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今天小編給大家?guī)?lái)一篇?jiǎng)倓偘l(fā)表在International Journal of Biological Sciences（IF：10.75）文章題目是Cancer-associated fibroblasts promote migration and invasion of non-small cell lung cancer cells via METTL3-mediated RAC3 m6A modification.
這篇文章主要研究了m6A修飾與CAF在轉(zhuǎn)移中的作用。研究發(fā)現(xiàn)CAF通過(guò)上調(diào)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中m6A的修飾來(lái)促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。NSCLC細(xì)胞中的甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3介導(dǎo)CAFs對(duì)m6A的修飾，并受CAFs分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGFA的調(diào)節(jié)。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的METTL3基因敲除顯著抑制了細(xì)胞的遷移和侵襲，并抑制了體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。METTL3與肺癌預(yù)后不良有關(guān)。機(jī)制研究表明，METTL3可增加RAC3 mRNA的m6A水平，增加RAC3 mRNA的穩(wěn)定性和翻譯性。RAC3可能通過(guò)AKT/NF-κB途徑促進(jìn)細(xì)胞遷移。
肺癌是全球最致命的癌癥，肺癌的主要病理類型是非小細(xì)胞肺癌，占肺癌病例的85%。NSCLC主要包括肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)和大細(xì)胞癌。盡管近年來(lái)治療取得了進(jìn)展，但肺癌的死亡率仍然很高。由于轉(zhuǎn)移是肺癌相關(guān)死亡的主要原因，因此迫切需要深入了解肺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
腫瘤微環(huán)境(TME)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。腫瘤細(xì)胞和TME之間的相互作用可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)是TME中的主要間質(zhì)細(xì)胞，它們通過(guò)分泌細(xì)胞因子和外泌體刺激腫瘤進(jìn)展。以前的研究還發(fā)現(xiàn)，CAF通過(guò)分泌KRT8和HMGB1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
表觀遺傳修飾，已經(jīng)成為各種生理和病理過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在各種mRNA甲基化中，m6A是最豐富的RNA修飾。m6A甲基化對(duì)RNA的命運(yùn)起著重要的作用。研究表明，m6A基因的異常修飾參與了疾病的進(jìn)展，m6A修飾有助于癌癥的進(jìn)展。
CAF影響肺癌進(jìn)展的不同機(jī)制已被揭示；然而，是否涉及m6A甲基化還沒(méi)有得到評(píng)估。在這項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)CAFs通過(guò)調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞中m6A甲基化來(lái)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，并證明了CAFs對(duì)m6A甲基化的影響。并且確定RAC3為MetTL3的修飾靶點(diǎn)，RAC3通過(guò)AKT/NF-κB信號(hào)途徑刺激非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移。
為了探討CAF對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的影響，從肺癌組織和癌旁組織中采集CAF和正常成纖維細(xì)胞，制備CAF-CM(條件培養(yǎng)液)和NF-CM(條件培養(yǎng)液)。作者選擇了三個(gè)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系：A549細(xì)胞(腺癌)、H1299細(xì)胞(癌)和H661細(xì)胞(大細(xì)胞癌)。
實(shí)驗(yàn)顯示CAF和NFs均可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)，且CAF的作用強(qiáng)于NFS（圖1A）。并且CAF促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞的集落形成特性(圖1B，C)。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能取決于它們的遷移和侵襲能力。采用wound healing（創(chuàng)傷愈合）實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲行為。由于CAF促進(jìn)細(xì)胞增殖，為了排除這種對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的影響，用0.05μM絲裂霉素C預(yù)處理細(xì)胞，抑制細(xì)胞增殖，大約85%-90%的細(xì)胞存活。創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)表明，CAF和NFs均能促進(jìn)細(xì)胞遷移，但CAF更有效(圖1D，E)。在Transwell試驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果(圖1F，G)。綜上，CAF增強(qiáng)了NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移潛能。
很多研究表明m6A的異常修飾參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，但CAF是否影響肺癌細(xì)胞中的m6A修飾尚不清楚。為了解CAF對(duì)肺癌細(xì)胞m6A修飾的影響，作者用CAF-CM和NF-CM處理NSCLC細(xì)胞。CAF和NFs均提高了NSCLC細(xì)胞中m6A的修飾水平，但CAF更為有效。(圖2A-C)。
作者進(jìn)一步對(duì)CAF-CM的肺癌細(xì)胞進(jìn)行了MeRIP-seq。結(jié)果顯示，CAFs顯著增加了m6A修飾共識(shí)5’-RRACH-3’基序的甲基化，導(dǎo)致CAFs處理細(xì)胞中m6A水平的提高(圖2D-F)。上述結(jié)果表明，CAF提高了NSCLC細(xì)胞中m6A的修飾。
作者發(fā)現(xiàn)無(wú)論是在mRNA水平還是在蛋白質(zhì)水平，CAF顯著增加了NSCLC細(xì)胞中甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和去甲基酶FTO和ALKBH5三種調(diào)控因子的表達(dá)水平(圖3A)。由于CAFs提高了m6A的修飾水平，因此作者更關(guān)注甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3。為了確定METTL3在肺癌細(xì)胞m6A修飾中的作用。dot blot印跡分析顯示，當(dāng)METTL3過(guò)表達(dá)時(shí)，m6A水平升高，而當(dāng)METTL3被下調(diào)時(shí)，m6A水平下降，這表明METTL3將m6A修飾引入了肺癌細(xì)胞(圖3B，C)。然后，作者用CAF-CM處理METTL3基因敲除細(xì)胞。結(jié)果表明，METTL3基因敲除減弱了CAFs對(duì)m6A修飾的增強(qiáng)，表明CAFs通過(guò)METTL3上調(diào)了m6A修飾水平(圖3C)。
相比較正常細(xì)胞，METTL3在肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，當(dāng)比較配對(duì)的腫瘤組織和非腫瘤組織中的METTL3水平時(shí)，METTL3水平顯著高于非腫瘤組織（圖3D，E），這表明METTL3可能促進(jìn)肺癌的進(jìn)展(圖3E)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，在肺癌細(xì)胞中降低了METTL3的表達(dá)，并測(cè)量了細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲。與對(duì)照組相比，METL3基因敲除顯著抑制了細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲(圖3F-H)。
接下來(lái)作者評(píng)估了METTL3在非小細(xì)胞肺癌患者中的臨床意義。TCGA數(shù)據(jù)顯示與健康對(duì)照組相比，METTL3在LUAD和LUSC患者中都高度表達(dá)(圖3I)。在LUAD和LUSC中，腫瘤組織中METTL3的表達(dá)水平都顯著高于正常組織；但在N0期和N1-N2期之間，METTL3的表達(dá)沒(méi)有顯著差異，表明METTL3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)關(guān)，GEO數(shù)據(jù)表明METTL3高表達(dá)與肺癌患者的低生存率相關(guān)(圖3J，K)。綜上所述，METTL3通過(guò)調(diào)節(jié)m6A的修飾參與了NSCLC的進(jìn)展。
雖然CAF增加了NSCLC細(xì)胞中m6A的水平，但CAF是如何調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞中m6A水平的尚不清楚。VEGFA在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。作者首先檢測(cè)了CAF和肺癌細(xì)胞釋放的VEGFA水平。ELISA結(jié)果顯示，兩種細(xì)胞分泌的VEGFA均高于肺癌細(xì)胞，其中CAF的VEGFA分泌量最高(圖4A)。為了探討VEGFA對(duì)肺癌細(xì)胞METTL3表達(dá)的影響，作者在DMEM/F12細(xì)胞中加入重組VEGFA，或在CAF-CM中加入VEGFA中和抗體，并將其用于培養(yǎng)肺癌細(xì)胞。添加重組VEGFA的DMEM/F12顯著增加了METTL3的表達(dá)，這與CAF-CM相似，而添加VEGFA中和抗體的CAF-CM顯著減弱了CAF-CM對(duì)METTL3表達(dá)的刺激作用（圖4B，C）。這些結(jié)果表明，CAFs通過(guò)分泌VEGFA提高了NSCLC細(xì)胞的METTL3水平。
RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，CAFs治療組中有397個(gè)基因上調(diào)，219個(gè)基因下調(diào)(圖5A-C)。KEGG通路分析表明，差異表達(dá)基因主要集中在mTOR、AMPK、蛋白質(zhì)消化吸收和藥物代謝等通路中(圖5D)。通過(guò)分析RNA-seq數(shù)據(jù)和MERIP-seq數(shù)據(jù)，作者進(jìn)一步研究了在mRNA水平和m6A水平都變化的基因。我們發(fā)現(xiàn)了增加了mRNA表達(dá)的73個(gè)超甲基化的m6A峰，并將這些峰稱為hyper-up基因。還發(fā)現(xiàn)了167個(gè)hyper-down基因、37個(gè)低上調(diào)基因和15個(gè)hypo-down基因(圖5E)。
由于m6A修飾可能會(huì)增加基因表達(dá)，作者篩選了hyper-up基因，特別是可以刺激細(xì)胞生長(zhǎng)的基因。其中RAC3基因的m6A水平和mRNA水平均增加，這與MERIP-seq和RNA-seq結(jié)果一致（圖5F，G）Western blotting結(jié)果表明，CAF上調(diào)了3種NSCLC細(xì)胞系中RAC3蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)了METTL3的表達(dá)(圖5H)。此外，肺癌組織中的RAC3水平高于配對(duì)的癌旁組織，并在LUAD和LUSC組織中顯著上調(diào)（圖5I，J）。并RAC3水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的相關(guān)性。在LUAD中，N0-N2期腫瘤組織中RAC3水平明顯高于正常組織；同樣，LUSC中N0-N3期腫瘤組織中RAC3水平顯著高于正常組織，而N0期和N1-N2期腫瘤組織中RAC3水平無(wú)顯著差異，提示RAC3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)無(wú)關(guān)(圖5K)。這些結(jié)果表明CAF促進(jìn)了RAC3的m6A修飾和表達(dá)，而RAC3與NSCLC的轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。
為了評(píng)估METTL3和RAC3轉(zhuǎn)錄本之間的直接相互作用，進(jìn)行了RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR檢測(cè)。與對(duì)照抗體IgG相比，METTL3特異性抗體顯著增加了RAC3的mRNA，CAF-CM顯著增強(qiáng)了這種結(jié)合（圖6A）。MeRIP-qPCR結(jié)果進(jìn)一步表明，METTL3過(guò)表達(dá)顯著增加了RAC3 mRNA中m6A的修飾。而當(dāng)METTL3在肺癌細(xì)胞中被敲除時(shí)，CAFs對(duì)m6A修飾的增加被減弱(圖6B)。
METTL3基因敲除降低了RAC3的mRNA水平，而METTL3過(guò)表達(dá)則增加了RAC3的轉(zhuǎn)錄。用CAF-CM處理METTL3基因敲除細(xì)胞。當(dāng)METTL3減少時(shí)，CAF對(duì)RAC3轉(zhuǎn)錄的刺激作用被阻斷（圖6C）。
此外，我們通過(guò)用放線菌素D處理細(xì)胞來(lái)研究METTL3對(duì)RAC3 mRNA穩(wěn)定性的影響。RAC3 mRNA的表達(dá)最初被降低；METTL3的沉默加速了mRNA的衰退，而強(qiáng)制表達(dá)METTL3則逆轉(zhuǎn)了這些影響(圖6D)。此外，在蛋白質(zhì)水平上，METTL3基因的敲除顯著降低了RAC3的蛋白質(zhì)水平；相反，METTL3的過(guò)表達(dá)顯著增加了RAC3的蛋白質(zhì)水平(圖6E)。CAF增加了RAC3的表達(dá)；然而，當(dāng)METTL3被下調(diào)時(shí)，這種影響被緩解(圖6E)。這說(shuō)明METTL3甲基化了RAC3 mRNA，并通過(guò)防止降解來(lái)維持其穩(wěn)定性，這導(dǎo)致了RAC3表達(dá)的增加。CAF以CAF-METTL3-m6A修飾依賴的方式增加RAC3的表達(dá)。
CAF-CM使p-AKT和p-P65水平升高，而總AKT和P65水平不變（圖7A）。當(dāng)METTL3被敲除時(shí)，CAF-CM對(duì)AKT/NF-κB通路沒(méi)有影響。當(dāng)AKT抑制劑Perifosine或NF-κB抑制劑JSH23預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，CAF對(duì)細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用顯著減弱，METTL3基因敲除減弱了CAF的促進(jìn)作用(圖7B)。
已有研究表明RAC3參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。當(dāng)RAC3在肺癌細(xì)胞中被敲除時(shí)，CAF促進(jìn)的遷移作用減弱。相反，當(dāng)RAC3在肺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)，CAF促進(jìn)了遷移(圖7C)。RAC3的沉默抑制了CAF對(duì)AKT/NF-κB通路的激活，而RAC3的過(guò)表達(dá)則增強(qiáng)了AKT/NF-κB通路的激活（圖7D）。
作者首先通過(guò)慢病毒感染建立了穩(wěn)定的METTL3基因敲除細(xì)胞系A(chǔ)549-METTL3-KD。并通過(guò)Western blotting檢測(cè)METTL3基因敲除的效率(圖8A，B)。評(píng)估METTL3在細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。如所示，肺癌細(xì)胞中METTL3表達(dá)的減少顯著抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲（圖8C-E）。
接下來(lái)，作者將小鼠分為A549細(xì)胞組、A549細(xì)胞+CAFs組、A549-METTL3-KD細(xì)胞組和A549-METTL3-KD細(xì)胞+CAFs組。CAF顯著刺激腫瘤生長(zhǎng)。有趣的是，我們觀察到A549-METTL3-KD細(xì)胞不形成腫瘤。這與我們的體外研究一致，該研究表明METTL3抑制抑制了肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖8F，G）。值得注意的是，當(dāng)肺癌細(xì)胞中的METTL3被敲除時(shí)，CAF對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的刺激作用顯著減弱。
此外，作者利用腫瘤組織研究了其潛在的機(jī)制。免疫組織化學(xué)分析顯示，CAFs可增加腫瘤組織中METTL3和RAC3的表達(dá)(圖8H)。dot blot分析顯示，CAF顯著增加腫瘤組織中m6A的水平；然而，METTL3基因敲除取消了這一作用(圖8I)。此外，CAF上調(diào)了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP9和Twist1，上調(diào)了RAC3，并激活了AKT(圖8J)。這些發(fā)現(xiàn)與我們的體外研究結(jié)果一致，提示CAF通過(guò)METTL3介導(dǎo)的m6A修飾RAC3 mRNA，并激活轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和AKT途徑，促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)。
作者研究表明CAF通過(guò)依賴m6A修飾的調(diào)控機(jī)制促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，而METTL3在NSCLC細(xì)胞中介導(dǎo)m6A修飾。進(jìn)一步確定RAC3是METTL3的下游靶點(diǎn)，RAC3通過(guò)AKT/NF-κB途徑促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的遷移，提示RAC3 m6A修飾可能成為肺癌治療的潛在治療靶點(diǎn)(圖8K)。
