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各位小伙伴，大家好呀！ 今天給大家?guī)淼氖且黄鶕?jù)單核和空間轉(zhuǎn)錄組分析確定了胰腺癌中與新輔助治療相關(guān)的多細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的一篇文章，在這項(xiàng)研究中，研究者使用單核RNA測(cè)序和全轉(zhuǎn)錄組數(shù)字空間分析(DSP) 對(duì)PDAC腫瘤標(biāo)本構(gòu)建了組成PDAC的細(xì)胞亞型和空間群落的高分辨率分子景觀，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了惡性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)樣惡性細(xì)胞祖細(xì)胞程序，在化療和放療后富集，并且與不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步基于惡性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞對(duì)接受新輔助治療的胰腺導(dǎo)管腺癌患者進(jìn)行重新劃分，經(jīng)過完善的細(xì)胞分類學(xué)可以為臨床PDAC患者的分層提供框架，提供新的精準(zhǔn)靶向治療方案。快來和小編一起看看吧~
研究背景
胰腺導(dǎo)管腺癌越來越多地采用新輔助化療或放射治療的形式，但在很大程度上來說都是一種難以治療的疾病。腫瘤微環(huán)境影響細(xì)胞毒性的治療效果，但是促進(jìn)了輔助治療的效果，但是對(duì)于腫瘤微環(huán)境的空間結(jié)構(gòu)和多細(xì)胞相互作用的了解仍然有限，單核RNA測(cè)序(snRNA-seq)可以很好地分析惡性細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，并可以對(duì)冷凍樣本進(jìn)行測(cè)序，作者在本研究中對(duì)43個(gè)腫瘤患者（18個(gè)未治療和25個(gè)治療）共224988個(gè)細(xì)胞進(jìn)行snRNA-seq，發(fā)現(xiàn)在治療后殘留的腫瘤衍生的類器官中富集一種獨(dú)特的神經(jīng)樣祖細(xì)胞(NRP)惡性程序；同時(shí)與全轉(zhuǎn)錄組空間圖譜相結(jié)合確定了幾個(gè)不同的多細(xì)胞群落，其中包括一個(gè)表征了NRP惡性程序和CD8+T細(xì)胞的治療富集的細(xì)胞亞型。此外，作者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間受體配體相互作用在治療后殘留腫瘤中富集存在，并作為改進(jìn)胰腺癌新輔助治療的潛在靶點(diǎn)。
結(jié)果一：對(duì)冷凍人類PDAC腫瘤樣本進(jìn)行snRNA-seq分析
作者在本研究中對(duì)43個(gè)腫瘤患者（18個(gè)未治療和25個(gè)治療）共224988個(gè)細(xì)胞進(jìn)行snRNA-seq（圖1A），在25個(gè)接受治療的患者中，14名患者接受FOLFIRINOX多周期化療和多段放療（氟尿嘧啶/卡培他濱CRT)； 5名患者被納入一項(xiàng)臨床試驗(yàn)(NCT01821729)，研究新輔助CRT加用氯沙坦(CRTL)。另外6例患者接受其他形式的新輔助治療。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無監(jiān)督聚類后共分為33個(gè)亞群，利用Marker基因進(jìn)行細(xì)胞注釋后得到12種細(xì)胞類型。其他細(xì)胞類型包括惡性上皮細(xì)胞、非惡性上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞和各種基質(zhì)細(xì)胞（胰腺內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等）（圖1B-C）。惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞由CNA判定。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)一小部分腺泡細(xì)胞(reg +)表達(dá)高水平的再生家族成員基因(如REG1A和REG3A)，這些基因與促進(jìn)胰腺炎癥、腺泡-導(dǎo)管上皮生(ADM)和胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)(圖1d)有關(guān)。snRNA-seq捕獲的上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞類型比例的代表性分布與多路離子束成像(MIBI)在單個(gè)腫瘤內(nèi)部和腫瘤之間相比，異質(zhì)性相差較大(圖1f)。最后，作者進(jìn)一步說明了新輔助治療相對(duì)于CRT患者的免疫功能更強(qiáng)。在5例患者的臨床亞組(未治療、CRT和CRTL)中，接受新輔助治療的腫瘤惡性細(xì)胞比例明顯較低(圖1g)，與組織學(xué)的情況一致。幾個(gè)非惡性細(xì)胞亞群在治療組之間存在顯著差異(圖1g)。例如，在免疫部分，新輔助CRTL中CD8+ T細(xì)胞的比例高于CRT，并且其中的CD8+ T細(xì)胞表達(dá)更高水平的效應(yīng)功能基因(如IL2、CCL4和CCL5)。這些結(jié)果與氯沙坦介導(dǎo)的瘤內(nèi)細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性增加一致。
圖1：未治療和治療的PDAC的snRNA注釋出的細(xì)胞類型多樣性。
結(jié)果二： ADM和非典型導(dǎo)管細(xì)胞。
在上皮腔室中，有低cna共表達(dá)導(dǎo)管和腺泡譜系的標(biāo)記物(圖1b,d和2c,d)，可能反映ADM, ADM在小鼠胰腺腫瘤的發(fā)生中起啟動(dòng)作用。慢性炎癥和激活KRAS突變與ADM狀態(tài)的持續(xù)和進(jìn)展到PanIN相關(guān)。與腺泡細(xì)胞相比，ADM細(xì)胞中HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP里面的signature的表達(dá)更高(圖2a)。此外，導(dǎo)管細(xì)胞的一個(gè)細(xì)胞亞群表達(dá)了高水平的導(dǎo)管(如CFTR)和惡性(如KRT5和KRT19)標(biāo)記物，但沒有升高的CNAs，因此在這篇文章里面該亞群被定義為非典型導(dǎo)管細(xì)胞(圖1b,d和2c,d)。接下來，作者根據(jù)該非典型導(dǎo)管細(xì)胞亞群進(jìn)一步進(jìn)行基因集的分析，發(fā)現(xiàn)該非典型導(dǎo)管細(xì)胞亞群具有早在PanIN2/3期就表達(dá)的基因(如KRT17)，并且相對(duì)于ADM細(xì)胞來說其具有更高水平的HALLMARK_KRAS_ SIGNALING_UP信號(hào)，因此這里作者提出可將該細(xì)胞亞群作為ADM進(jìn)展到PanINs的一個(gè)中間過程(圖1b,d和2c,d)。最后，作者進(jìn)行偽時(shí)序分析，推斷出從腺泡細(xì)胞到ADM到導(dǎo)管細(xì)胞到非典型導(dǎo)管細(xì)胞到惡性細(xì)胞的主要偽時(shí)間軌跡，并且與此同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)HALLMARK_KRAS_SIGNALING_UP信號(hào)通路特征平行于上述細(xì)胞軌跡并且單調(diào)增加，因此該結(jié)論更加支持了ADM和非典型導(dǎo)管細(xì)胞可以作為PDAC腫瘤發(fā)生的相關(guān)中間狀態(tài)(圖2a,b)。
圖2：通過軌跡分析推斷上皮細(xì)胞類型組成腺泡導(dǎo)管化生和非典型導(dǎo)管中間產(chǎn)物
結(jié)果三：惡性和成纖維細(xì)胞程序共享的腫瘤
盡管大多數(shù)腫瘤以基底樣/鱗狀/間充質(zhì)和經(jīng)典亞型的惡性細(xì)胞為特征(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4a)，但這些狀態(tài)可能在一些惡性細(xì)胞群中發(fā)生同時(shí)出現(xiàn)或部分缺失的情況。此外，肌成纖維細(xì)胞和炎癥signature在一些不同的CAFs亞群中表達(dá)，但抗原遞呈標(biāo)記未被明確識(shí)別，因此作者在這里利用共識(shí)性非負(fù)矩陣分解(cNMF)方法，在不同腫瘤的惡性細(xì)胞和CAFs中重新學(xué)習(xí)了細(xì)胞類型的復(fù)發(fā)表達(dá)模式。作者重點(diǎn)關(guān)注來自多個(gè)患者的跨細(xì)胞共享的cNMF程序(圖3a、b)，識(shí)別出了14種惡性細(xì)胞程序和4種成纖維細(xì)胞程序。除了先前報(bào)道的亞型，作者還識(shí)別到了三種細(xì)胞亞型，分別為離散的鱗狀、基底樣和間充質(zhì)細(xì)胞；并進(jìn)一步對(duì)高CAN的惡性細(xì)胞亞群進(jìn)行分析，確定了腺泡樣程序和神經(jīng)內(nèi)分泌樣程序。然而在之前的研究中，大量研究通常將內(nèi)分泌樣或外分泌樣特征歸因于腫瘤亞群不純的非惡性細(xì)胞，但作者的數(shù)據(jù)表明這些特征存在于惡性細(xì)胞中。因此，小編認(rèn)為這是本文的一個(gè)亮點(diǎn)，這里揭示了一個(gè)支持異常分化的內(nèi)分泌和外分泌（ADEX）亞型，并通過原位驗(yàn)證揭示了一個(gè)獨(dú)特的NRP程序。
接著作者將單細(xì)胞測(cè)序分析出的基底樣、鱗狀和間充質(zhì)程序與之前通過bulk定義的基底樣、鱗狀和準(zhǔn)間充質(zhì)程序進(jìn)行富集分析；鱗狀細(xì)胞程序和基底樣細(xì)胞程序與Moffitt基底樣信號(hào)顯著重疊，但鱗狀細(xì)胞和間充質(zhì)程序分別與bulk定義的鱗狀細(xì)胞和準(zhǔn)間充質(zhì)亞型沒有顯著重疊（圖3c）。
最后作者對(duì)新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特的NRP程序進(jìn)行功能分析：發(fā)現(xiàn)的NRP程序可以同時(shí)豐富了神經(jīng)發(fā)育/遷移/粘附等通路基因。并且相對(duì)于的研究，作者將NRP和神經(jīng)內(nèi)分泌樣程序二者進(jìn)行了很好的區(qū)分（圖3b、d）。此外，NRP程序還與人類蛋白質(zhì)圖譜中的“腦組織增強(qiáng)”基因顯著富集，最后作者通過多重免疫熒光原位驗(yàn)證了該程序，并顯示一部分惡性細(xì)胞/腺體共同表達(dá)細(xì)胞角蛋白和NRXN3，NRXN1（典型表達(dá)于大腦皮層和尾狀核的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的程序基因）（圖3e、f），揭示了一個(gè)富含與神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)周圍侵襲（PNI）相關(guān)的基因的NRP程序。
圖3：PDAC中惡性細(xì)胞的分子分層揭示了一種NRP程序
結(jié)果四：CAF分類確定了四個(gè)程序
對(duì)四個(gè)CAF程序進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)富含ACTA2的肌纖維母細(xì)胞祖細(xì)胞程序與之前研究結(jié)果中已發(fā)表的myCAF信號(hào)重疊（圖4a、b），同時(shí)進(jìn)行signature以及其他功能分析反映了不同的iCAF子集的異質(zhì)性（圖4b）。
圖4：PDAC中CAF的分子分層
結(jié)果五：治療相關(guān)惡性腫瘤和CAF程序表達(dá)
作者發(fā)現(xiàn)，新輔助治療中惡性和CAF程序在不同患者中具有顯著異質(zhì)性。與未治療組相比，惡性NRP和神經(jīng)內(nèi)分泌樣程序在CRT組明顯更高，經(jīng)典和鱗狀程序較低；同樣，新輔助CRTL相比于未治療組也顯示出更高的NRP程序表達(dá)，而經(jīng)典的鱗狀和基底樣程序的表達(dá)較低（圖5A、B）；之后作者通過培養(yǎng)類器官進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，證實(shí)了與未治療相比，被治療過的患者類器官細(xì)胞系中NRP程序增加（圖5C）。
最后作者將分析結(jié)果與臨床相關(guān)聯(lián)，證明了治療后程序表達(dá)也與臨床反應(yīng)相關(guān)。在這里根據(jù)患者的外科病理治療反應(yīng)等級(jí)對(duì)25個(gè)治療樣本進(jìn)行注釋，對(duì)七個(gè)惡性譜系剩余惡性細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。與未治療的腫瘤相比，NRP方案中殘留的惡性細(xì)胞增加(圖5D)；為了評(píng)估惡性和CAF的預(yù)后相關(guān)性，研究者收集來自TCGA和PanCuRx/ICGC9的未治療的原發(fā)性PDAC患者的bulk RNA數(shù)據(jù)，對(duì)疾病進(jìn)展時(shí)間（TTP）和總生存期（OS）進(jìn)行了多變量Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)NRP和鱗狀細(xì)胞程序與較短的TTP相關(guān)，而經(jīng)典和免疫調(diào)節(jié)程序與較長(zhǎng)的TTP有關(guān)(圖5E)。
圖5：NRP在經(jīng)細(xì)胞毒性治療后殘留的腫瘤患者衍生的類器官部分顯著富集，與不良臨床結(jié)果相關(guān)
結(jié)果六：將細(xì)胞類型程序映射到腫瘤結(jié)構(gòu)（與空轉(zhuǎn)結(jié)合）
作者捕獲和分析感興趣區(qū)域(ROI)的mRNA計(jì)數(shù)(圖6A)，在這里作者使用四色免疫熒光法選擇具有不同腫瘤細(xì)胞、CAFs和免疫細(xì)胞模式的ROI;為ROI內(nèi)的每個(gè)細(xì)胞類型段創(chuàng)建自定義照明區(qū)域(AOIs);從每個(gè)AOI中切割并收集條形碼并量化條碼豐度。用DSP分析了21個(gè)腫瘤，并用snRNA-seq細(xì)胞類型特征對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行反卷積。觀測(cè)得到上皮、CAF和免疫AOIs按細(xì)胞類型聚集。然后作者將每個(gè)惡性和CAF程序的表達(dá)映射到ROI上，結(jié)果顯示NRP和神經(jīng)內(nèi)分泌樣惡性程序更加富集于CRT的ROI中，與snRNA分析一致。
圖6：惡性腫瘤和CAF程序的空間映射揭示了程序特異性與腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性的關(guān)系
為了識(shí)別多細(xì)胞空間關(guān)聯(lián)，研究者將ROI中的每對(duì)特征關(guān)聯(lián)起來，以產(chǎn)生惡性譜系程序、CAF程序、免疫細(xì)胞類型的比例以及惡性、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞ROI面積的空間協(xié)變矩陣。最后作者通過無監(jiān)督聚類確定了三個(gè)具有不同惡性、基質(zhì)和免疫特征的多細(xì)胞亞群。對(duì)單個(gè)多細(xì)胞亞型進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，治療富集亞型1的特點(diǎn)是其內(nèi)部NRP與神經(jīng)內(nèi)分泌樣惡性程序、嗜神經(jīng)性CAF程序和CD8+T細(xì)胞之間的關(guān)聯(lián)，同時(shí)富集間充質(zhì)和腺泡惡性程序和免疫調(diào)節(jié)CAF程序。鱗狀細(xì)胞-基底細(xì)胞樣亞型2的特點(diǎn)是鱗狀細(xì)胞樣和基底細(xì)胞樣惡性程序與多種淋巴和骨髓細(xì)胞類型、較高的上皮細(xì)胞和免疫含量以及較低的CAF含量相關(guān)。經(jīng)典細(xì)胞樣亞型3表現(xiàn)出經(jīng)典惡性程序、更高的CAF和更低的免疫比例。snRNA-seq數(shù)據(jù)中患者級(jí)別特征的聚類概括了其中一些關(guān)聯(lián)。
圖7：惡性腫瘤程序、CAF程序和免疫細(xì)胞組成的空間分析揭示了三種不同的多細(xì)胞群落和治療相關(guān)的受體-配體相互作用
自此這篇文章的主題內(nèi)容就介紹完畢啦，總的來講，這項(xiàng)研究利用了胰腺導(dǎo)管腺癌患者腫瘤組織樣本進(jìn)行單細(xì)胞核以及空間轉(zhuǎn)錄組分析，探究了新輔助治療下相對(duì)于放療和未治療患者改變的分子機(jī)制。一系列結(jié)果表明，新輔助治療的效果與本研究新識(shí)別到的惡性細(xì)胞亞程序和成纖維亞程序顯著相關(guān)。這項(xiàng)工作橋面的結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)以及空間轉(zhuǎn)錄組，對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌新輔助治療患者提出了精準(zhǔn)的分子分型，對(duì)未來臨床設(shè)計(jì)新的新輔助治療方案具有重要參考價(jià)值。
