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導(dǎo)讀
據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，胃癌（GC）已經(jīng)成為最常見的癌癥類型之一，是全球范圍內(nèi)第四大癌癥相關(guān)死亡原因。晚期胃癌患者預(yù)后不良，中位生存期短于1年。因此，還需要開發(fā)新型藥物來延長(zhǎng)胃癌患者的總生存期。盡管免疫治療是大部分胃癌患者的首選，但是胃癌異質(zhì)性阻礙了開發(fā)新型藥物的腳步。近年來，單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）廣泛用于研究各種癌癥類型腫瘤內(nèi)和腫瘤見異質(zhì)性并揭示了炎癥，癌前病變和胃癌的單細(xì)胞特征。scRNA-seq可以用于分析異質(zhì)和功能亞群，對(duì)胃癌的異質(zhì)性研究提供重要價(jià)值。下面，小編就為大家介紹幾篇近年來應(yīng)用scRNA-seq數(shù)據(jù)研究胃癌的文章。
案例一：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序研究胃癌患者的成纖維細(xì)胞
腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）的活性可以作為治療癌癥的潛在治療靶點(diǎn)。然而，胃癌中CAF的異質(zhì)性尚不清楚。這篇文章作者通過對(duì)8例GC樣本和鄰近黏膜（AM）樣本進(jìn)行scRNA-seq。分析CAF亞群的特征及其CAF亞群調(diào)控的腫瘤微環(huán)境（TME）組分之間的動(dòng)態(tài)通訊。
scRNA-seq揭示癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群與胃癌患者的不良臨床結(jié)局
作者對(duì)8例胃癌樣本和鄰近黏膜樣本進(jìn)行scRNA-seq，共獲得36897個(gè)細(xì)胞，聚為23個(gè)細(xì)胞簇，注釋為7類細(xì)胞，分別為上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）具有促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的多種作用，是腫瘤微環(huán)境的重要組分。基于特異性細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，作者鑒定到4個(gè)成纖維細(xì)胞亞群，分別為及纖維母細(xì)胞，周細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)CAFs（eCAFs）和免疫調(diào)節(jié)CAFs（iCAFs）。對(duì)4個(gè)CAFs亞群的差異分析和富集分析表明4個(gè)CAFs亞群具有不同的作用。其中，肌成纖維細(xì)胞中高表達(dá)基因富集于肌肉收縮，血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管發(fā)育。周細(xì)胞中上調(diào)基因富集于血管發(fā)育。腫瘤來源的iCAFs上調(diào)基因與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)有關(guān)。說明這些細(xì)胞在與免疫細(xì)胞交流中發(fā)揮作用。此外，作者發(fā)現(xiàn)了一類以POSTN高表達(dá)為特征的CAF亞群，該基因編碼蛋白支持上皮細(xì)胞黏附和遷移并促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞維持和轉(zhuǎn)移。作者將這類細(xì)胞定義為細(xì)胞外基質(zhì)CAFs（eCAFs）。eCAFs中具有腫瘤侵襲相關(guān)基因高表達(dá)，說明eCAFs是腫瘤轉(zhuǎn)移的TME重要組分。KM分析表明，POSTN高表達(dá)的患者總生存期較短?？偟膩碚f，eCAFs是CAF的重要亞群，具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和影響患者預(yù)后的作用。免疫組化結(jié)果表明，iCAFs富集在腫瘤腺體內(nèi)和淋巴結(jié)樣結(jié)節(jié)中，說明他們可能參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞。eCAFs分布于遠(yuǎn)端間質(zhì)區(qū)域。
案例二：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序研究胃癌患者多種細(xì)胞亞型異質(zhì)性
腫瘤微環(huán)境（TME）由多種細(xì)胞類型和細(xì)胞外組分組成，他們圍繞在腫瘤細(xì)胞周圍，由血管網(wǎng)絡(luò)滋養(yǎng)。TME中的細(xì)胞異質(zhì)性及其復(fù)雜，使用scRNAseq可以在單細(xì)胞分辨率下研究各種惡性細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞類型。這篇文章作者使用scRNAseq研究胃癌中免疫抑制微環(huán)境和特異性細(xì)胞類型間的相互作用，通過對(duì)9例非轉(zhuǎn)移性胃癌樣本和正常樣本進(jìn)行scRNAseq鑒定TME中不同亞群的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)變化并構(gòu)建胃癌的細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò)。
單細(xì)胞景觀揭示活性細(xì)胞亞型及其在胃癌腫瘤微環(huán)境中的相互作用
作者對(duì)9例非轉(zhuǎn)移性胃癌樣本和正常樣本進(jìn)行scRNAseq，共獲得47304個(gè)細(xì)胞，17個(gè)細(xì)胞簇注釋為7種細(xì)胞類型，包括T細(xì)胞和NK細(xì)胞，B細(xì)胞，髓系細(xì)胞，肥大細(xì)胞，成纖維細(xì)，內(nèi)皮細(xì)胞，上皮細(xì)胞和惡性細(xì)胞。
首先，作者對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)行重聚類共得到14個(gè)亞群，主要包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，CD4+ T細(xì)胞，CD8+ T細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和先天淋巴細(xì)胞。腫瘤樣本中Treg的比例高于正常樣本，說明Tregs在腫瘤樣本中募集。TCGA數(shù)據(jù)集結(jié)果表明Treg的特征基因在腫瘤樣本中高表達(dá)。腫瘤樣本中的Tregs與免疫抑制相關(guān)的多個(gè)基因高表達(dá)。GSVA分析表明IL2-STAT5信號(hào)通路，IL6-JAK-STAT3信號(hào)通路和PI3L-AKT-MTOR信號(hào)通路等在腫瘤樣本中上調(diào)。以上結(jié)果表明胃癌微環(huán)境具有免疫抑制作用。
接下來，作者對(duì)髓系細(xì)胞進(jìn)行重聚類共獲得15個(gè)亞群，其中M01-M03為單核細(xì)胞，M04-M07為樹突狀細(xì)胞，M08-M11為巨噬細(xì)胞，M12,M13和M15為低質(zhì)量細(xì)胞。M04中CD1C，F(xiàn)CER1A和CLEC9A高表達(dá)，M05中CLEC9A高表達(dá)，M07中LILRA4高表達(dá)，M06種LAMP3，CCL22和CCL19高表達(dá)。M06亞型中的細(xì)胞均來自腫瘤樣本，說明LAMP3+ DC亞型在腫瘤樣本中富集。TCGA數(shù)據(jù)集分析表明LAMP3+ DC亞型的特征基因在腫瘤樣本中高表達(dá)。樹狀圖表明，LAMP3+ DC與cDC1和cDC2簇均到一起。軌跡分析表明，LAMP3+ DC可以來自于胃癌的cDC2和cDC1。SCENIC分析表明，在LMAP3+ DC中，IRF1,IRF2,NFKB1和NFKB2活性上調(diào)，說明IRF家族和NF-kB是DC分化和成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子。
對(duì)于巨噬細(xì)胞來說，M08中INHBA，PTGS2和促炎細(xì)胞因子和趨化因子高表達(dá)。M09和M10種C1Q多個(gè)基因和抗原提呈基因高表達(dá)。M11中多種干擾素誘導(dǎo)基因高表達(dá)。M08為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。巨噬細(xì)胞可分為促炎M1和抗炎M2類。M08和M11中M1特征基因高表達(dá)，M9和M10中M2特征基因高表達(dá)。對(duì)TAMs和C1QC+巨噬細(xì)胞的基因表達(dá)水平分析鑒定到49個(gè)上調(diào)基因。GSVA分析表明TAMs中WNT β catenin信號(hào)，血管生成和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化活性增加，而C1QC+ 巨噬細(xì)胞在MHC Ⅱ類抗原呈遞中上調(diào)。
3467個(gè)成纖維細(xì)胞聚為11個(gè)細(xì)胞亞群。其中F01為周細(xì)胞，F(xiàn)01在腫瘤樣本中的豐度較高，免疫熒光染色表明周細(xì)胞位于血管周圍，血管生成因子在F01種表達(dá)水平升高，說明F01在胃癌的新生血管中起到關(guān)鍵作用。F03為正常組織中的成纖維細(xì)胞亞群，其表達(dá)特征與人類結(jié)腸間充質(zhì)細(xì)胞S2亞群類似，可能在維持上皮內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，然而腫瘤組織中F03亞群較少，說明腫瘤中上皮屏障的功能障礙。F06來源于正常組織，CFD，CLU，COL14A1和PI16高表達(dá)，該簇是多種組織中的成纖維細(xì)胞亞型。此外，多個(gè)補(bǔ)體因子在F06種高表達(dá)，說明F06在先天免疫防御中發(fā)揮作用。F04，F(xiàn)05和F08富集于腫瘤樣本，為癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞。CTHRC1在F04中高表達(dá)，CTHRC1與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，免疫熒光染色表明CTHRC1+細(xì)胞位于腫瘤組織的內(nèi)皮細(xì)胞周圍。TCGA數(shù)據(jù)集分析表明高表達(dá)Fib-CTHRC1的特征基因預(yù)后較差。F05為COL14A1+成纖維細(xì)胞簇，其中C7和APOD高表達(dá)，MMP1，MMP3和MMP9在F08種高表達(dá)。
1873個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞聚為9個(gè)細(xì)胞亞群。其中E01為尖端樣細(xì)胞，ESM1，KDR和PDGFB高表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)集分析表明E01中的特征基因在胃癌組織中高表達(dá)，說明胃癌中血管生成非?；钴S。E02和E03種ACKR1和SELP高表達(dá)。免疫熒光染色表明ACKR1在腫瘤的ECs中高表達(dá)。TCGA數(shù)據(jù)集中ACKR1高表達(dá)患者的預(yù)后較差。E04中CD36和CA4高表達(dá)，代表毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞。E05中多種動(dòng)脈ECs標(biāo)志物高表達(dá)。E07中多個(gè)干擾素誘導(dǎo)基因高表達(dá)。E09種LYVE1和CCL21高表達(dá)。
最后，作者使用CellPhoneDB2研究細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。正常組織中，髓系細(xì)胞的相互作用較多。而在腫瘤組織中，內(nèi)皮細(xì)胞與纖維細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和DC存在相互作用。EC-ESM1與四個(gè)成纖維細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的相互作用。總的來說，內(nèi)皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞相互作用的增強(qiáng)是胃癌細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的根本變化。
案例三：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序研究胃癌不同轉(zhuǎn)移器官的細(xì)胞異質(zhì)性
在胃癌治療中最困難的問題主要在于手術(shù)治療效果不好和向不同器官轉(zhuǎn)移。淋巴結(jié)，肝臟，腹膜，肺，骨和卵巢是常見的靶部位。腫瘤細(xì)胞可通過血液，淋巴細(xì)胞和腹腔內(nèi)擴(kuò)散侵襲遠(yuǎn)處部位。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過激活特定的基因和通路并向特定器官表現(xiàn)出趨向性，而腫瘤招募的免疫細(xì)胞和宿主微環(huán)境在促進(jìn)轉(zhuǎn)移進(jìn)展中也起著重要作用。因此，器官特異性轉(zhuǎn)移特征的精確定位十分重要。然而，GC向不同器官轉(zhuǎn)移的特征還十分不清楚。這篇文章，作者使用scRNAseq研究胃癌的原發(fā)腫瘤和不同器官轉(zhuǎn)移研究癌細(xì)胞和TME在腫瘤內(nèi)和腫瘤間的異質(zhì)性以及不同器官轉(zhuǎn)移模式。
scRNA-seq揭示人類胃癌器官特異性轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性
作者對(duì)10例胃癌組織，包括3例原發(fā)組織（PT），1例正常組織（NT）和6個(gè)轉(zhuǎn)移灶（M）（肝，淋巴結(jié)，腹膜，卵巢）進(jìn)行scRNAseq，共鑒定到42968個(gè)基因，包括上皮細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞，增殖細(xì)胞，T細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷細(xì)胞和髓系細(xì)胞。在不同原發(fā)組織和轉(zhuǎn)移灶中，細(xì)胞比例差異很大。
首先，作者分析上皮細(xì)胞。83%的非惡性上皮細(xì)胞來自NT，惡性上皮細(xì)胞中的腫瘤特異性基因表達(dá)水平較高。對(duì)PT和M的惡性上皮細(xì)胞進(jìn)行聚類鑒定到4個(gè)亞簇。對(duì)G0和其他惡性上皮細(xì)胞的DEG進(jìn)行IPA分析，G0細(xì)胞表現(xiàn)出腫瘤血管化和侵襲特征。VEGFA在G0細(xì)胞中顯著上調(diào)并在ILK通路和IL-8信號(hào)通路中激活。G0細(xì)胞可能具有血管生成和侵襲性。G1細(xì)胞的特征為遷移和EMT，這些細(xì)胞更容易通過腹腔內(nèi)擴(kuò)散進(jìn)行轉(zhuǎn)移。G2細(xì)胞主要分布在LN2和PT3中，G2細(xì)胞可能是GC中休眠型腫瘤細(xì)胞。G3細(xì)胞主要分布于PT和M，Li中，G3細(xì)胞與GC惡性進(jìn)展有關(guān)。TCGA數(shù)據(jù)集的KM分析表明，G0，G1和G3相關(guān)基因高表達(dá)的患者總生存期較差。
接下來，作者分析內(nèi)皮細(xì)胞，共鑒定到3個(gè)亞簇。E0的IGFBP5，STC1和IGFBP3在PT和M中而在NT中不表達(dá)，其中IGFBP3和STC1影響血管生成發(fā)芽。IPA分析表明與腫瘤侵襲GC密切相關(guān)的mTOR和IGF-1信號(hào)通路在E0細(xì)胞中正調(diào)控。疾病和生物功能分析表明E0細(xì)胞會(huì)增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，說明E0細(xì)胞會(huì)促進(jìn)胃癌侵襲。E1細(xì)胞在PT和M中最多，IPA分析表明E1細(xì)胞與T細(xì)胞衰竭信號(hào)通路的調(diào)控密切相關(guān)。NT中大多數(shù)內(nèi)皮細(xì)胞為E2簇，其活性低于其他亞群說明他們是正常的內(nèi)皮細(xì)胞。此外，作者使用TCGA數(shù)據(jù)集評(píng)估E0和E3特征標(biāo)記對(duì)患者生存期的影響，E0基因高表達(dá)的患者總生存期較低。
889個(gè)成纖維細(xì)胞聚為2個(gè)亞簇，其中F0是PT和M的原代成纖維細(xì)胞，定義為iCAFs，而F1在不同組織中的比例不同，定義為mCAFs。對(duì)這兩類細(xì)胞中的上調(diào)DEGs進(jìn)行GO分析。mCAFs和iCAFs均富集生物功能細(xì)胞外基質(zhì)/結(jié)構(gòu)組織和細(xì)胞基質(zhì)粘附，而mCAFs富集于肌肉相關(guān)過程，iCAFs負(fù)疚細(xì)胞外基質(zhì)分解，白細(xì)胞遷移調(diào)節(jié)和血管生成的調(diào)控。CCI分析表明，配體受體對(duì)CXCL12-CXCR4參與了iCAFs與T細(xì)胞，B細(xì)胞和髓系細(xì)胞的相互作用。此外，iCAF標(biāo)志基因高表達(dá)患者的總生存期較差。
案例四：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序研究胃癌預(yù)后相關(guān)基因
脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）是一種高度保守的低分子量的細(xì)胞質(zhì)蛋白。FABP1主要溶解脂肪酸，脂肪酸參與細(xì)胞內(nèi)代謝等信號(hào)過程。FABP1蛋白具有經(jīng)典的β結(jié)構(gòu)折疊和α螺旋。FABP1具有多種功能，包括抗氧化應(yīng)激的保護(hù)劑，參與調(diào)節(jié)脂肪生成和脂質(zhì)代謝。FABP1與各種疾病有關(guān)，F(xiàn)ABP1的表達(dá)水平與各種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。這篇文章作者對(duì)胃癌的scRNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FABP1是GC組織中最顯著差異表達(dá)的基因，是GC發(fā)展的核心基因并且與GC患者的預(yù)后有關(guān)。
胃癌scRNAseq揭示FABP1是一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物
作者對(duì)GSE134520單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，得到4110個(gè)細(xì)胞和3385個(gè)基因。tSNE分析和注釋后鑒定到胃細(xì)胞，漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。
隨后，作者進(jìn)行了偽時(shí)間分析并對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。DEGs主要與蛋白靶向，蛋白質(zhì)定位，中性粒細(xì)胞脫粒，細(xì)胞-底物鏈接合細(xì)胞黏附分子結(jié)合等功能有關(guān)。KEGG分析表明DEGs主要與氧化磷酸化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工和TNF信號(hào)通路有關(guān)。
使用COMPPI數(shù)據(jù)庫和Cytoscape繪制網(wǎng)絡(luò)圖，并給予差異細(xì)胞位置篩選網(wǎng)絡(luò)中FABP1的靶基因。作者以FABP1為靶點(diǎn)，篩選7個(gè)相關(guān)蛋白并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。FABP1與激素敏感脂肪酶介導(dǎo)的三酰甘油水解，脂肪消化和吸收顯著相關(guān)。SurvExpress數(shù)據(jù)集結(jié)果表明，F(xiàn)ABP1的表達(dá)水平對(duì)STAD患者的總生存期顯著相關(guān)。此外，F(xiàn)ABP1表達(dá)水平同樣與早期病理診斷的年齡相關(guān)。
為了進(jìn)一步研究FABP1在GC組織中的表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系，作者使用IHC分析FABP1在GC組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，F(xiàn)ABP1在胃癌組織中表達(dá)水平較高。KM分析表明，F(xiàn)ABP1高表達(dá)與預(yù)后較差有關(guān)。說明，F(xiàn)ABP1在胃癌中具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展和預(yù)測(cè)預(yù)后的作用。
總結(jié)：
總的來說，得益于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使研究人員可以從單細(xì)胞水平研究腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性。小編以以上四篇文章為例介紹了單細(xì)胞測(cè)序在胃癌研究中的應(yīng)用。這四篇文章從不同角度研究了胃癌腫瘤微環(huán)境和細(xì)胞的異質(zhì)性，分析內(nèi)容豐富且較為常規(guī)，小伙伴們快來學(xué)習(xí)起來吧~
參考文獻(xiàn)
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2. Single-cell landscape reveals active cell subtypes and their interaction in the tumor microenvironment of gastric cancer
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4. Integrated Single-Cell RNA-Sequencing Analysis of Gastric Cancer Identifies FABP1 as a Novel Prognostic Biomarker
