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大家好呀，今天分享的文章的主題為分析非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中免疫細(xì)胞豐度、免疫細(xì)胞之間距離和免疫細(xì)胞和腫瘤之間距離對(duì)預(yù)后的影響，全面描述非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的突變和臨床病理背景下的空間免疫表型。文章思路清晰，于近期發(fā)表在《European Journal of Cancer》（IF =10）上，讓我們來(lái)一起學(xué)習(xí)一下吧！
Spatial immunophenotyping of the tumour microenvironment in nonesmall cell lung cancer
摘要
腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞與預(yù)后和治療反應(yīng)有關(guān)。本文目的是全面描述NSCLC的突變和臨床病理背景下的空間免疫表型。建立了多重?zé)晒獬上窆艿?，以?59例NSCLC病例中對(duì)13個(gè)免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行空間定量：CD 4效應(yīng)細(xì)胞（CD 4-Eff）、CD 4調(diào)節(jié)細(xì)胞（CD 4-Treg）、CD 8效應(yīng)細(xì)胞（CD 8-Eff）、CD 8調(diào)節(jié)細(xì)胞（CD 8-Treg）、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞（M1）、CD 163+骨髓細(xì)胞（CD 163）、M2巨噬細(xì)胞（M2）、未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（iDC）、成熟樹(shù)突狀細(xì)胞（mDC）和樹(shù)突狀細(xì)胞（mDC）以及漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞（pDCs）。
1.NSCLC 空間表型免疫細(xì)胞的管道
建立了一個(gè)高通量的工作流程，其中包括:
(1) T 和 B 淋巴細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亞群的組織切片多色熒光（mIF）染色 ;
(2)多光譜掃描;
(3)由專家病理學(xué)家和基于機(jī)器學(xué)習(xí)的組織和細(xì)胞分割的圖像管理;
(4)仔細(xì)的數(shù)據(jù)管理和標(biāo)記信號(hào)的閾值化，隨后的免疫細(xì)胞表型分型;
(5)基于標(biāo)記表達(dá)和細(xì)胞分割的空間定量。（圖1A）
對(duì)359例NSCLC進(jìn)行管道處理，經(jīng)過(guò)去除不良樣本剩余300個(gè)進(jìn)行后續(xù)的分析。將每個(gè)免疫面板中不同免疫標(biāo)記物的表達(dá)結(jié)合起來(lái)，將每個(gè)細(xì)胞分配到13種免疫細(xì)胞亞型中的一種，包括T和B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和髓系細(xì)胞、NK細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞（NKT）和樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）。（圖1B）
2.NSCLC的免疫景觀
為了研究腫瘤和腫瘤基質(zhì)中免疫細(xì)胞分布情況，比較了13種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)比例，并計(jì)算免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。
圖2A：相對(duì)腫瘤而言，CD4 Eff是在腫瘤基質(zhì)中最為豐富的免疫細(xì)胞；相反，iDC、mDC和NK細(xì)胞在腫瘤中較為豐富，但是富集量較小。腺癌（AC）和鱗癌（SCC）的免疫環(huán)境只有微小差異，經(jīng)多次檢測(cè)調(diào)整后無(wú)顯著差異。
圖2B：通常高淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)伴隨著M1巨噬細(xì)胞的豐度，而M2巨噬細(xì)胞僅與腫瘤基質(zhì)中的CD4 Eff和CD8 Eff細(xì)胞相關(guān)。腫瘤基質(zhì)中，pDC的豐度與B 細(xì)胞的豐度之間有意想不到的聯(lián)系。
3. 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)、臨床相關(guān)因素和存活率
分析了基質(zhì)和腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與年齡、性別、吸煙狀況和分期之間的關(guān)系，在調(diào)整多重測(cè)試后，沒(méi)有顯著相關(guān)性。作者又分析免疫浸潤(rùn)比例和生存之間的相關(guān)性，在多變量COX回歸分析中（獨(dú)立于分期、年齡和體能狀態(tài)），所有注釋的免疫細(xì)胞的整體的高密度與較長(zhǎng)的存活期相關(guān)。隨后，作者分析了每個(gè)注釋的免疫細(xì)胞亞群的預(yù)后影響，在NSCLC 隊(duì)列中，觀察到 CD4 Eff，CD4 Treg，CD8 Eff，CD8 Treg，B 細(xì)胞，M1和pDC與更長(zhǎng)的生存期呈正相關(guān)，在腺癌和鱗狀細(xì)胞癌亞組中也觀察到大多數(shù)相關(guān)性。調(diào)整協(xié)變量逐步Cox回歸模型確定了CD4 Eff和CD8 Treg作為最重要的積極的預(yù)后參數(shù)。結(jié)果表明，許多免疫細(xì)胞亞群對(duì)傳統(tǒng)的臨床參數(shù)有良好的預(yù)后影響，而且這種影響并不局限于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。
4. 腫瘤和免疫細(xì)胞的空間分析
眾所周知，腫瘤的免疫過(guò)程和免疫細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)，測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，不僅可以觀察到單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)情況，也可以觀察到細(xì)胞的空間位置。免疫細(xì)胞的數(shù)量對(duì)腫瘤的治療很關(guān)鍵，但同時(shí)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的距離也很重要。因此作者通過(guò)最近鄰分析來(lái)測(cè)量了腫瘤和免疫細(xì)胞之間的距離。NK-和NKT-細(xì)胞由于其豐度較低，無(wú)法進(jìn)行分析。
與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的不同免疫細(xì)胞亞群的分布顯示出兩種主要模式，1. 效應(yīng)CD4, CD8 Eff， M1巨噬細(xì)胞和髓樣聚合在腫瘤細(xì)胞附近，相比之下，其他免疫細(xì)胞在該區(qū)域分布更均勻，與腫瘤細(xì)胞的平均距離更長(zhǎng)；2.成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞表現(xiàn)出相反的形態(tài)，且主要位于遠(yuǎn)處。
作者又分析了腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的平均距離對(duì)總生存期的影響，當(dāng)分析平均距離時(shí)，同樣的免疫細(xì)胞也顯示出與基于密度的存活率相關(guān)，這可以解釋為距離與密度有關(guān)的事實(shí)。成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞是個(gè)例外，這些細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的距離越遠(yuǎn)，存活時(shí)間越長(zhǎng)。在調(diào)整臨床參數(shù)后，僅CD8Eff與腫瘤細(xì)胞的距離與生存存在顯著聯(lián)系。（圖3）
當(dāng)對(duì)免疫細(xì)胞彼此的距離進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)距離相近的淋巴細(xì)胞亞群(CD4 Eff、CD4 Treg 、CD8 Eff, CD8 Treg和B細(xì)胞)與長(zhǎng)生存期相關(guān)。反觀巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亞群，這種關(guān)系并不清楚。當(dāng)調(diào)整主要的臨床指標(biāo)時(shí)，只有 CD8 Treg 和 B 細(xì)胞之間的接近表明與更長(zhǎng)的總生存期有關(guān)。
接下來(lái)，作者又將距離和免疫細(xì)胞的豐度相結(jié)合來(lái)分析和生存之間的相關(guān)性，密度與距離的比率增加了影響未調(diào)整和調(diào)整的存活率。然而，一個(gè)顯著的例外是淋巴細(xì)胞亞群與CD8 Treg細(xì)胞的關(guān)系。當(dāng)考慮到與CD8 Treg細(xì)胞的距離時(shí)，密度與距離的比率增加時(shí)淋巴細(xì)胞的有利預(yù)后影響減弱。（圖4）
為了評(píng)估距離和密度與生存的相互關(guān)系，作者進(jìn)行了多變量逐步COX回歸分析，包括所有免疫細(xì)胞密度和所有淋巴細(xì)胞亞群的距離以及年齡、分期和狀態(tài)。再次，低階段和良好的表現(xiàn)狀態(tài)顯示了對(duì)生存的強(qiáng)烈影響。獨(dú)立地，高密度的 CD163和 M1巨噬細(xì)胞對(duì)預(yù)后有利。然而，不僅純密度重要，而且免疫細(xì)胞之間的距離也表現(xiàn)出獨(dú)立的預(yù)后影響。當(dāng)CD8 Treg和B細(xì)胞,B細(xì)胞和CD4 Treg細(xì)胞距離更近的時(shí)候，生存時(shí)間更長(zhǎng)。此外，CD8 Eff細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞越接近，患者的生存時(shí)間就越長(zhǎng)，特別是所有選定參數(shù)的HR最低時(shí)。M1和M2之間距離更近時(shí)，生存更差。（圖5）
總之，這些結(jié)果表明，免疫細(xì)胞的密度和位置都具有預(yù)后信息，并且在生物標(biāo)志物研究中應(yīng)考慮這兩個(gè)特征。
小結(jié)
本文邏輯清晰，逐步分析得分析揭示了和預(yù)后相關(guān)的信息。首先本文開(kāi)發(fā)了一個(gè)管道，這個(gè)管道可以量化免疫細(xì)胞以及免疫細(xì)胞空間位置，并設(shè)計(jì)標(biāo)記基因來(lái)識(shí)別不同類型的免疫細(xì)胞。本文最大的亮點(diǎn)在于研究腫瘤和腫瘤基質(zhì)的免疫細(xì)胞的豐度，以及豐度對(duì)癌癥預(yù)后的影響，免疫細(xì)胞和腫瘤之間的距離以及距離對(duì)預(yù)后的影響，并結(jié)合兩者——免疫細(xì)胞豐度和距離來(lái)預(yù)測(cè)和預(yù)后的而影響，從兩個(gè)角度以及將兩個(gè)角度結(jié)合更具有說(shuō)服力，并在其它癌癥中進(jìn)行研究。思路清晰，值得我們學(xué)習(xí)！！
