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哈嘍，大家好，小編今天給大家分享一篇文章是今年四月發(fā)表在Frontiers in Oncology雜志的，題為‘Establishment and validation of a ferroptosis-related prognostic signature for hepatocellular carcinoma’.
一背景
肝細胞癌 (HCC) 是常見原發(fā)性肝癌之一，常預(yù)后不佳。 HCC 的主要特點是其診斷時間晚、容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高。 盡管有更先進的治療技術(shù)，但HCC的總體發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，HCC的預(yù)后仍很差。
鐵死亡于 2012 年首次提出的，典型形態(tài)學(xué)特征包括線粒體異常和壞死樣變化。 主要通過外源性和內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)膜轉(zhuǎn)運蛋白和抗氧化酶的作用來調(diào)節(jié)細胞對鐵死亡的敏感性。 鐵死亡相關(guān)基因 (FRG) 可分為 3 類：鐵死亡抑制因子 (SOF)、鐵死亡驅(qū)動因子 (DOF) 和其他基因。大量研究表明，鐵死亡在腫瘤發(fā)生過程中具有促進和抑制腫瘤的雙重作用，這不僅取決于癌基因和腫瘤抑制因子，還取決于損傷相關(guān)分子模式 (DAMP) 的釋放。 鐵死亡損傷可引發(fā)炎癥，進一步促進腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，也可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中與炎癥相關(guān)的免疫抑制，這可能有助于腫瘤生長。因此，作者進行了此項研究來說明 DOFs 誘導(dǎo)的鐵死亡對 HCC 預(yù)后有影響。本研究的數(shù)據(jù)集信息和工作流程如圖 1 所示。
圖1
二結(jié)果
1. 差異表達基因的鑒定
作者首先從 TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載了 424 個樣本，其中包含 50 個正常樣本和 374 個 HCC 樣本。 經(jīng)過差異分析，在腫瘤和正常樣本之間篩選了7597個差異表達基因（圖 2A）。 此外，從 FerrDb 獲得了 264 個差異表達的氧化應(yīng)激基因(DOFs)。 將差異表達基因和 DOFs取交集后，作者篩選出 70 個差異表達的 DOFs（圖 2B）。
2. 預(yù)后模型的構(gòu)建與驗證
作者最終納入304 個樣本，并將 HCC 樣本按 7:3 的比例隨機分為訓(xùn)練集和測試集。隨后作者對訓(xùn)練集中的 70 個 DOFs基因 進行了單變量 Cox 回歸分析。 結(jié)果表明，23 個 DOFs 具有統(tǒng)計學(xué)意義 (p<0.05)，可能具有預(yù)后價值。 隨后，作者進行了 LASSO Cox 回歸分析（圖 2C、D）。 最后，確定了由 G6PD、HRAS、NRAS、TIMM9 和 MYCN 組成的五個基因（圖 2E）。 正常組織和腫瘤組織之間的熱圖顯示了這五個基因的表達的表達（圖 2F）。
圖2
根據(jù)風(fēng)險評分的中值將訓(xùn)練集中的患者分為低風(fēng)險組和高風(fēng)險組。 Kaplan-Meier 曲線顯示，高風(fēng)險組患者與較差的總生存期顯著相關(guān)（圖 3A）。 結(jié)果也在測試集和總數(shù)據(jù)集中得到驗證（圖 3B、C）。 訓(xùn)練集中的 AUC 分數(shù)分別為 0.815、0.693 和 0.678，1 年、2 年和 3 年的臨界值分別為 1.714、2.012 和 2.012（圖 3D）。 對于測試集，1 年、2 年和 3 年的 AUC 分數(shù)分別達到 0.837、0.756 和 0.754，臨界值為 1.278。 （圖 3E）。 整個數(shù)據(jù)集的 AUC 評分均高于 0.69，1 年、2 年、3 年的臨界值分別為 1.714、2,050 和 1.704（圖 3F）。 訓(xùn)練集和兩個驗證集中五個基因的風(fēng)險評分、生存時間和生存狀態(tài)以及基因表達如圖3G-I所示。 總的來說，這些結(jié)果表明了預(yù)后模型的準確性和穩(wěn)健性。
圖3
3.預(yù)后與臨床之間的關(guān)系
作者評估了風(fēng)險模型在具有不同臨床特征亞組的總數(shù)據(jù)集中的預(yù)后意義。 可以看出在高風(fēng)險組中年齡和分期都有意義（圖 4A-F）。 分層分析結(jié)果證實了模型在亞組中的適用性。 作者還分析了五個基因在不同腫瘤等級中的表達。 結(jié)果表明，除 MYCN 外，大多數(shù)基因在 G3 和 G4 中上調(diào)（圖 4G-K）。 這表明預(yù)后特征與腫瘤分級顯著相關(guān)。
圖4
4. 預(yù)后基因的外部驗證
作者選取了兩個外部數(shù)據(jù)集 GEO (GSE14520) 和 ICGC 數(shù)據(jù)集進行驗證。 Kaplan-Meier 曲線表明，高風(fēng)險組患者的總體生存率低于低風(fēng)險組患者（圖 5A、B）。 根據(jù) ROC 分析，GEO 隊列在 1、2 和 3 年時的 AUC 分數(shù)分別為 0.641、0.629 和 0.607（圖 5C）。 對于 ICGC 隊列，1 年、2 年和 3 年的 AUC 分數(shù)分別達到 0.637、0.606 和 0.601（圖 5D）。 與TCGA數(shù)據(jù)集一致，GEO隊列和ICGC隊列各患者風(fēng)險評分和生存狀態(tài)分布趨勢相同，高危組G6PD、HRAS、NRAS、MYCN和TIMM9表達增加（圖5E、F）。
圖5
5. 列線圖的構(gòu)建和驗證
作者利用單變量和多變量Cox回歸分析來確定風(fēng)險評分和其他臨床病理因素是否是HCC預(yù)后的獨立因素。 單變量 Cox 分析結(jié)果顯示，分期、病理 T 和風(fēng)險評分與 OS 顯著相關(guān)（圖 6A）。 同時，只有風(fēng)險評分在多變量 Cox 分析中顯示出相似的結(jié)果（圖 6B）。 這些結(jié)果表明，風(fēng)險評分可作為 HCC 的獨立預(yù)后因素。 根據(jù) TCGA總數(shù)據(jù)集中的單變量和多變量分析結(jié)果，建立列線圖（圖 6C）。 1 年、2 年和 3 年總生存預(yù)測的 AUC 分別為 0.819、0.710 和 0.691（圖 6D）。 以上結(jié)果驗證了列線圖預(yù)測HCC患者預(yù)后的準確性。
圖6
6.功能富集分析
GO-BP富集分析表明，這些高危組和低危組之間的DEGs主要富集在核分裂和有絲分裂核分裂中。 在 GO 細胞成分 (GO-CC) 分析中，這些 DEGs 在染色體區(qū)域、染色體和著絲粒區(qū)域中顯著富集。 對于 GO-分子功能 (GO-MF) 分析，這些 DEGs 與類固醇羥化酶活性、花生四烯酸單加氧酶活性等相關(guān)（圖 7A、B）。KEGG通路富集分析顯示，高危組在剪接體、堿基切除修復(fù)、RNA降解和卵母細胞減數(shù)分裂等方面顯著富集（圖7C）。 同時，高危組患者也參與了P53等腫瘤相關(guān)信號通路（圖7C）。 此外，低風(fēng)險組也參與了多個代謝過程，包括補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、初級膽汁酸生物合成、藥物代謝細胞色素P450、脂肪酸代謝和視黃醇代謝（圖7D）。 此外，GSEA 分析以及反應(yīng)組通路表明，與高危人群相關(guān)的通路主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和 SARS-CoV-2（包括 TP53 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、tRNA 加工、SARS-CoV-2 感染）（圖 7E）。 在低風(fēng)險組中，富集的反應(yīng)組通路也參與了代謝過程，例如支鏈氨基酸分解代謝、按底物類型排列的細胞色素 P450 和化合物的 I 相功能化（圖 7F）。
圖7
7.蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
作者利用Cytoscape軟件的CytoHubba功能尋找G6PD和MYCN的hub基因。 結(jié)果表明，ENO2是G6PD和MYCN的交集（圖8A）。
8. 基因突變分析
作者從 TCGA 數(shù)據(jù)集下載突變數(shù)據(jù)后，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的 TMB 沒有顯著差異。 然而，高 TMB 和高風(fēng)險組患者的預(yù)后比其他組更差（圖 8F）。 瀑布圖顯示了兩個風(fēng)險亞組中的改變頻率最高的前 20 個基因（圖 8B、C）。此外，在這兩個組中，錯義突變、單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 和 C> T突變分別為不同分類類別的主要突變類型（圖8D、E）。 作者還展示了中值變異和變異類型（圖 8D、E）。 在整個樣本中，5個預(yù)后基因的突變率都不高，只有NRAS和MYCN會發(fā)生突變（圖8G）。 錯義突變也是主要類型（圖8G）。
圖8
9. 風(fēng)險評分與免疫微環(huán)境的相關(guān)性
腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞影響腫瘤的生物學(xué)行為。結(jié)果表明中性粒細胞、巨噬細胞、DCs 和 CD8+T 細胞與高風(fēng)險組相關(guān)(圖9A-D)。 然而，CD4+T 細胞和 B 細胞與風(fēng)險評分沒有顯著關(guān)系（圖 9E、F）。 此外，屬于高危組的HCC患者Treg細胞、Th1細胞、巨噬細胞、衰竭細胞和CD8+T細胞等免疫細胞比例較高，而幼稚CD8+T細胞、Th17細胞和單核細胞比例較低（圖9G）。
圖9
10. 免疫治療反應(yīng)和免疫檢查點
作者探討了風(fēng)險評分與四種免疫檢查點基因（PDCD1、CTLA4、LAG3 和 VEGFA）之間的關(guān)聯(lián)。 結(jié)果顯示免疫檢查點的表達存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異，在高風(fēng)險組中更高（圖 10A-D）。同樣，這些 ICG 的表達在高風(fēng)險組中更高（圖 10G）。 作者還發(fā)現(xiàn)，與 T 細胞組相比，G6PD、NRAS 和 HRAS 可能與腫瘤細胞/APC/DC 組中的大多數(shù) IGC 呈中度正相關(guān)（圖 10H）。 作者使用了 TIDE 算法進一步評估患者對免疫治療的反應(yīng)，可以看出TIDE 評分較低的患者可能會從免疫治療中受益（圖 10E、F）。
圖10
11.化療藥物敏感性
作者還通過比較高風(fēng)險組和低風(fēng)險組之間的 IC50 值來分析化學(xué)治療藥物的功效（圖 11）。 結(jié)果顯示，高危組患者絲裂霉素C、博來霉素、貝沙羅汀、吉西他濱、多柔比星和替比法尼的IC50均低于低危組患者，說明這些化療藥物可能對高危組患者有較好的療效。
圖11
12.風(fēng)險模型中基因的mRNA相對表達量
作者選擇了NRAS 和 HRAS這兩個基因進行 qPCR。 結(jié)果顯示這兩個基因在 HCC 和癌旁組織之間是有差異的（圖 12A、B）。
圖12
到這里這篇文章小編就介紹完了，本文結(jié)構(gòu)清晰，邏輯嚴謹，在這項研究中，在本研究中，作者首先從公共數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)數(shù)據(jù)。 隨后，建立了一個由五個 DOFs 組成的預(yù)后模型，并在測試集和總數(shù)據(jù)集中分別對其進行了驗證。 同時, 還比較了高危組和低危組之間的免疫浸潤、免疫治療反應(yīng)和化療藥物敏感性。 此外，作者通過定量實時 PCR (qRT-PCR) 分析，比較了這五個基因在腫瘤和正常組織中的表達情況。
綜上所述, 這五種鐵死亡基因顯示了 HCC 患者預(yù)后的潛力，可被視為這些患者免疫治療反應(yīng)的有價值的生物標志物。
