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單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組揭示肺類癌的腫瘤微環(huán)境
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被用作分析傳統(tǒng)肺癌腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性的有力工具。但肺類癌在單細(xì)胞水平上的特征尚未確定。今天小編給大家分享一篇2022年2月22日發(fā)表在INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER（IF：7.396）上的文章，這項(xiàng)研究通過類癌細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組反映了腫瘤間的異質(zhì)性和臨床病理特征。并且為肺類癌微環(huán)境的細(xì)胞組成以及潛在的細(xì)胞間相互作用提供了全面的見解。揭示了肺類癌新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
一、研究背景
肺癌是一種異質(zhì)性疾病，包括不同的組織病理學(xué)亞型。肺類癌，也稱為肺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或肺類癌，是一種罕見的肺部腫瘤，平均而言，肺類癌比傳統(tǒng)肺癌有更好的預(yù)后。但是仍有疾病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)。最近的幾項(xiàng)單細(xì)胞研究為更常見的肺癌（如腺癌和鱗狀細(xì)胞癌）的細(xì)胞異質(zhì)性提供了詳細(xì)的見解。然而，肺類癌在單細(xì)胞水平上的特征仍然未知。
此外，預(yù)測(cè)靶標(biāo)和免疫治療的有效性受到腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的限制，其中腫瘤可能存在原發(fā)性耐藥腫瘤細(xì)胞亞克隆，以及復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，從而影響對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)。而單細(xì)胞基因表達(dá)譜可以克服這一限制，并已經(jīng)為肺腺癌的細(xì)胞異質(zhì)性提供了有價(jià)值的見解。
為了研究肺類癌中的細(xì)胞組成和單細(xì)胞基因表達(dá)譜，作者對(duì)3個(gè)類癌腫瘤和正常肺組織樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，并綜合分析了肺類癌的細(xì)胞組成。通過分析類癌腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞基因表達(dá)譜揭示了臨床病理特征。作者還發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境的特征包括具有非炎癥特征的單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞、腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、一系列血管平滑肌細(xì)胞和周皮細(xì)胞以及具有癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞樣特征的肌成纖維細(xì)胞。
二、結(jié)果
1.單細(xì)胞RNA測(cè)序揭示肺類癌的細(xì)胞多樣性
為了在單細(xì)胞水平上探討肺類癌的細(xì)胞組成及其腫瘤微環(huán)境，作者從3例未經(jīng)治療的肺類癌患者(圖1A)中采集了腫瘤組織和正常肺組織的新鮮組織樣本。這3例患者的腫瘤細(xì)胞均顯示呈巢狀生長(zhǎng)，并表達(dá)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記蛋白突觸素和嗜色粒蛋白A(圖1B)。兩例非典型類癌(患者2和3)在診斷時(shí)均有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。這些腫瘤組織樣本被酶解，并進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。還有來自先前發(fā)表的隊(duì)列研究(患者4-10)的7個(gè)正常肺組織樣本的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)被納入隨后的分析。本研究共分析了73105個(gè)單細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，其中經(jīng)過質(zhì)量控制和篩選后保留了64697個(gè)高質(zhì)量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組(圖1C)。
接下來，作者對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聚類分析的可視化，發(fā)現(xiàn)正常和腫瘤組織樣本之間存在明顯的偏態(tài)(圖1D)。并且不同患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組沒有表現(xiàn)出樣本間的批次效應(yīng)(圖1E)。此外，作者通過典型標(biāo)記基因的基因表達(dá)定義了上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞(圖1F)。作者發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織樣本中，主要包括上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，而在正常組織樣本中，免疫單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組更豐富(圖1G)。
圖1：肺類癌的單細(xì)胞RNA測(cè)序。
2.肺類癌的腫瘤間異質(zhì)性反映了其臨床病理特征和分子亞型
作者進(jìn)一步對(duì)上皮細(xì)胞重新進(jìn)行聚類分析。發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞簇由不同的患者共享，而腫瘤細(xì)胞簇具有高度的患者特異性（圖 2A）。在正常細(xì)胞簇中，使用典型標(biāo)記基因和預(yù)定義的基因特征，作者鑒定了 1 型和 2 型肺泡上皮細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、棒狀細(xì)胞和基底細(xì)胞（圖 2A、B）。作者還在患者之間的腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)的基因（圖 2C），如 CD44、TFF3 和 EGFR，通過免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它們與差異蛋白表達(dá)相關(guān)（圖2D）。為了進(jìn)一步探索患者間的異質(zhì)性，作者從單細(xì)胞基因表達(dá)譜中推斷出不同的功能特征，即細(xì)胞周期階段、線粒體讀數(shù)的比例和信號(hào)通路活性?；颊?2 的腫瘤細(xì)胞在 S 期的細(xì)胞比例最高，同時(shí)在免疫組織化學(xué)中顯示出最高的 Ki67 增殖指數(shù)（圖 2E）。在患者 3 的腫瘤細(xì)胞中觀察到最高比例的線粒體讀數(shù)，其特征是局灶性腫瘤壞死（圖 2F）。患者 3 的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在 EGFR 通路的活性得分很高，并且在蛋白質(zhì)水平上有較強(qiáng)的 EGFR 表達(dá)（圖 2D，G）。雌激素和雄激素受體信號(hào)通路活性評(píng)分與患者性別相關(guān)（圖 2G；臨床特征見圖 1A）。最近，已經(jīng)表明，基于轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳特征，肺類癌可以分為三個(gè)不同的分子簇。 在本項(xiàng)研究的單細(xì)胞基因表達(dá)譜中，作者將患者 2 和 3 的腫瘤分配到集群 A1，將患者 1 的腫瘤分配到集群 A2 和集群 B（圖 2H）。值得注意的是，免疫和基質(zhì)細(xì)胞區(qū)室僅表現(xiàn)出較小的分子簇基因特征表達(dá)分?jǐn)?shù)。總之，肺類癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組顯示出腫瘤間異質(zhì)性，并且反映了不同的臨床和組織形態(tài)學(xué)特征，例如患者的性別、腫瘤增殖活性和腫瘤壞死，以及最近提出的肺類癌的分子簇等。
圖2：肺類癌腫瘤細(xì)胞的腫瘤間異質(zhì)性。
3.肺類癌的免疫微環(huán)境以非炎癥性單核細(xì)胞來源的髓樣細(xì)胞為特征
作者使用典型標(biāo)記基因和預(yù)定義的基因特征，將免疫單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行亞組化并重新聚類（圖 3A、B），并鑒定了不同的淋巴細(xì)胞，例如常規(guī) T 細(xì)胞、CD8+ T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞和漿細(xì)胞（圖 3A）。平均而言，腫瘤組織中淋巴細(xì)胞類型的比例與正常組織非常相似，同時(shí)還注意到腫瘤和正常組織中的一些患者間異質(zhì)性（圖 3C）。總之，肺類癌的淋巴微環(huán)境類似于正常肺實(shí)質(zhì)的淋巴細(xì)胞室。在骨髓細(xì)胞室中，作者在腫瘤和正常組織中鑒定出具有不同豐度的單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞（圖 3A）。在單核細(xì)胞中，經(jīng)典的單核細(xì)胞簇 2 在腫瘤組織中富集（圖 3D）。常規(guī)樹突狀細(xì)胞由兩個(gè)簇組成，其中 CD141+ 簇 1 主要存在于腫瘤組織中（圖 3E）。雖然單核細(xì)胞和常規(guī)樹突狀細(xì)胞的比例在腫瘤與正常組織中的患者中異質(zhì)性增加，但在所分析的所有三種類癌中，單核細(xì)胞來源的骨髓細(xì)胞均持續(xù)增加（P = 0.007）。單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞的進(jìn)一步特征是 SELENOP、C1QA、C1QB、C1QC 和趨化因子 CCL3 和 CCL4 的高表達(dá)（圖 3F）。與正常組織相比，腫瘤組織中單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞顯示出與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的各種基因特征的表達(dá)分?jǐn)?shù)略低（圖 3G）。這一部分的分析結(jié)果表明，肺類癌免疫微環(huán)境主要由非炎癥性單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞主導(dǎo)。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序分析的三種肺類癌的骨髓細(xì)胞室的組成在某種程度上是異質(zhì)的。
圖3：肺類癌中免疫腫瘤微環(huán)境的組成。
4.血管細(xì)胞和CAF樣肌成纖維細(xì)胞構(gòu)成了肺類癌的基質(zhì)微環(huán)境
為了深入了解基質(zhì)微環(huán)境的組成，作者使用典型標(biāo)記基因和預(yù)定義的基因特征鑒定了不同的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞簇（圖 4A、B）。在內(nèi)皮細(xì)胞中，作者根據(jù)預(yù)定義的標(biāo)記基因特征區(qū)分支氣管、毛細(xì)血管、動(dòng)脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（圖 4A）。雖然正常肺實(shí)質(zhì)中存在不同亞型的內(nèi)皮細(xì)胞，但腫瘤組織中支氣管型內(nèi)皮細(xì)胞顯著富集（P =0 .007）（圖 4A）。作者還發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞在腫瘤組織中高度富集 (P = 0.0074)，并表現(xiàn)出高表達(dá)的細(xì)胞外基質(zhì)成分，如 COL1A1、COL3A1 和 COL6A3，以及基質(zhì)降解酶，如 SULF1（圖 4C），表明這些細(xì)胞可能參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑。此外，肌成纖維細(xì)胞的特征在于 TGFβ 信號(hào)傳導(dǎo)通路的高活性（圖 4D）。在肌成纖維細(xì)胞中，與肌成纖維細(xì)胞簇 2 ，其他成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞簇相比，簇 1 顯示 FAP 和 MMP11 的過表達(dá)以及各種膠原蛋白的較高表達(dá)（圖 4E）。總之，這些數(shù)據(jù)表明肺類癌腫瘤組織中的肌成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征。類癌的基質(zhì)微環(huán)境以血管平滑肌細(xì)胞 (P = .0160) 和周細(xì)胞為主。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中的周細(xì)胞顯示出高表達(dá)的 RGS5（一種參與周細(xì)胞發(fā)育的基因）和 ACTA2（一種平滑肌標(biāo)記基因）（圖 4F）。我們發(fā)現(xiàn)這些基因以分級(jí)方式表達(dá)，這表明腫瘤組織中的周細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞形成一個(gè)連續(xù)體，而不是離散的細(xì)胞類型（圖 4G）。
圖4：肺類癌的間質(zhì)腫瘤微環(huán)境的組成。
5.腫瘤微環(huán)境細(xì)胞之間的相互作用可能激活NOTCH、VEGF、TGFβ和JAK/STAT信號(hào)
接下來，作者觀察到不同的細(xì)胞類型在肺類癌微環(huán)境中特別富集（圖 5A）。為了描繪微環(huán)境和腫瘤細(xì)胞之間的功能關(guān)系，作者量化了潛在的旁分泌受體-配體相互作用。在基質(zhì)微環(huán)境的細(xì)胞類型之間發(fā)現(xiàn)了大多數(shù)潛在的相互作用，包括腫瘤相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞較少參與潛在的旁分泌相互作用（圖 5B)。此外，作者發(fā)現(xiàn)許多相互作用可能激活 NOTCH、TGFβ、VEGF 和 JAK/STAT 信號(hào)（圖 5C）。腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞接收潛在的 VEGF、TGFβ 和 NOTCH 通路激活信號(hào)，而肌成纖維細(xì)胞主要通過各種旁分泌和自分泌相互作用接收潛在的 TGFβ 通路激活信號(hào)。樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的骨髓細(xì)胞主要通過與其他免疫細(xì)胞的自分泌和旁分泌相互作用接收潛在的 JAK/STAT 通路激活信號(hào)。這些結(jié)果表明，各種基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的自分泌和旁分泌相互作用可能會(huì)塑造肺類癌腫瘤的微環(huán)境。
圖5：肺類癌微環(huán)境中潛在的旁分泌作用。
三、總結(jié)
這篇文章首次全面探究了肺類癌的細(xì)胞組成成分，揭示了其腫瘤微環(huán)境的非炎癥性和富含血管的特性，并概述了相關(guān)的細(xì)胞間相互作用，這些發(fā)現(xiàn)可能作為未來的治療方向。
參考文獻(xiàn)
1. Bischoff, P., Trinks, A., Wiederspahn, J., Obermayer, B., Pett, J.P., Jurmeister, P., Elsner, A., Dziodzio, T., Ruckert, J.C., Neudecker, J. et al. (2022) The single-cell transcriptional landscape of lung carcinoid tumors. Int J Cancer, 150, 2058-2071.
