組織和血液發(fā)育的細(xì)胞類型中，表明AS廣泛參與這些過程（圖5）。
7. 血液和心臟相關(guān)細(xì)胞類型的AS分析
在文章的最后一部分，作者對(duì)血液和心臟相關(guān)細(xì)胞類型的AS進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有細(xì)胞類型中，與第一心臟場(chǎng)(FHF)相比，原始心管（PHT）表現(xiàn)出更多的AS特征，這些變化發(fā)生在心臟經(jīng)歷廣泛形態(tài)發(fā)生時(shí)(圖6a)。此外，分析也發(fā)現(xiàn)Rbfox2的一對(duì)相互排斥的外顯子是FHF和PHT比較中最顯著的DISN(圖6b)。此外，作者也進(jìn)一步展示了UMAP上上述剪切位點(diǎn)的單細(xì)胞ψ值，揭示了整個(gè)圖譜中細(xì)胞類型特異性的模式(圖6d）。研究人員將與其他細(xì)胞類型相偏離的剪切節(jié)點(diǎn)標(biāo)記為剪切節(jié)點(diǎn)標(biāo)記（SNMs），研究檢測(cè)到參與心臟發(fā)育和早期原腸胚發(fā)育的細(xì)胞類型中SNMs的數(shù)量增加。在所有細(xì)胞類型中，原始心管的剪切模式最多樣化。這些結(jié)果表明VASA-seq可以通過測(cè)量不同細(xì)胞類型的AS來(lái)揭示細(xì)胞類型特異性基因功能。
到這里這篇文章的主要內(nèi)容就介紹完了，VASA-seq是一種能夠?qū)渭?xì)胞的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序的新技術(shù)，其在可擴(kuò)展性、敏感性、基因組覆蓋率和lncRNA檢測(cè)方面都具有卓越的優(yōu)勢(shì)。此外，該方法在基于平板（VASA-plate）和基于液滴微流控（VASA-drop）的流程中都保持了良好性能，這使得高通量單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組分析成為可能。更重要的是，VASA-seq方法需要的試劑成本較低，這使得廉價(jià)、高通量、準(zhǔn)確的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析成為可能，可以說這一測(cè)序方法有望在未來(lái)進(jìn)一步推動(dòng)單細(xì)胞領(lǐng)域的發(fā)展。
