利用多組學(xué)來研究轉(zhuǎn)移性乳腺癌

導(dǎo)讀

2月4日是世界癌癥日。世衛(wèi)組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已經(jīng)取代肺癌，成為全球第一大癌癥。在我國，每年新發(fā)乳腺癌病例約為42萬例，發(fā)病高峰在45—55歲。乳腺癌細(xì)胞可以通過多個(gè)途徑進(jìn)行轉(zhuǎn)移，并且轉(zhuǎn)移后對(duì)身體的危害更大。這不但讓治療難度特別大，還因?yàn)檗D(zhuǎn)移后讓其它器官出現(xiàn)了明顯的功能障礙，這才是乳腺癌這種惡性腫瘤致命的原因所在。

研究結(jié)果

• 研究隊(duì)列的臨床特征和全局基因組模式

在Translational Breast Cancer Research Consortium（轉(zhuǎn)化型乳腺癌研究聯(lián)盟）的基礎(chǔ)上，美國成立了一個(gè)學(xué)術(shù)醫(yī)療中心聯(lián)盟：Aurora US Transmitatic Project，目的是進(jìn)行一項(xiàng)關(guān)于轉(zhuǎn)移性和原發(fā)乳腺癌（BCs）的多平臺(tái)基因組研究，類似于癌癥基因組圖譜(TCGA)對(duì)原發(fā)BCs的研究。本文的作者利用了Aurora 中55名女性轉(zhuǎn)移性乳腺癌（MBCs）患者數(shù)據(jù)，該隊(duì)列初診時(shí)的中位年齡為49歲。在轉(zhuǎn)移性環(huán)境中，這些患者均接受了系統(tǒng)治療。轉(zhuǎn)移來自多個(gè)部位，最常見的是肝、肺、淋巴結(jié)、腦和其他部位。與TCGA原發(fā)腫瘤相比，Aurora隊(duì)列有更多的三陰性BCs(TNBCs)和基底樣原發(fā)瘤患者。從每個(gè)標(biāo)本中提取腫瘤DNA和RNA，并用于四種不同的分析：DNA外顯子組和低通全基因組測序(WGS)，使用rRNA耗盡和DNA甲基化微陣列的全轉(zhuǎn)錄RNA測序(RNAseq)。

總體而言，利用配對(duì)的數(shù)據(jù)集和多平臺(tái)基因組數(shù)據(jù)集為MBC的研究提供了前所未有的資源。體細(xì)胞突變圖譜確定TP53、KMT2C、FLG和PIK3CA是最常見的突變基因，以及在四個(gè)（AF94、AER2、AD9I和AD9E）雌激素受體陽性(ER+)的轉(zhuǎn)移瘤中存在ESR1突變。同樣，作者發(fā)現(xiàn)許多在AURORA原發(fā)性腫瘤中出現(xiàn)的體細(xì)胞突變也出現(xiàn)在配對(duì)轉(zhuǎn)移瘤中。Tp53和FLG基因在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的突變率明顯高于原發(fā)灶，但調(diào)整假發(fā)現(xiàn)率后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于體細(xì)胞DNA拷貝數(shù)圖譜，作者計(jì)算了533個(gè)復(fù)發(fā)DNA片段水平的分?jǐn)?shù)，并觀察到11個(gè)片段在轉(zhuǎn)移過程中頻繁地?cái)U(kuò)增（圖1）。

• 基因表達(dá)亞型轉(zhuǎn)換與基因組特征差異

為了評(píng)估原發(fā)腫瘤和其轉(zhuǎn)移瘤之間的基因表達(dá)差異，作者根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)123個(gè)樣本進(jìn)行了PAM50分子分型，并測試了每個(gè)個(gè)體的亞型的一致性。在檢測的39例病例中，有13例顯示出原發(fā)腫瘤與其轉(zhuǎn)移之間的亞型轉(zhuǎn)換。作者發(fā)現(xiàn)，基底樣表型最穩(wěn)定。相反，包括Lumina A(LumA)型、Lumina B(LumA) 型和HER2 Enriched(HER2E)型在內(nèi)的“Lumina”亞型轉(zhuǎn)換頻率高，其表型不穩(wěn)定。接下來，作者進(jìn)行了相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析，尤其是將原發(fā)腫瘤與不同的轉(zhuǎn)移瘤分組進(jìn)行了比較。作者主要把研究重點(diǎn)放在免疫細(xì)胞的特征上（這與病理學(xué)家評(píng)估的免疫細(xì)胞滲透率和基于DNA甲基化的白細(xì)胞滲透評(píng)估顯著相關(guān)）?？偟膩碚f，luminal /ER+亞型轉(zhuǎn)移（LumA、LumB和HER2E聯(lián)合）低表達(dá)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮信號(hào)，很少與適應(yīng)性免疫特征不同。相反，basal-like/TNBC轉(zhuǎn)移瘤的適應(yīng)性免疫特征的表達(dá)顯著降低，包括多個(gè)T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）細(xì)胞和HLA相關(guān)的信號(hào)，而成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)沒有變化（圖2）。

這些對(duì)比分析表明，免疫功能可能會(huì)因轉(zhuǎn)移部位的不同而改變。為了驗(yàn)證假設(shè)，作者利用Aurora-RAP聯(lián)合數(shù)據(jù)集分析同一個(gè)體內(nèi)不同轉(zhuǎn)移部位的免疫特征。結(jié)果表明，肝轉(zhuǎn)移瘤的免疫標(biāo)志比匹配的原發(fā)腫瘤低，但在肺轉(zhuǎn)移瘤中往往更高，這初步證實(shí)了作者的假設(shè)。作者還比較了肝轉(zhuǎn)移和腦轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與免疫無關(guān)的不同特征。當(dāng)將腦轉(zhuǎn)移與肺或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行比較時(shí)，腦轉(zhuǎn)移的免疫相關(guān)信號(hào)的表達(dá)也較低。這證實(shí)了免疫功能可能會(huì)因轉(zhuǎn)移部位的不同而改變。為了評(píng)估基因表達(dá)特征與患者生存的關(guān)系，作者利用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析Aurora隊(duì)列。在這個(gè)隊(duì)列中，生存的主要決定因素與luminal/ER+相關(guān)的特征(較好的結(jié)果)、basal-like的表型特征(較差的結(jié)果)相關(guān)（圖3）。

• HLA-A的失調(diào)及其對(duì)抗腫瘤免疫的影響

在basal-like/TNBC轉(zhuǎn)移瘤中，HLA亞基因信號(hào)的表達(dá)減少。作者檢測了HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M的啟動(dòng)子CpG島后發(fā)現(xiàn)在23個(gè)腫瘤中均出現(xiàn)了HLA-A甲基化。轉(zhuǎn)移性腫瘤中HLA-A啟動(dòng)子甲基化的頻率顯著高于原發(fā)瘤，而配對(duì)分析并不顯著，但有相同的趨勢。相比之下，HLA-B、HLA-C或B2M的甲基化頻率不高。作者還觀察到在人類HLA-A甲基化的腫瘤中，HLA-A的基因表達(dá)較低，并且HLA-A蛋白的表達(dá)和HLA-A的DNA甲基化之間有相關(guān)的趨勢。DNA拷貝數(shù)分析還顯示，8名患者的23例樣本在該區(qū)域存在局灶性缺失，但在另外3名患者的13例樣本中，這些局灶性缺失發(fā)生在靠近一個(gè)HLA基因的區(qū)域。。原發(fā)腫瘤的HLA-A甲基化與HLA-A mRNA低水平和多種適應(yīng)性免疫信號(hào)低表達(dá)有關(guān)。重要的是，即使調(diào)整了分期和PAM50亞型的多變量分析，HLA-A甲基化的腫瘤仍然顯示出更差的生存結(jié)果。由此可見，HLA-A的失調(diào)及其對(duì)抗腫瘤免疫的影響（圖4）。

• 轉(zhuǎn)移瘤中細(xì)胞黏附的表觀遺傳學(xué)抑制

作者對(duì)與轉(zhuǎn)移瘤的DNA甲基化變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以揭示表觀遺傳機(jī)制的影響。細(xì)胞成分對(duì)DNA甲基化特征有深刻影響。比較原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移瘤的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，與其匹配的原發(fā)腫瘤相比，轉(zhuǎn)移性腫瘤中有123個(gè)CpG位點(diǎn)出現(xiàn)顯著的低甲基化。使用染色質(zhì)免疫沉淀測序(CHIP-SEQ)數(shù)據(jù)集分析，作者發(fā)現(xiàn)在123個(gè)低甲基化的CpG位點(diǎn)、47個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)（21種蛋白質(zhì)）顯著過表達(dá)。一些參與雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)主要結(jié)合在這些低甲基化的CPG上，包括由ESR1、FOXA1、TFAP2a和Tfap2c編碼的蛋白質(zhì)。作者通過對(duì)ESR1和FOXA1調(diào)控的潛在靶基因進(jìn)行GO富集化分析，對(duì)啟動(dòng)子甲基化的獲得進(jìn)行了篩選。最終鑒定了三個(gè)基因(JAM3、YBX3和SYNDG1)啟動(dòng)子DNA高甲基化與轉(zhuǎn)移相關(guān)。在轉(zhuǎn)移性腫瘤中，所有三種基因的基因表達(dá)都顯著低于匹配的原發(fā)腫瘤，這種現(xiàn)象在HER2E或luminal亞型中更為明顯（圖5）。

• 克隆進(jìn)化與亞型轉(zhuǎn)換

許多文章已經(jīng)研究了DNA的克隆進(jìn)化以及其對(duì)治療選擇的影響。本文的作者則集中于三個(gè)亞型轉(zhuǎn)換的案例，以探索表型的變化是否伴隨著DNA克隆性變化。患者AER8是ER+/PR+/HER2-Luma亞型原發(fā)腫瘤，并接受了新輔助化療和輔助內(nèi)分泌治療加伊維莫司。該患者的兩個(gè)肝轉(zhuǎn)移屬于相同的克隆譜系（同于原發(fā)灶的顯性克隆譜系），與DNA高甲基化圖譜一致。RNA-seq檢測顯示亞型轉(zhuǎn)換為HER2E(但臨床仍為HER2-)，增殖特征增加，HLA-A mRNA水平和免疫細(xì)胞特征下降。

患者AFR3，他被診斷為ER+/PR+/HER2-Luma BC，也發(fā)生了亞型轉(zhuǎn)換。AFR3先接受化療，然后接受內(nèi)分泌治療，并進(jìn)展為多發(fā)性轉(zhuǎn)移。腦轉(zhuǎn)移標(biāo)本顯示出ER-/PR-/HER2+的變化：基因表達(dá)分析證實(shí)HER2表達(dá)增加，亞型轉(zhuǎn)換為HER2E，伴隨著DNA克隆性變化。這種DNA克隆變化也反映在DNA高甲基化圖譜中，并且與ESR1和PGR下調(diào)以及ERBB2 mRNA上調(diào)有關(guān)。

患者AFE4顯示出相反的趨勢。這名患者是ER+/PR+/HER2+BC(HER2E表達(dá)亞型)，臨床HER2免疫組織化學(xué)(IHC)結(jié)果為陽性，熒光原位雜交(FISH)結(jié)果不確定，但HER mark檢測呈陽性。曲妥珠單抗治療30個(gè)月后，肺活檢表明為ER+/HER2-。RNA-seq檢測的三個(gè)轉(zhuǎn)移標(biāo)本顯示亞型轉(zhuǎn)換為LumA或LumB，DNA克隆性變化和HER2擴(kuò)增缺失，而HER2 mRNA水平略有下降。DNA甲基化特征與DNA克隆進(jìn)化基本一致（圖6）?？傊?，三個(gè)克隆進(jìn)化的案例突出表明DNA克隆性的變化與基于基因表達(dá)的亞型變化相一致。

全文總結(jié)

已確診的轉(zhuǎn)移性腫瘤治療具有挑戰(zhàn)性，其生物學(xué)特性也很復(fù)雜。在這篇文章中，研究者通過RNA測序、腫瘤/種系DNA外顯子組、低通全基因組測序和整體DNA甲基化微陣列對(duì)55例轉(zhuǎn)移性乳腺癌女性進(jìn)行了檢測。在對(duì)原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)行多平臺(tái)分析時(shí)，本文發(fā)現(xiàn)了幾種模式（表觀遺傳、基因組和轉(zhuǎn)錄進(jìn)化）可以解釋轉(zhuǎn)移腫瘤的行為。這些發(fā)現(xiàn)可能對(duì)用免疫和HER2靶向療法治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌有意義

參考文獻(xiàn)

[1] Garcia-Recio S, Hinoue T, Wheeler G L, et al. Multiomics in primary and metastatic breast tumors from the AURORA US network finds microenvironment and epigenetic drivers of metastasis [J]. Nat Cancer, 2023, 4(1): 128-47.