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線粒體是細(xì)胞中的“動(dòng)力工廠”，為細(xì)胞提供主要的能量來源，其中我們細(xì)胞生命活動(dòng)80％能量都是由線粒體提供的。線粒體形態(tài)對(duì)于細(xì)胞維持正常生理代謝和機(jī)體發(fā)育起著重要的作用，如果線粒體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了異常，就會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
近年來，線粒體研究已經(jīng)成為生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其中，線粒體的融合與分裂維持著線粒體正常的形態(tài)、分布和功能。線粒體融合與分裂的失衡通常與人類各種疾病，包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
線粒體內(nèi)有一套獨(dú)立于細(xì)胞核的遺傳物質(zhì)——線粒體DNA（mtDNA），人類線粒體DNA的長度為16569bp，擁有37個(gè)基因，編碼13種蛋白，這些蛋白都參與細(xì)胞的能量代謝。
在人類衰老和一系列疾病中，都涉及線粒體DNA（mtDNA）的表達(dá)改變，而線粒體DNA（mtDNA）的突變更是會(huì)直接導(dǎo)致數(shù)十種嚴(yán)重的遺傳疾病。
線粒體是母系遺傳的，是起源于共生細(xì)菌的細(xì)胞器。它們與宿主共同進(jìn)化，因此大多數(shù)線粒體蛋白質(zhì)是核編碼的。然而，線粒體保留一個(gè)小的16kb DNA基因組，編碼tRNAs、rRNA和呼吸必需的蛋白質(zhì)。細(xì)胞有數(shù)百個(gè)線粒體，可以是野生型的，也可以是野生型和突變型的混合物，這種狀態(tài)被稱為異質(zhì)性。線粒體是重要的生物能量和生物合成工廠，對(duì)正常細(xì)胞功能和人類健康至關(guān)重要。人類的線粒體疾病可能是毀滅性的，影響許多組織，包括神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和肌肉。線粒體疾病可由病原突變線粒體基因組的母系遺傳引起，這些線粒體基因組表現(xiàn)為高度異質(zhì)性的疾病，或由必需線粒體基因的功能喪失突變的核遺傳引起。
奧托·瓦爾堡的觀察發(fā)現(xiàn)，癌癥具有在氧氣存在下吸收和發(fā)酵葡萄糖形成乳酸的特殊特性，這使他提出線粒體呼吸缺陷是有氧糖酵解和癌癥的潛在基礎(chǔ)。然而事實(shí)上，瓦爾堡效應(yīng)只能作為FDG-PET腫瘤顯像的基礎(chǔ)，臨床廣泛使用，并不是所有的腫瘤都具有這種有氧糖酵解的特性。線粒體呼吸缺陷通常不是有氧糖酵解的原因，也不是腫瘤進(jìn)化過程中通常選擇的原因。在大多數(shù)癌癥中，促進(jìn)糖酵解的是致癌驅(qū)動(dòng)因子突變，如K-ras、c-Myc和磷脂酰肌醇-3 (PI3)激酶的激活或磷酸酶和緊張蛋白同源物和p53的缺失，而不是失活線粒體呼吸復(fù)合體的突變。
同時(shí)，大多數(shù)癌癥仍然保留線粒體功能，包括呼吸。一些腫瘤具有高水平的氧化磷酸化，而其他相對(duì)糖酵解的腫瘤仍然保留線粒體呼吸和其他功能。在培養(yǎng)的細(xì)胞中通過通量分析定量，發(fā)現(xiàn)AKT轉(zhuǎn)化不顯著影響呼吸作用，而Ras轉(zhuǎn)化減少呼吸作用，但大部分ATP仍然通過氧化磷酸化產(chǎn)生。對(duì)癌癥中線粒體活性需求的功能測試已經(jīng)揭示了它們的重要性。線粒體轉(zhuǎn)錄因子Tfam的失活會(huì)耗盡腫瘤細(xì)胞中的線粒體，從而在原地模型中損害K-ras肺腫瘤的生長。通過毒害mtDNA復(fù)制產(chǎn)生r0細(xì)胞來耗盡腫瘤細(xì)胞的mtDNA，從而破壞腫瘤的發(fā)生。此外，mtDNA耗盡r0腫瘤生長恢復(fù)的選擇與宿主組織線粒體基因組的水平轉(zhuǎn)移和呼吸恢復(fù)有關(guān)。這些和其他發(fā)現(xiàn)表明，線粒體在癌癥中的作用不像瓦爾堡想象的那么簡單。相反，他們指出了線粒體功能對(duì)腫瘤生長的重要性。
線粒體是生物能量和生物合成的細(xì)胞器，從細(xì)胞質(zhì)中吸收底物，并利用它們驅(qū)動(dòng)脂肪酸氧化(FAO)、TCA循環(huán)、電子傳遞鏈(ETC)和呼吸，并合成氨基酸、脂類、核苷酸、血紅素、鐵硫團(tuán)以及NADPH來進(jìn)行自身的抗氧化防御。通過TCA循環(huán)產(chǎn)生的NADH和FADH2為ETC提供動(dòng)力，從而在線粒體內(nèi)膜上產(chǎn)生一個(gè)質(zhì)子梯度，通過H+ -ATP合酶的作用產(chǎn)生ATP。二氫月牙酸脫氫酶(DHODH)是嘧啶從頭合成所必需的，需要一個(gè)功能性呼吸鏈才能發(fā)揮活性。線粒體中產(chǎn)生的活性氧(ROS)是ETC的副產(chǎn)物，可以激活MAP激酶和hif等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(常氧被稱為假性缺氧)。過量的ROS產(chǎn)生也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。線粒體可以隔離Ca2+，并選擇性釋放Ca2+控制信號(hào)和廣泛的細(xì)胞功能。
線粒體作為先天免疫的信號(hào)平臺(tái)(例如，MAVS和mtDNA的釋放)。位于線粒體外膜的BCL-2蛋白家族可以通過凋亡控制細(xì)胞程序性死亡。BCL-2相關(guān)的抗凋亡蛋白阻斷，而BAX和BAK促凋亡蛋白促進(jìn)細(xì)胞色素c從線粒體膜間隙釋放。這種細(xì)胞色素c釋放觸發(fā)細(xì)胞溶膠中的凋亡小體和半胱天冬酶蛋白酶的激活，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，線粒體和細(xì)胞之間的通信協(xié)調(diào)了一系列對(duì)細(xì)胞代謝、生長和生存至關(guān)重要的功能。
除了作為生物能量的發(fā)電站和信號(hào)中樞，線粒體還作為生成生物合成基石的平臺(tái)。這需要4C(四碳)單元的持續(xù)流入來平衡這些單元向氨基酸和其他生物合成產(chǎn)品的流出。TCA循環(huán)4C單元的補(bǔ)充被稱為回復(fù)性，可以通過丙酮酸的羧化或谷氨酰胺和其他氨基酸的分解代謝發(fā)生。
除了提供4C單元外，還需要2C(二碳)單元，后者由可以由脂肪酸、丙酮酸、乙酸和許多氨基酸形成的乙酰輔酶a提供。圖中 4C和2C的縮合反應(yīng)。線粒體作為生物合成和信號(hào)樞紐TCA循環(huán)利用糖酵解、脂肪酸氧化和氨基酸分解代謝產(chǎn)生的底物來生成基石和高能電子(NADH和FADH2)，為ETC提供動(dòng)力。闡明了線粒體產(chǎn)生的主要生物合成產(chǎn)物和線粒體功能調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。該單位通過檸檬酸合酶產(chǎn)生檸檬酸，這是唯一的線粒體定位。除了作為上游前體能夠生成所有經(jīng)典的TCA循環(huán)中間體外，檸檬酸鹽還可以輸出到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中被分解為草酰乙酸和乙酰輔酶a，這是脂質(zhì)合成和蛋白質(zhì)修飾所必需的。除了4C和2C單元，線粒體還在嘌呤、胸腺嘧啶和蛋氨酸合成所需的1C(一個(gè)碳單元)代謝中發(fā)揮核心作用。
已知約100個(gè)基因的獲得性核、體細(xì)胞和生殖系突變可在癌癥治療中提供選擇性優(yōu)勢。由于DNA修復(fù)缺陷、復(fù)制錯(cuò)誤、致癌物質(zhì)暴露或衰老導(dǎo)致的突變頻率增加，通過增加這些基因突變的發(fā)生促進(jìn)癌癥。這些癌癥驅(qū)動(dòng)突變及其對(duì)癌癥生長的功能后果通常被很好地理解，并且是靶向抗癌藥物開發(fā)的主題。
相比之下，線粒體基因組突變在癌癥中的地位和作用就不那么清楚了。利用過去測序技術(shù)的低靈敏度來評(píng)估異質(zhì)基因組的小樣本量研究使得體細(xì)胞獲得的線粒體基因組突變與癌癥的關(guān)聯(lián)不明確。此外，現(xiàn)在司空見慣的高級(jí)核測序研究通常忽略了線粒體基因組。最近的兩項(xiàng)大規(guī)模研究通過大規(guī)模平行DNA測序，對(duì)來自同一患者的30多種腫瘤類型的2000多種人類癌癥的線粒體基因組突變情況進(jìn)行了比較，揭示了重要的觀點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)了許多具有強(qiáng)復(fù)制鏈偏倚的體細(xì)胞替換，在線粒體重鏈上出現(xiàn)“C轉(zhuǎn)T”和“A轉(zhuǎn)G”，表明線粒體聚合酶G錯(cuò)誤是突變的主要原因。更重要的是，錯(cuò)義突變是中性的并傾向于同質(zhì)，而有害的、致病的突變?nèi)匀皇钱愘|(zhì)的，存在著消極選擇。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，在人類癌癥中普遍存在保留線粒體基因組功能的選擇壓力。
為了讓細(xì)胞正常運(yùn)作，需要在線粒體和細(xì)胞核之間來回通信，這被稱為順行和逆行信號(hào)。核基因控制線粒體的生物過程，合成更多的線粒體，滿足增加的代謝需求。相反的生物過程是由自噬和線粒體自噬基因控制的另一層核。
人類癌癥中缺乏致病性線粒體基因組突變的積累，表明線粒體質(zhì)量控制的積極機(jī)制的參與，以防止缺陷線粒體的積累。線粒體自噬是一種特殊形式的自噬，它選擇性地降解和消除多余或受損的線粒體。生物過程和線粒體自噬共同調(diào)節(jié)線粒體的質(zhì)量、功能和質(zhì)量。反過來，有缺陷的線粒體通過膜去極化和線粒體蛋白的級(jí)聯(lián)磷酸化和泛素化直接向線粒體吞噬機(jī)制提供“吃我”信號(hào)，而減少的細(xì)胞能量輸出(當(dāng)線粒體總數(shù)不足時(shí)發(fā)生)，通過一般能量傳感器AMP激酶和其他機(jī)制觸發(fā)線粒體生物過程。
線粒體外膜去極化觸發(fā)激酶PINK1的激活，使泛素磷酸化，導(dǎo)致E3連接酶PARKIN募集到線粒體外膜。PARKIN進(jìn)一步將線粒體蛋白泛素化，從而招募自噬機(jī)制來捕獲、吞噬并降解溶酶體中的這些特定線粒體。其他一些與PARKIN無關(guān)的線粒體自噬受體蛋白包括BNIP3、NIX、FUNDC1和BCL2L13。盡管推測線粒體自噬在癌癥中的作用是合理的，但缺乏線粒體自噬參與腫瘤發(fā)生的直接證據(jù)。線粒體質(zhì)量控制在癌癥中的作用主要是通過操縱真正的自噬基因的遺傳模型獲得的信息。
RAS驅(qū)動(dòng)的癌癥通過激活促進(jìn)自噬和溶酶體生物發(fā)生的基本螺旋環(huán)螺旋亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子MiTF/TFE家族來上調(diào)基礎(chǔ)自噬。在癌癥小鼠模型中，敲除自噬必需基因產(chǎn)生自噬缺陷，導(dǎo)致缺陷線粒體和其他自噬底物的積累，損害線粒體呼吸、細(xì)胞生長和生存，同時(shí)增加細(xì)胞死亡和衰老。對(duì)已確診為RAS驅(qū)動(dòng)型肺癌的小鼠進(jìn)行系統(tǒng)性的急性自噬消融，在對(duì)大多數(shù)正常組織產(chǎn)生顯著損傷之前，會(huì)產(chǎn)生大量的腫瘤消退，這表明一些腫瘤特別依賴自噬。重要的是，與自噬完整產(chǎn)生的癌相比，自噬缺失腫瘤類似于良性的嗜酸細(xì)胞瘤，這是一種以缺陷線粒體積累為特征的腫瘤。因此，自噬是腫瘤從良性向惡性發(fā)展的必要條件。這也符合RAS驅(qū)動(dòng)的胰腺良性病變惡性進(jìn)展對(duì)自噬的要求。因此，自噬是誘導(dǎo)和需要克服障礙，惡性生長在多種癌癥類型。
由于自噬的主要作用是控制線粒體質(zhì)量，并可能為線粒體代謝提供底物，因此自噬可能通過這些機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和惡性腫瘤的發(fā)生。這一點(diǎn)缺乏直接的證明，因?yàn)樽允山閷?dǎo)的循環(huán)提供的特定底物的身份，以及它們支持的代謝途徑尚不清楚。腫瘤細(xì)胞自噬缺乏導(dǎo)致谷氨酰胺依賴，提示谷氨酰胺可能是自噬供給的底物。在神經(jīng)元中，線粒體自噬對(duì)于去除線粒體基因組損傷中受損的線粒體蛋白非常重要。
幾十年前，奧托·瓦爾堡(Otto Warburg)觀察到癌癥在氧氣存在的情況下發(fā)酵葡萄糖，這表明線粒體呼吸的缺陷可能是癌癥的潛在原因。我們現(xiàn)在知道，驅(qū)動(dòng)異常癌細(xì)胞增殖的遺傳事件也會(huì)改變生化代謝，包括促進(jìn)有氧糖酵解，但通常不會(huì)損害線粒體功能。線粒體提供能量;為新細(xì)胞提供構(gòu)建模塊;并控制氧化還原穩(wěn)態(tài)、致癌信號(hào)、先天免疫和凋亡。事實(shí)上，線粒體的生物過程和質(zhì)量控制在癌癥中經(jīng)常被上調(diào)。雖然一些癌癥具有產(chǎn)生致癌代謝物的核編碼線粒體三羧酸(TCA)循環(huán)酶的突變，但對(duì)致病的線粒體基因組突變存在負(fù)選擇。
消除mtDNA可以限制腫瘤的發(fā)生，罕見的線粒體基因組突變的人類腫瘤是相對(duì)良性的。因此，線粒體在惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮著重要的多功能作用，靶向線粒體提供了治療的機(jī)會(huì)。
那么接下來我們將介紹一下在線粒體對(duì)于癌癥的治療中的一些研究：
使用健康線粒體替代細(xì)胞內(nèi)功能障礙線粒體，以用于疾病治療的方法，被稱為線粒體治療。由于諸多疾病與線粒體障礙相關(guān)，因此線粒體治療可能對(duì)線粒體相關(guān)疾病具有普適性。在2016年，由第三方女性提供正常線粒體的三親嬰兒出生，明確了外源線粒體移植到細(xì)胞后可行使正常功能。這種將線粒體微注射到極體或卵母細(xì)胞的方法，可用于治療先天性的線粒體疾病。但隨著年齡增長出現(xiàn)的線粒體疾病，則需要其他的線粒體移植途徑。早年研究發(fā)現(xiàn)，加入到培養(yǎng)基中的線粒體可修復(fù)線粒體受損的細(xì)胞。我們的實(shí)驗(yàn)也多次證明了這個(gè)結(jié)果，并將該發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于向動(dòng)物體內(nèi)直接進(jìn)行線粒體注射，以恢復(fù)受損組織的正常功能。將分離的線粒體與受體細(xì)胞共同孵育，這種技術(shù)可以很容易地應(yīng)用于許多不同類型的細(xì)胞。該方法提供了研究向受體細(xì)胞內(nèi)人工轉(zhuǎn)移的外源線粒體的行為和作用的機(jī)會(huì)。目前該研究領(lǐng)域逐漸從小眾走向大眾，并在多種疾病的治療中快速展開，成為治療線粒體疾病的一個(gè)嶄新的方法。
線粒體是微米級(jí)的細(xì)胞器。其進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制可參考微納米脂質(zhì)體或膠束等進(jìn)入細(xì)胞的途徑。但需要指出的是，微納米脂質(zhì)體或膠束等在進(jìn)入細(xì)胞后，逐漸破裂釋放出所包載的藥物；或者與溶酶體融合，經(jīng)溶酶體酸性環(huán)境作用或經(jīng)酶解，破壞外層膜，造成藥物快速釋放。然而，線粒體在進(jìn)入細(xì)胞后，絕大部分則以完整形態(tài)發(fā)揮作用，這與微納米載藥系統(tǒng)不同，其機(jī)制目前尚不清楚。
線粒體加入到培養(yǎng)基后，可在短短10 min內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞。目前常采用小分子抑制劑來研究熒光標(biāo)記的線粒體進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制，例如，秋水仙堿、細(xì)胞松弛素、阿米洛利、氯丙嗪等細(xì)胞內(nèi)吞或巨胞飲抑制劑。線粒體的熒光標(biāo)記方法常采用依賴于膜電位的熒光探針`和核編碼的靶向線粒體的熒光蛋白等。Kesner等和Patel等的研究表明線粒體進(jìn)入細(xì)胞的方式主要由巨胞飲作用介導(dǎo)。但Sun等和Pacak等則報(bào)道線粒體是由肌動(dòng)蛋白依賴性內(nèi)吞作用，而非巨胞飲作用介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞。該研究分別使用細(xì)胞松弛素D用于抑制肌動(dòng)蛋白聚合、使用甲基-β-環(huán)糊精阻止內(nèi)吞作用，并使用諾卡多唑來阻斷隧道納米管，結(jié)果顯示這些抑制劑極大地抑制了細(xì)胞對(duì)線粒體的攝取，從而推斷線粒體進(jìn)入細(xì)胞的途徑主要是肌動(dòng)蛋白依賴的內(nèi)吞方式。當(dāng)線粒體經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后，形成的包含線粒體的微囊可能在細(xì)胞中破裂，釋放出完整的線粒體發(fā)揮作用。
惡性腫瘤和正常細(xì)胞的一個(gè)主要差別在于腫瘤細(xì)胞的代謝重編程。而腫瘤線粒體是代謝重編程的關(guān)鍵細(xì)胞器。惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的線粒體往往發(fā)生數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能的改變，以適應(yīng)腫瘤在酸性和缺氧環(huán)境中快速增長的需要。例如，腫瘤線粒體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力被遏制、氧化磷酸化減弱而無氧糖酵解增強(qiáng)(Warburg效應(yīng))、采用截?cái)嗷蚍聪虻娜人嵫h(huán)(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 生成腫瘤代謝中間產(chǎn)物等。因此，正常線粒體若進(jìn)入惡性腫瘤細(xì)胞中，可能會(huì)產(chǎn)生兩種不同的結(jié)果：(1) 糾正細(xì)胞代謝、扭轉(zhuǎn)惡性化方向、促使腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化。(2) 正常線粒體難以忍受腫瘤細(xì)胞惡劣的內(nèi)環(huán)境，激活細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持第2種結(jié)果。
目前線粒體已成功應(yīng)用于乳腺癌、腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤等的治療和研究?？傮w結(jié)果顯示，線粒體可抑制腫瘤細(xì)胞的生長增殖。Elliott等從人乳腺上皮細(xì)胞MCF-12A分離出正常功能的線粒體并進(jìn)行熒光染色，線粒體與乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231共孵育后，通過抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解途徑，使細(xì)胞增殖速度降低、乳酸生成減少，并提高了腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。此外，非癌細(xì)胞的線粒體進(jìn)入到侵襲性的骨肉瘤細(xì)胞后，前者可逆轉(zhuǎn)惡性癌細(xì)胞的致癌特性，例如降低在缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞增殖活力和侵襲能力、提高凋亡能力、降低對(duì)抗癌藥的耐受性和在軟瓊脂中的集落形成能力。在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，從正常小鼠肝臟中分離的線粒體可顯著抑制黑色素瘤的生長、明顯延長荷瘤小鼠的生存期。其抗腫瘤機(jī)制與ATP耗竭、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死有關(guān)。另外，由于線粒體和細(xì)胞核存在密切的相互交流(Cross-talk) 現(xiàn)象，其中線粒體可反向調(diào)控細(xì)胞核的基因轉(zhuǎn)錄，因此線粒體治療的抗腫瘤機(jī)制可能與線粒體-核的互作有關(guān)。微陣列分析表明線粒體可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1、ras、src和p53等幾種致癌途徑，參與其抗腫瘤作用。
此外，線粒體是對(duì)環(huán)境氧和酸堿度極為敏感的細(xì)胞器，在不同的環(huán)境中發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞存活或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的兩極功能。由于正常生理狀態(tài)的體細(xì)胞以線粒體呼吸作為主要能源，因此補(bǔ)充線粒體可提高其能量供應(yīng)以改善細(xì)胞功能。但在缺氧和酸性環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞，補(bǔ)充外源線粒體則會(huì)導(dǎo)致ROS升高、誘導(dǎo)細(xì)胞死亡通路。線粒體這種環(huán)境響應(yīng)性的特性將可能使其具有選擇性抗腫瘤作用。
肺癌是一種流行且致命的癌癥類型，轉(zhuǎn)移性癌癥擴(kuò)散是導(dǎo)致大多數(shù)癌癥相關(guān)死亡的原因，為了揭示維持轉(zhuǎn)移生存或生長所特別需要的基因，研究人員在肺腺癌非轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移狀態(tài)的細(xì)胞中進(jìn)行了基因組規(guī)模的緩病毒shrna庫篩選。線粒體核糖體和線粒體相關(guān)基因被確定為與轉(zhuǎn)移特異性致死相關(guān)的基因集。從自體肺癌小鼠模型進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)移源細(xì)胞系和離體轉(zhuǎn)移分析顯示，與非轉(zhuǎn)移原發(fā)腫瘤相比，線粒體膜電位較低，線粒體功能也較低。轉(zhuǎn)移灶的電子顯微鏡顯示不規(guī)則的線粒體失去正常的膜結(jié)構(gòu)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，抑制線粒體轉(zhuǎn)錄或復(fù)制的化合物對(duì)轉(zhuǎn)移源性細(xì)胞的生長有更大的影響。這些結(jié)果表明，肺腺癌的轉(zhuǎn)移細(xì)胞狀態(tài)與一種特殊改變的線粒體功能有關(guān)，并且可以用于治療。
圖A，選擇驗(yàn)證基因的標(biāo)準(zhǔn)。我們采用了三種方法來發(fā)現(xiàn)對(duì)Met細(xì)胞系具有不同影響的基因，并根據(jù)描述的標(biāo)準(zhǔn)選擇了240個(gè)候選基因。
圖B-C, 20倍體外前(早期)和后(晚期)的代表。在兩個(gè)TnonMet (368T1;B)和Met (238N1;C)細(xì)胞中，致死基因表達(dá)減少，惰性基因不變，有利基因增加。候選基因在Met細(xì)胞中的代表性顯著降低。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)shRNA。
圖D，每個(gè)shRNA對(duì)Met和TnonMet細(xì)胞的差異影響。每個(gè)細(xì)胞系在早期時(shí)間點(diǎn)和晚期時(shí)間點(diǎn)之間表現(xiàn)變化的差異顯示為Met特異性效應(yīng)。
圖E，根據(jù)未歸一化的P值繪制對(duì)Met細(xì)胞的差異效應(yīng)，揭示了具有最大折疊效應(yīng)和高重復(fù)性的頂級(jí)候選基因。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)shRNA。這些方框表示在Met細(xì)胞中至少增加2倍(藍(lán)色方框)或4倍(紅色方框)的候選shrna，這意味著它們對(duì)Met的殺傷力至少是TnonMet細(xì)胞的2倍或4倍。
圖F，評(píng)估候選基因?qū)w內(nèi)癌細(xì)胞生長的影響的平行體內(nèi)篩選概述。
圖G，體外和體內(nèi)對(duì)Met細(xì)胞的作用基本一致(482N1)。
圖A，二次體外篩選shRNA表達(dá)變化的Heatmap，按其對(duì)Met細(xì)胞的影響程度排序(紅色)。熱圖旁邊列出了體外轉(zhuǎn)移特異性作用最高的20個(gè)shrna?；蛎Q后面的數(shù)字表示針對(duì)該基因的兩個(gè)shrna中的哪一個(gè)被識(shí)別，
圖B，根據(jù)shRNA對(duì)Met細(xì)胞的影響程度排序的二次體內(nèi)篩選中shRNA表達(dá)變化的Heatmap(紅色)。對(duì)應(yīng)的基因/shRNA名稱和數(shù)據(jù)值的數(shù)據(jù)表見Supplementary data Table S9。熱圖旁邊列出了在體內(nèi)具有最高轉(zhuǎn)移特異性效應(yīng)的前20個(gè)shrna?；蛎Q后面的數(shù)字表示針對(duì)該基因的兩個(gè)shrna中的哪一個(gè)被識(shí)別，因?yàn)樵诘诙€(gè)篩選中每個(gè)基因使用兩個(gè)shrna。
圖C，在體外培養(yǎng)過程中，在Met細(xì)胞系樣品中特異性失去表達(dá)的基因的GSEA。上面展示了一個(gè)最特異的met致死途徑的例子。豎條是按必需性排序的基因集/通路中所代表的基因，富集分?jǐn)?shù)在上面的圖表中(綠色的)。中間列出了GSEA分析確定的引起met特異性致死shRNA治療反應(yīng)的途徑;唯一顯著的基因集，表示線粒體核糖體，用粉紅色突出顯示。底部列出了基因本體(GO)項(xiàng)分析的結(jié)果。它確定線粒體和線粒體核糖體作為頂級(jí)細(xì)胞復(fù)合體，以轉(zhuǎn)移特異性致死為目標(biāo)。
圖A-D, 50 ng/mL溴化乙錠(A)、15 mg/mL強(qiáng)力霉素(B)、200 mmol/L phenformin (C)、2 mmol/L FCCP (D)處理Met (482N1)和TnonMet (394T4)細(xì)胞系的體外競爭試驗(yàn)表明，二者對(duì)Met細(xì)胞的處理效果更高。數(shù)據(jù)歸一化為未經(jīng)處理的對(duì)照;給出了在三個(gè)重復(fù)中至少進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一個(gè)代表性實(shí)驗(yàn)。
圖E-H，海馬分析Met和TnonMet細(xì)胞系(各3個(gè))來測量耗氧率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)說明，用E中所示化合物處理細(xì)胞。Met細(xì)胞系的備用呼吸能力較低，并且耦合效率較低)。 ECAR/OCR比分析表明，糖酵解在Met細(xì)胞中使用更高(H)。
圖I-L, Seahorse MitoFuelFlexTest分析Met和TnonMet細(xì)胞系(各3個(gè))，以測量燃料容量和依賴性。Met細(xì)胞對(duì)糖酵解衍生的丙酮酸，它們使用谷氨酰胺的能力較低，表明氧化磷酸化過程中谷氨酰胺作為燃料的比率降低。
圖M，在含半乳糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Met和TnonMet細(xì)胞系(各3個(gè))中，用倒置的CellTiter-Glo分析ATP水平。
圖N，在含半乳糖培養(yǎng)基和含葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Met和TnonMet細(xì)胞系(各3個(gè);P 0.1377)。數(shù)據(jù)以半乳糖/葡萄糖比值計(jì)算。
圖O，細(xì)胞在含葡萄糖和半乳糖培養(yǎng)基中的相對(duì)生長分析。數(shù)據(jù)以δ(葡萄糖半乳糖)計(jì)算。
圖P，JC1染色Met(n2)、TnonMet(n2)細(xì)胞系，流式細(xì)胞術(shù)測定相對(duì)去極化。
圖Q，流式細(xì)胞術(shù)對(duì)TnonMet(H)和Met(I)細(xì)胞系進(jìn)行ROS染色，測量相對(duì)ROS產(chǎn)生。
2020年3月發(fā)表在Nature genetics（IF：27.603)上的一篇文章Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers，作者使用pan-cancer研究的WGS和RNA-seq數(shù)據(jù)，對(duì)癌癥線粒體基因組進(jìn)行了全面的分子表征。
線粒體作為“細(xì)胞的動(dòng)力源”，在通過氧化磷酸化產(chǎn)生大部分細(xì)胞能量的生物過程中起著至關(guān)重要的作用。環(huán)狀的線粒體基因僅有16.6 kb，但仍編碼13種蛋白質(zhì)，與其他核來源的蛋白質(zhì)形成呼吸鏈復(fù)合體。由于能量代謝的改變是癌癥的共同特征，線粒體可能參與癌變過程。此外線粒體也在與腫瘤發(fā)生有內(nèi)在聯(lián)系的其他生物過程中起重要作用，例如生物合成、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、維持對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞生長的控制等。
目前關(guān)于線粒體基因組的研究多為基于小樣本隊(duì)列的單一維度研究，并且大多使用全外顯子測序數(shù)據(jù)，因此尚未獲得跨癌癥類型的線粒體全面、多維分子景觀。此外，過往研究僅集中于線粒體改變的模式，而沒有充分探索線粒體基因組和核基因組之間的相互作用以及線粒體改變的生物醫(yī)學(xué)意義。本文使用PCAWG生成的38種癌癥的全基因組測序數(shù)據(jù)，對(duì)癌癥線粒體基因組進(jìn)行了全面的表征。
圖1a,b：多維度整合分析方法概述和mtDNA置換突變的概況
圖1c-f：mtDNA的突變特征：置換類型、年齡和核驅(qū)動(dòng)改變背景
圖2a,b：mtDNA突變數(shù)量分布和超突變樣本的突變譜
其中最顯著的是乳腺癌樣本SP6730，有33個(gè)突變，其中30個(gè)位于一個(gè)2kb的區(qū)域，導(dǎo)致局部突變率比背景突變率高75倍。獨(dú)立的外顯子組和RNA-seq分析證實(shí)，這些突變有70%是新發(fā)現(xiàn)的，并非胚系突變和測序錯(cuò)誤造成的突變。其中絕大部分的局部突變（n = 28）為L鏈的T>C置換，并且互相co-clonal，有高度相似的VAFs（~7%）。
這些特征支持28個(gè)局部突變(19個(gè)錯(cuò)義，4個(gè)沉默和5個(gè)tRNA突變）是通過一次“single-hit”的災(zāi)難性突變機(jī)制獲得的，類似造成鏈特異性T>C置換主導(dǎo)的突變譜的機(jī)制。這與核基因組的kataegis現(xiàn)象（在癌癥基因組中發(fā)現(xiàn)的局部超突變模式）以及一種已報(bào)道的mtDNA復(fù)雜體細(xì)胞突變相似，圖2d介紹了可能的機(jī)制：mtDNA在一次“single-hit”中獲得了這些突變，并且突變拷貝通過細(xì)胞系的一系列復(fù)制，具有了較明顯的VAF（~7%），但導(dǎo)致缺陷表型的概率很低。
圖2c,d：乳腺癌超突變樣本的突變分布及可能的機(jī)制
為了研究mtDNA突變對(duì)其功能的影響，解釋mtDNA的特異性突變特征，作者以一種對(duì)錯(cuò)義突變選擇壓力的常見測量：dN/dS比率（同義/非同義置換比率），進(jìn)行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同類型癌癥、不同VAFs上錯(cuò)義突變的dN/dS總體上接近1，表明對(duì)mtDNA錯(cuò)義突變的總體選擇接近中性。
作者進(jìn)一步分析了不同的突變類型的VAF分布，發(fā)現(xiàn)并非所有突變都是乘客突變。13個(gè)mtDNA基因的截短突變（導(dǎo)致蛋白質(zhì)產(chǎn)物截短的突變(即無義突變和移碼indels)）在大多數(shù)癌癥類型中表現(xiàn)為陰性選擇，VAFs明顯比錯(cuò)義突變或沉默突變的VAFs受到更大程度的抑制，表明完整的線粒體功能在癌細(xì)胞中的重要性。
圖a，腎/結(jié)直腸癌/甲狀腺癌與其他癌癥類型截?cái)嗤蛔兊腣AF積累曲線明顯。為了進(jìn)行比較，在其他類型的癌癥中，對(duì)突變數(shù)進(jìn)行歸一化后，沉默突變和錯(cuò)義突變產(chǎn)生了類似的曲線。。一般來說，在較高的等位基因頻率水平(紅色)觀察到較少的截?cái)嗤蛔儯四I癌、結(jié)直腸癌和甲狀腺癌類型(藍(lán)色)。
圖b，腎嫌色癥、腎乳頭狀癌、結(jié)直腸癌和甲狀腺癌積累了過多的高等位基因頻率截?cái)嗤蛔?括號(hào)中的樣本大小)。VAF間隔為0.6-1.0時(shí)不同癌癥類型的曲線下面積。
圖c, ND5中截?cái)嗤蛔兊姆植寄Ｊ健?/p>
圖d，腎嫌色細(xì)胞癌和腎乳頭狀癌腫瘤基因mtDNA截?cái)嗤蛔兣c反復(fù)體細(xì)胞突變的熱圖。MT_truncating是線粒體截?cái)嗤蛔兊臉?biāo)準(zhǔn)，包括移碼突變和停止增益突變。
圖e，在截?cái)嗤蛔兊陌┌Y樣本中，核基因富集的信號(hào)通路的熱圖。
圖a-b：不同癌癥類型中SMNTs的發(fā)生頻率以t檢驗(yàn)比較有無SMNTs的樣本中SMNTs與核基因組結(jié)構(gòu)變異的關(guān)系，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，有SMNTs的樣本在核基因組中具有更多的總體和局部結(jié)構(gòu)變異（P = 1×10?4，圖4b）。圖b中有無SMNTs樣本中核基因組結(jié)構(gòu)變異的發(fā)生頻率。
圖4c：不同類型結(jié)構(gòu)變異中SMNT斷點(diǎn)到最近的結(jié)構(gòu)變異斷點(diǎn)的距離
盡管總體上SMNT發(fā)生頻率較低（約2%），但一些癌癥樣本顯示了超過3個(gè)獨(dú)立的SMNT事件（圖4d），并且一些mtDNA片段會(huì)大量重排，這表明SMNT事件發(fā)生時(shí)基因組極不穩(wěn)定。
圖4d展示了一例膀胱癌樣本基因組中三個(gè)獨(dú)立SMNT事件的Circos圖，灰色曲線表示染色體重排，紅色曲線表示SMNT。
圖4e：一例HER2+乳腺癌樣本中的SMNT事件。
圖5a：不同癌癥類型的mtDNA拷貝數(shù)
進(jìn)一步使用方差分析或t檢驗(yàn)比較來自同一組織器官的不同癌癥亞型的mtDNA拷貝數(shù)，結(jié)果顯示有些癌癥類型表現(xiàn)出不同的mtDNA拷貝數(shù)分布（圖5b）
圖5b,c：不同癌癥類型和截短組樣本的mtDNA拷貝數(shù)分析
在有配對(duì)正常組織的癌癥樣本中比較mtDNA拷貝數(shù)的變化(n = 507)，結(jié)果顯示在慢性淋巴細(xì)胞白血病、肺鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌,中癌癥樣本的mtDNA拷貝數(shù)增加，但腎透明細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌和骨髓增殖性腫瘤中減少（圖5d）。這種不同的模式可能是由于癌癥特有的致癌刺激、代謝活動(dòng)和線粒體功能失常所致，比如最近一項(xiàng)研究顯示腎透明細(xì)胞癌中mtDNA拷貝數(shù)的顯著降低與HIF1α高度激活導(dǎo)致過氧化物酶體增殖激活受體γ共活化劑1α（線粒體生物生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子）下調(diào)有關(guān)，而HIF1α是腎透明細(xì)胞癌中最常見和活躍的突變。
為了評(píng)估m(xù)tDNA拷貝數(shù)的潛在生物醫(yī)學(xué)意義，作者研究了與一些關(guān)鍵臨床變量的相關(guān)性：
結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在前列腺癌（圖5e）、結(jié)腸直腸癌和皮膚癌中mtDNA拷貝數(shù)和診斷時(shí)的年齡之間存在顯著正相關(guān)。而大多數(shù)病例中正常血液的mtDNA拷貝數(shù)與年齡呈負(fù)相關(guān)。
觀察了在多種癌癥類型中mtDNA拷貝數(shù)與腫瘤分期之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示慢性淋巴細(xì)胞白血病中mtDNA拷貝數(shù)的增加與癌癥的高分期有關(guān)（圖5f）。
由于前列腺癌和衰老組織中已知存在線粒體基因組的focal copy的獲得和丟失，作者最后還使用WGS數(shù)據(jù)分析了樣本中mtDNA基因組的結(jié)構(gòu)變異。通過以正常mtDNA序列為參考，計(jì)算歸一化的測序深度，進(jìn)而尋找癌癥mtDNA序列的讀取深度變化來鑒定結(jié)構(gòu)變異區(qū)域。結(jié)果在2658例癌癥樣本中，3例樣本(0.11%)的mtDNA出現(xiàn)了顯著的結(jié)構(gòu)變異（圖5g）。
為了研究13個(gè)mtDNA基因在癌癥中的功能影響，作者使用TCGA的來自13種癌癥類型的4,689例腫瘤樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)基因表達(dá)水平進(jìn)行定量。
結(jié)果顯示基因表達(dá)水平與mtDNA拷貝數(shù)之間的相關(guān)性在不同癌癥中不同。
如圖6a所示，mtDNA基因在三種腎癌（嫌色細(xì)胞癌、乳頭狀細(xì)胞癌和透明細(xì)胞癌）中高表達(dá)，而在三種鱗狀細(xì)胞癌（宮頸、肺和頭頸部癌）中低表達(dá)，這是mtDNA拷貝數(shù)在不同癌癥類型中的相對(duì)豐度不同所導(dǎo)致的，并且與正常組織中的研究一致。
作者進(jìn)一步構(gòu)建了包括線粒體基因和核基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，研究mtDNA基因及其相關(guān)的核基因和通路，然后測量網(wǎng)絡(luò)中核基因到一個(gè)線粒體基因的邊緣強(qiáng)度，基于所有核基因的排名進(jìn)行GSEA富集分析。
結(jié)果顯示氧化磷酸化是最顯著的富集通路，并且在13種被檢測的癌癥類型中有8種顯著富集(FDR < 0.05)，突出線粒體基因在能量生成中的重要作用（圖6b）。
其他癌癥發(fā)生中起重要作用的通路也在多種癌癥中富集，包括與細(xì)胞周期相關(guān)的通路（MYC靶點(diǎn)、有絲分裂紡錘體、G2/M檢查點(diǎn)和E2F靶點(diǎn)）和DNA修復(fù)，已有研究認(rèn)為mtDNA在這些通路中扮演重要角色。
最后作者檢測了以mtDNA為中心的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（圖6c）。結(jié)果顯示mtDNA幾乎在所有癌癥類型中都強(qiáng)共表達(dá)，作者認(rèn)為是由于mtDNA基因被轉(zhuǎn)錄為長的多順反子前體（long polycistronic precursor transcripts）。此外，多個(gè)臨床應(yīng)用的基因與mtDNA基因呈強(qiáng)共表達(dá)模式，例如在前列腺癌中，AR、EGFR、DDR2、MAP2K2與mtDNA基因共表達(dá)，而TMPRSS2、NF1、PIK3CA、BRCA1和TOP1是mtDNA基因在多種癌癥中最鄰近的基因。
2022年6月2日，來自瑞典哥德堡大學(xué) Maria Falkenberg和卡羅琳斯卡醫(yī)學(xué)院B. Martin Hllberg合作在Cell上發(fā)表了文章Non-coding 7S RNA inhibits transcription via mitochondrial RNA polymerase dimerization，闡明了一個(gè)全新的線粒體基因調(diào)控機(jī)制：一個(gè)mtDNA自身編碼的小RNA（不在上述37個(gè)基因之中）可以特異性結(jié)合到線粒體轉(zhuǎn)錄酶（POLRMT）上，誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，從而控制mtDNA的基因表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)為治療諸多相關(guān)疾病提供了新的思路。
在1974年，兩名美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)人類線粒體基因組中有一個(gè)長度僅188個(gè)核苷酸的小RNA，并根據(jù)其在超速離心中的沉降系數(shù)將其定名為7S RNA。近50年過去了，人們對(duì)它的功能仍一無所知。在這項(xiàng)新研究中，研究人員證明了7S RNA抑制線粒體基因表達(dá)。他們首先合成并純化了7S RNA，發(fā)現(xiàn)它可以抑制體外構(gòu)建的線粒體轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)的活性。進(jìn)一步分析顯示它的抑制作用針對(duì)POLRMT。隨后他們使用低溫電子顯微鏡（Cryo-EM）發(fā)現(xiàn)7S RNA誘導(dǎo)POLRMT形成二聚體，而二聚體的POLRMT無法結(jié)合到mtDNA上，從而也無法啟動(dòng)線粒體基因表達(dá)。
(A)人類線粒體基因組的轉(zhuǎn)錄。下圖:圓形人類線粒體基因組(mtDNA)的簡化圖，顯示了線粒體啟動(dòng)子(LSP和HSP)的位置以及每個(gè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向。上圖:放大的非編碼區(qū)(non-coding region, NCR)，強(qiáng)調(diào)LSP的兩種典型產(chǎn)物:7S RNA和LS轉(zhuǎn)錄本。在LSP的下游有三個(gè)保守的序列塊。
(B)線性模板上HSP或LSP的體外轉(zhuǎn)錄在不同時(shí)間點(diǎn)終止(0、2.5、5、10、15、20、40和60分鐘)。CSB II區(qū)域轉(zhuǎn)錄本和徑流(RO)轉(zhuǎn)錄本被指出。上面給出了包含HSP的重鏈模板和包含LSP的輕鏈模板的原理圖。
(C)繪制了三種DNA模板隨時(shí)間變化的轉(zhuǎn)錄水平。
(D)使用含有0.400 nM 7S RNA存在的LSP的線性模板進(jìn)行體外mtDNA轉(zhuǎn)錄。
(E)在7S RNA或隨機(jī)RNA存在下，線性LSP模板上的體外轉(zhuǎn)錄相對(duì)定量(平均SD, n = 3)。
(F)增加POLRMT (20 120 nM)的濃度可以恢復(fù)7S RNA (40 nM)存在下的線性LSP轉(zhuǎn)錄。
(G)在7S RNA(0或40 nM)和TEFM(0、20、40、80 nM)的存在下，使用長線性LSP模板(3000 nt)的體外LSP轉(zhuǎn)錄。
(H)分離起始期和延長期的轉(zhuǎn)錄脈沖追逐實(shí)驗(yàn)示意圖。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)首先在只有32P-UTP(脈沖)的情況下組裝90 s。隨著添加完整的冷NTPs (chase)，延伸率繼續(xù)增加。在脈沖期或追逐期的起始點(diǎn)加入7S RNA。
(I) 7S RNA、POLRMT以及7S RNA和POLRMT一起預(yù)孵育的分析凝膠過濾，在Superdex 200柱上進(jìn)行。分別監(jiān)測POLRMT和7S RNA在280和260 nm處的吸光度(mAU)。
(J)根據(jù)參照蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算復(fù)合物中POLRMT和7S RNA的分子量，該標(biāo)準(zhǔn)曲線由分子量對(duì)洗脫體積的對(duì)數(shù)(在I中凝膠過濾)構(gòu)建。
(K)不含蛋白質(zhì)的7S RNA的RNase I印跡(N/A)， POLRMT (P)， TFB2M (B)，或兩者都有(P + B). RNase T1 (T1)和NaOH (OH)處理的7S RNA作為完全消化對(duì)照。
(L)人類7S RNA和CSB區(qū)域示意圖在頂部。使用線性LSP模板在存在0 80 nM的7S RNA片段的體外LSP轉(zhuǎn)錄。
(A)75個(gè)線粒體mtrna相關(guān)基因7sRNA siRNA差異火山圖。
(B)7sRNA 在siCtrl、siSUV3和siPNPT1 HeLa細(xì)胞中的代表性ScanR圖像。
(C)垂直散點(diǎn)圖顯示ScanR檢測到的每個(gè)細(xì)胞7S RNA強(qiáng)度。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單獨(dú)的單元格。
(D)重組人mtEXO復(fù)合物降解7S RNA。左:7S RNA (16 nM)與增加濃度的mtEXO復(fù)合物或SUV3孵育。
(E) 7S RNA在sitrl、siSUV3或siPNPT1 HeLa細(xì)胞中的Northern blot。每個(gè)通道都裝載了等量的RNA。
(F)與(D)相同，在HeLa細(xì)胞中使用10 3個(gè)以上的RNA，不使用siRNA(對(duì)照)和混亂對(duì)照(siCtrl)處理。
(G) northern blot檢測HeLa細(xì)胞中siCtrl、siSUV3或siPNPT1線粒體mRNA和rRNA (12S)。裝載控制:18S RNA。
(H) Denovo在siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞中合成mtRNA。
(A) 7sRNA FISH和COXIV免疫染色雙標(biāo)記的siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞的代表性共聚焦顯微鏡圖像。
(B)垂直散點(diǎn)圖顯示7S RNA顆粒的最大Feret直徑。
(C) 7S RNA FISH和POLRMT免疫染色雙標(biāo)記siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞的代表性結(jié)構(gòu)照明顯微鏡(SIM)圖像。比例尺，10mm。與(A)相比，在siCtrl細(xì)胞中強(qiáng)度增強(qiáng)，呈現(xiàn)POLRMT和7S RNA的共定位。放大的區(qū)域由白色虛線和標(biāo)杠表示，1mm。
(D)顆粒狀的POLRMT和7S RNA熒光信號(hào)的百分比。
(E)圖中POLRMT和7S RNA之間的Mander共定位系數(shù)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)單個(gè)細(xì)胞。
(F)穩(wěn)定RNA (mtRNA)、新合成RNA (BrU)和COXIV免疫染色三標(biāo)記的siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞的代表性共聚焦顯微鏡圖像。
(G) Manders新合成的RNA (BrU)與穩(wěn)定的RNA (mtRNA)在全細(xì)胞或顆粒(siSUV3)中的共定位系數(shù)。
(A)從頭合成了siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞的mtDNA和7S DNA。
(B) 7S RNA FISH和dsDNA免疫染色共標(biāo)記的具有代表性的HeLa細(xì)胞siCtrl、siSUV3和siPNPT1共聚焦顯微鏡圖像。7S RNA是綠色的;dsDNA用紅色表示;DAPI用藍(lán)色表示。
(C)用7S RNA FISH和dsDNA免疫染色共同標(biāo)記的siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞的代表性共聚焦和受激發(fā)射耗盡(STED)顯微鏡圖像。
(D)共聚焦和STED顯微鏡圖像中siCtrl和siSUV3 HeLa細(xì)胞類核直徑的相對(duì)頻率和平均值。
(E)基于共聚焦的7S RNA和dsDNA強(qiáng)度譜和來自(C) siCtrl細(xì)胞插入的STED顯微鏡圖像的行掃描分析。
(A)與線粒體轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物結(jié)合的DNase I足跡模板示意圖。TFAM誘導(dǎo)DNA模板上的u型結(jié)構(gòu)，并在啟動(dòng)子處招募POLRMT和TFB2M。
(B) DNase I足跡顯示，增加7S RNA的濃度(0.1:1,1:1,3:1 7S RNA:POLRMT)可以抑制POLRMT和TFB2M在TSS的結(jié)合(箭頭)。蛋白質(zhì)分別與DNA模板或7S RNA孵育10分鐘。TFAM結(jié)合位點(diǎn)(綠色)、POLRMT + TFB2M結(jié)合位點(diǎn)(黃色/橙色)和TSS的位置/方向顯示。
(C) 包含LSP TSS的DNase I裂解產(chǎn)物的密度分布。所示的DNA序列(x軸)是非模板鏈(5030方向)。
線粒體基因組編碼氧化磷酸化系統(tǒng)的13個(gè)組成部分，并改變線粒體轉(zhuǎn)錄驅(qū)動(dòng)各種人類病理。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，一種被稱為7S RNA的多聚腺苷化的非編碼RNA分子從光鏈啟動(dòng)子的直接下游區(qū)域轉(zhuǎn)錄，其水平隨著生理?xiàng)l件的變化而迅速變化。在這里，我們報(bào)道了7S RNA具有調(diào)節(jié)功能，因?yàn)樗刂屏梭w外和培養(yǎng)的人類細(xì)胞的線粒體轉(zhuǎn)錄水平。利用低溫em，我們表明POLRMT二聚是誘導(dǎo)與7S RNA的相互作用。由此產(chǎn)生的POLRMT二聚體界面會(huì)隔離啟動(dòng)子識(shí)別和解開所必需的結(jié)構(gòu)域，從而阻止轉(zhuǎn)錄起始。我們提出，非編碼的7S RNA分子是調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞線粒體轉(zhuǎn)錄的負(fù)反饋回路的一個(gè)組成部分。
線粒體基因表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程， 那么去除7S RNA，從而恢復(fù)POLRMT功能的機(jī)制是什么呢？針對(duì)這個(gè)問題，該文作者們繼續(xù)研究并發(fā)現(xiàn)RNA降解酶復(fù)合體mtEXO可以降解7S RNA，從而形成一個(gè)完整的負(fù)反饋控制系統(tǒng)：POLRMT以單體形式結(jié)合到mtDNA上啟動(dòng)表達(dá)，生成7S RNA。7S RNA反過來誘導(dǎo)POLRMT形成二聚體，抑制其活性。而mtEXO可以降解7S RNA，使得POLRMT恢復(fù)活性。
“小RNA分子在細(xì)胞核內(nèi)起著很重要的調(diào)控作用，我們的這項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可以調(diào)控線粒體基因表達(dá)的小RNA。這一全新的調(diào)控機(jī)理會(huì)為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和思路?！?研究第一作者朱雪峰。研究團(tuán)隊(duì)接下來將致力于研究這一調(diào)控機(jī)理如何在體內(nèi)感應(yīng)能量和代謝的變化以及如何在不同疾病中發(fā)揮作用。
線粒體障礙在臨床上可影響體內(nèi)的多個(gè)系統(tǒng)，尤其是那些需要消耗大量能量的組織或器官。目前的研究結(jié)果表明，線粒體治療的效果顯著，且可比一般藥物維持更長的時(shí)間；此外，自體的線粒體治療尚未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，這些均說明線粒體在一定程度上具有成藥性。但線粒體提取純化的質(zhì)量控制還有待標(biāo)準(zhǔn)化。 向細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)充線粒體往往會(huì)出現(xiàn)廣泛的網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)，其機(jī)制復(fù)雜且網(wǎng)點(diǎn)眾多，這是由于線粒體本身是一種多功能的細(xì)胞器，但最終的表現(xiàn)則是明確的細(xì)胞存活或死亡的兩極效果。需要說明的是，線粒體治療的具體分子機(jī)制的相關(guān)問題仍有待解答，例如，線粒體通透組織屏障的方式、細(xì)胞對(duì)外源線粒體的相容性等，這些問題的解決將對(duì)揭示線粒體治療的機(jī)制至關(guān)重要。盡管如此，作為一個(gè)新興的方法，線粒體對(duì)疾病的治療引人注目并值得期待。
