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2021年1月份，尼古拉斯團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology（IF：36.558）發(fā)表Delineating copy number and clonal substructure in human tumors from single-cell transcriptomes，他們開發(fā)了一種整合的貝葉斯分段算法，稱為非整倍體腫瘤拷貝數(shù)核型分析(CopyKAT)，用于估算高通量scRNA-seq基因組拷貝數(shù)譜，以區(qū)分腫瘤微環(huán)境中的正常細(xì)胞與惡性腫瘤細(xì)胞，識(shí)別主要的克隆亞群。
這個(gè)算法和以往的inferCNV和HoneyBadger相比，可以直接根據(jù)拷貝數(shù)譜區(qū)分正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，并且更適用于新的單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)。文章詳細(xì)介紹了該算法的原理和流程，并表明該算法應(yīng)用于各種實(shí)體瘤和不同的測(cè)序技術(shù)。讓我們來詳細(xì)看一看吧。
背景
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析被廣泛用于研究人類腫瘤。然而，如何區(qū)分腫瘤微環(huán)境中的正常細(xì)胞與惡性細(xì)胞，以及如何識(shí)別腫瘤中的克隆亞結(jié)構(gòu)，仍是一個(gè)挑戰(zhàn)。一個(gè)有效方法是鑒定細(xì)胞非整倍體拷貝數(shù)譜，因?yàn)榻^大多數(shù)的人類腫瘤細(xì)胞都是非整倍體(88%)，而正常人類基質(zhì)細(xì)胞均是二倍體。
先前的方法——inferCNV和HoneyBadger，是針對(duì)第一代scRNA-seq技術(shù)設(shè)計(jì)的（具有較低的細(xì)胞通量和較高的覆蓋深度）。而新開發(fā)的高通量scRNA-seq技術(shù)進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，只對(duì)mRNA的3’或5’端進(jìn)行稀疏覆蓋，具有較高的細(xì)胞通量和較低的覆蓋深度。此外，inferCNV和HoneyBadger不能準(zhǔn)確地解析特定染色體斷點(diǎn)的基因組位置，也不能根據(jù)非整倍體拷貝數(shù)譜正確分類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
而CopyKAT克服了這些缺點(diǎn)，研究者可以直接使用該方法，輸入測(cè)序得到的單細(xì)胞表達(dá)數(shù)據(jù)，就可以得到正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的預(yù)測(cè)結(jié)果，并且了解這些腫瘤細(xì)胞的哪些基因組區(qū)域發(fā)生了變化。而將計(jì)算的拷貝數(shù)譜（基因型信息）和我們常規(guī)的表型分析結(jié)合起來，可以更加深刻的了解腫瘤細(xì)胞惡性表達(dá)程序。
數(shù)據(jù)及代碼：
數(shù)據(jù)：GSE148673
代碼：https://github.com/navinlabcode/copykat（包括測(cè)試數(shù)據(jù)）
（所以不懂算法的原理和流程不要害怕，安裝R包后一行代碼就可以得到計(jì)算結(jié)果，我們只要對(duì)算法有一個(gè)粗略的了解就可以啦。）
主要內(nèi)容
一、CopyKAT 方法的整體流程
二、CopyKAT方法效能評(píng)估
為了評(píng)估CopyKAT的效能，對(duì)于來自3’端scRNA-seq（10X）測(cè)序的1480個(gè)乳腺癌細(xì)胞，作者分別使用CopyKAT和inferCNV計(jì)算拷貝數(shù)譜。同時(shí)提取該患者的數(shù)百萬個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行bulk DNA測(cè)序，計(jì)算全基因組的bulk DNA拷貝數(shù)譜作為真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)。
通過多種方法比較，結(jié)果顯示，相比inferCNV方法，CopyKAT與bulk DNA拷貝數(shù)譜具有較高的一致性(Pearson correlation= 0.82)，其估計(jì)的拷貝數(shù)譜更接近DNA拷貝數(shù)狀態(tài)(p<0.001)(圖2g)；在不同大小的基因間斷下，CopyKAT的穩(wěn)定性也明顯高于infer CNV(圖2h)。在合適的基因組分辨率下(5 Mb)，CopyKAT可以通過scRNA-seq精確推斷DNA拷貝數(shù)的狀態(tài)。
三、CopyKAT在不同實(shí)體瘤中的應(yīng)用
作者將CopyKAT應(yīng)用于先前發(fā)表的5例胰腺癌的9,717個(gè)細(xì)胞、5例三陰性乳腺癌的8,944個(gè)細(xì)胞、5例甲狀腺未分化癌患者的19,568個(gè)細(xì)胞的3’端scRNA-seq數(shù)據(jù)中（10X）。分別計(jì)算了它們的拷貝數(shù)譜，并在每個(gè)個(gè)體中成功識(shí)別了非整倍體腫瘤細(xì)胞亞群和二倍體的正常細(xì)胞亞群，并和通過特異性基因表達(dá)標(biāo)記識(shí)別的結(jié)果相驗(yàn)證?？傊?，CopyKAT可以在不需要特異性基因表達(dá)標(biāo)記的情況下，僅根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)推斷的非整倍體拷貝數(shù)譜，準(zhǔn)確地(98%±3% s.d)區(qū)分多種實(shí)體腫瘤中的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞。
四、CopyKAT適用于多種單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)
在確定CopyKAT方法適用3’ 端的高通量scRNA-seq數(shù)據(jù)后，作者進(jìn)一步研究該方法適不適用其他的測(cè)序技術(shù)（SMART-seq2或高通量的5’端scRNA-seq技術(shù)）。作者對(duì)2例雌激素受體陽(yáng)性侵襲的導(dǎo)管癌（ER+ IDC）患者進(jìn)行5’端高通量單細(xì)胞RNA測(cè)序（10X）, 同時(shí)還選取了SMART-seq2測(cè)序的兩例GBM患者的scRNA-seq數(shù)據(jù)（GSE131928，先前發(fā)表）。
在ER+ IDC中，CopyKAT推斷的結(jié)果和scRNA-seq表達(dá)數(shù)據(jù)的聚類結(jié)果一致(圖4b,d)。這驗(yàn)證了CopyKAT預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。在GBM中，CopyKAT推斷的非整倍體腫瘤細(xì)胞簇表達(dá)了高水平的EGFR(圖4f,h)，這是GBM個(gè)體中已建立的腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物。這些數(shù)據(jù)結(jié)果表明了CopyKAT與廣泛的測(cè)序技術(shù)兼容。
五、結(jié)合腫瘤的基因型和表型
為了刻畫腫瘤的克隆亞結(jié)構(gòu)并將腫瘤基因型與表型聯(lián)系起來，作者將CopyKAT應(yīng)用于三個(gè)TNBC個(gè)體的scRNA-seq數(shù)據(jù)。根據(jù)拷貝數(shù)差異，對(duì)推斷出的拷貝數(shù)譜進(jìn)行聚類，識(shí)別克隆亞群體。并計(jì)算每個(gè)簇的一致性拷貝數(shù)譜，以識(shí)別拷貝數(shù)差異的基因組區(qū)域。根據(jù)這些亞克隆的一致性譜，對(duì)不同的亞克隆群體進(jìn)行差異表達(dá)分析和基因signature分析，以確定亞克隆之間的表型差異。
文末小結(jié)
尼古拉斯作為腫瘤進(jìn)化領(lǐng)域的大牛，以往著重于單細(xì)胞DNA方面的分析。這次開發(fā)的CopyKAT方法，在scRNA-seq識(shí)別拷貝數(shù)譜、分類腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞、刻畫克隆亞結(jié)構(gòu)方向，提供了一個(gè)強(qiáng)大的自動(dòng)化的工具。文章首先介紹了CopyKAT算法的原理和計(jì)算流程；接著對(duì)比inferCNV和bulk DNA-seq的識(shí)別結(jié)果，評(píng)估CopyKAT方法的效能；然后將該算法應(yīng)用于不同的癌型、不同的測(cè)序技術(shù)下，驗(yàn)證了CopyKAT算法的廣泛的適用性；最后使用CopyKAT算法識(shí)別三個(gè)乳腺癌患者的克隆亞結(jié)構(gòu)，聯(lián)系腫瘤細(xì)胞的基因型和表型，為研究者研究腫瘤細(xì)胞的惡性表達(dá)程序提供了一個(gè)新的方向。
所以，最簡(jiǎn)單的，我們可以單純的使用該方法區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，以方便我們研究腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異；更進(jìn)一步，在腫瘤研究中，研究者可以結(jié)合差異表達(dá)分析、GSVA分析和識(shí)別的腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)譜，研究基因型和表型之間的聯(lián)系；難度更大一點(diǎn)，還可以利用識(shí)別的拷貝數(shù)譜，推測(cè)克隆亞結(jié)構(gòu)，研究腫瘤進(jìn)化。
