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今天給大家分享一篇2022年12月12日發(fā)表在Cancer cell(IF:38.585)上，非小細胞肺癌中組織駐留中性粒細胞的多樣性和可塑性有關的文章。
High-resolution single-cell atlas reveals diversity and plasticity of tissue-resident neutrophils in non-small cell lung cancer
非小細胞肺癌中組織駐留中性粒細胞的多樣性和可塑性
一．研究背景
非小細胞肺癌(NSCLC)具有高度分子異質(zhì)性和不同的免疫細胞浸潤模式，這與治療敏感性和耐藥性有關。然而，對不同患者亞群中免疫細胞表型如何變化知之甚少。在這個工作中，作者通過整合來自29個數(shù)據(jù)集的318例患者的556個樣本的1,283,972個單細胞，高分辨率地解析NSCLC腫瘤微環(huán)境。作者將患者分層為ID型、B型、T型和M型。他們使用具有基因組和臨床信息的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)，確定了與腫瘤組織學和基因型相關的細胞組分。
然后，作者重點分析了組織駐留中性粒細胞(TRNs)，并揭示了在微環(huán)境中獲得新功能新特性的不同亞群，為TRNs的可塑性提供了證據(jù)。最后，作者還發(fā)現(xiàn)TRNs相關的基因與anti-PD-L1治療療效差相關。
二．研究結(jié)果
1、核心NSCLC單細胞圖譜的生成以及UKIM-V數(shù)據(jù)集映射
作者首先通過整合29個數(shù)據(jù)集的scRNA-seq數(shù)據(jù)，產(chǎn)生了NSCLC核心單細胞圖譜(圖1A)?？傮w而言，核心單細胞圖譜集成了898,422個單細胞，包括169,223個上皮細胞，670,409個免疫細胞，以及58,790個基質(zhì)和內(nèi)皮細胞(圖1B)，這些細胞被注釋為12種主要細胞類型和44種細胞亞型。此外，相對于10X，Smart-seq2等其他平臺，通過BD-Rhapsody平臺測序的UKIM-V數(shù)據(jù)集，捕獲到更多的中性粒細胞 (圖1C，1D)。
作者使用scArches算法，將NSCLC核心單細胞圖譜作為參考數(shù)據(jù)集，對UKIM-V數(shù)據(jù)集進行映射 (圖1E)。他們發(fā)現(xiàn)LUSC中中性粒細胞的比例明顯更高，而LUAD中巨噬細胞、CD4+ T細胞、2型肺泡細胞、過渡型棒狀細胞/2型肺泡細胞(transitional club/AT2)更為豐富(圖1F)。為了驗證研究結(jié)果，作者采用110例NSCLC患者的外部隊列進行驗證，并對中性粒細胞、CD4+ T細胞和巨噬細胞進行免疫組織化學染色，證實了上述發(fā)現(xiàn)(圖1G)。
2.不同的NSCLC腫瘤免疫表型
接下來，作者根據(jù)TME的浸潤模式對NSCLC患者進行分層，共得到四種不同的腫瘤免疫表型:(1)免疫沙漠腫瘤亞型(ID;即沒有明顯的免疫細胞浸潤，但癌細胞分數(shù)很高);(2) B細胞腫瘤亞型(B;以B細胞、漿細胞、肥大細胞為主);(3)髓系細胞腫瘤亞型(M;巨噬細胞、單核細胞為主);(4) T細胞腫瘤亞型(T;CD8+T, CD4+T,Treg) (圖2A)。
為了識別基于腫瘤細胞TME的浸潤模式的特征，作者接下來分析了四種免疫表型中的差異富集通路，發(fā)現(xiàn)ID亞型雄激素通路明顯下調(diào) (圖2B)。此前，雄激素受體信號通路已被證明可以抑制肝細胞癌中的PD-L1轉(zhuǎn)錄，并可能因此發(fā)揮免疫激活作用。
然后，作者應用CytoSig算法來識別每種免疫表型腫瘤細胞中富集的細胞因子信號特征(圖2C)。正如預期，ID組中的大多數(shù)細胞因子信號都下調(diào)了;只有免疫抑制調(diào)節(jié)劑白細胞介素-4 (IL-4)顯著升高(圖2C)。他們發(fā)現(xiàn)M組中干擾素I-III型信號顯著上調(diào)，這表明巨噬細胞/單核細胞在TME中干擾素信號傳導中起著特別重要的作用(圖2C)。
3. 細胞互作分析揭示TME的異質(zhì)性
作者利用CellPhoneDB進行細胞互作分析LUAD和LUSC腫瘤微環(huán)境之間配體-受體互作的差異(圖3A)。作者發(fā)現(xiàn)，在LUAD中腫瘤細胞與中性粒細胞、巨噬細胞/單核細胞、肥大細胞和經(jīng)典樹突狀細胞之間的KDR-VEGFA信號軸顯著上調(diào)，這可能與免疫抑制相關，以及LUAD中上調(diào)MARCO和ADGRE5-CD55信號通路均與遷移和侵襲相關。相反，LUSC腫瘤細胞上調(diào)SPP1以及JAG1-NOTCH信號通路，從而促進腫瘤進展，并通過中性粒細胞募集等方式調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境。
接下來，作者還研究了T型、B型、M型和ID型中腫瘤細胞的配體差異性表達。雖然大多數(shù)趨化因子在ID亞組中下調(diào)，但在B型、M型和T型亞組顯示了幾種趨化因子(CXCL9/10/11, CCL3/13/18)上調(diào)，這表明腫瘤細胞分泌的趨化因子有助于免疫浸潤(圖3B)。
4. 整合bulk RNA-seq數(shù)據(jù)解析基因型-免疫表型之間的關聯(lián)
在這里，作者使用Scissor算法整合NSCLC scRNA-seq和bulk RNA-seq以及基因型數(shù)據(jù)進行深度分析，發(fā)現(xiàn)EGFR、TP53、KRAS和STK11突變組中顯示出不同的免疫浸潤(圖4A-4D)。例如，在EGRF突變的LUAD患者中具有高cDC浸潤，但在KRAS和STK11突變的LUAD患者中具有較低cDC浸潤。
接下來，作者還使用Scissor算法分析了其與生存的關系?？傮w而言，伴有豐富的B細胞的NSCLC患者與生存率的改善具有顯著相關性，而富含中性粒細胞則具有較差的生存(圖4E)。為了支持該發(fā)現(xiàn)，作者使用基于bulk RNA-seq數(shù)據(jù)的反卷積算法，并證實B細胞確實與更好的預后相關 (圖4F)。最后，對CD8+ T細胞亞型的分析表明，na?ve CD8+ T細胞可顯著提高生存率 (圖4G)。
5. TME中的TRN具有新特性和功能
作者在此對NSCLC中腫瘤相關中性粒細胞（TANs）和癌旁中性粒細胞（NANs）的轉(zhuǎn)錄組特征進行了描述(圖5A，5B)。他們通過流式細胞術分析(圖5C)和免疫組化 (圖1G)在兩個外部隊列中證實了LUSC中的中性粒細胞富集。TANs表型的特征是OLR1 (LOX-1)、VEGFA、CD83、ICAM1和CXCR4的高表達，CXCR1、CXCR2、PTGS2、SELL (CD62L)、CSF3R和FCGR3B (CD16B)的低表達(圖5D)。
相對于TANs，NANs高表達中性粒細胞成熟標記基因(SELL, PTSG2, CXCR2, CXCR1, FCGR3B, MME)以及典型中性粒細胞標記基因(S100A8, S100A9, S100A12)(圖5D)。相反，TANs呈現(xiàn)老化耗竭表型，低表達SELL (CD62L)和CXCR2 (圖5D)和高表達中性粒細胞激活基因CD83(抑制性免疫檢查點)，非典型趨化因子受體CCRL2, ICAM1 (CD54)，和C15orf48以及幾種細胞因子(CCL3, CCL4L2, CCL4, CXCL2)(圖5D)。
中性粒細胞通過釋放VEGF等促血管生成因子促進癌癥血管生成。作者證明了中性粒細胞是NSCLC TME中VEGFA表達的主要來源(圖5E)。此外，過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPARG)和OLR1（編碼LOX-1）在TANs中表達升高(圖5F)。同時，進行流式細胞術分析，證實TANs中LOX-1 (OLR1)表達升高(圖5G)。并且通過流式細胞術在蛋白水平上進一步驗證TANs特征基因，包括CD83和CD54 (ICAM1)的表達升高，CD181 (CXCR1)、CD62L (SELL)和CD16的表達降低(圖5G)。最后，作者還進行了多重免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)LOX-1中性粒細胞浸潤在腫瘤組織中，但在癌旁組織中并沒有發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象(圖5H)。
6. TRN的表型分析
首先，作者將NANs分為3個亞群，TANs分為4個亞群(圖6A)。其中NAN-1群高表達激活促炎中性粒細胞的標記物S100A12和NETosis輔助因子PADI4,以及促血管生成標記物(PROK2, MMP9)。NAN-2群與NAN-1簇非常相似，但一些NAN-1特異性基因(如S100A12, PADI4, MMP9)表達減少。NAN-3呈現(xiàn)出干擾素刺激基因(GBP1, GBP5, IFIT2)的高表達(圖6B)。TAN-1顯示出高表達IL1RN，以及RIPK271和CD44，調(diào)節(jié)細胞募集和粘附 (圖6B)。TAN-2簇的特征是 MHC II類基因HLA-DRA、CD74、HLA-DMB和HLA-DRB1的表達，表明該表型具有免疫原性抗原呈遞特征 (圖6B)。隨后，通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)，與NANs相比，TANs上調(diào)HLA-DR表達，證實了抗原呈遞表型(圖6C)。TAN-3亞簇的特征是促炎細胞因子(C15orf48, CCL3, CCL4, CSTB)和LGALS3的高表達，這與中性粒細胞的激活和遷移有關(圖6B)。最后，TAN-4顯示出核糖體基因的高表達(如RPS12、RPL3、RPN2、RPL23)(圖6B)。
RNA速率分析表明從NAN-3到NAN-2和NAN-1的轉(zhuǎn)變以及NAN-3和NAN-2分別轉(zhuǎn)變?yōu)門AN-2和TAN-1, TAN-1和TAN-2轉(zhuǎn)變?yōu)樗蠺ANs子類型(圖6D，6E)。接下來，作者研究了TRNs各個亞群與CD8+ T細胞和腫瘤細胞的相互作用，揭示了NANs與TANs的不同信號傳導(圖6F)。在所有TANs亞群中，都發(fā)現(xiàn)VEGFA信號上調(diào)，再次強調(diào)了其促血管生成作用，以及SPP1信號上調(diào)，表明其免疫抑制和促遷移作用。
首先作者定義了TRN特征基因，并且其在其他細胞中具有非常低的水平表達(圖6G)。并且，他們發(fā)現(xiàn)TRN特征基因在不同TRN亞群間的表達呈異質(zhì)性(圖6H)。作者使用了來自POPLAR（atezolizumab治療隊列）和OAK（docetaxel治療隊列）的bulk RNA-seq進行整合分析發(fā)現(xiàn)TRN特征基因與anti-PD-L1治療療效差顯著相關(圖6I，圖6J) ，但在docetaxel治療隊列中則不顯著(圖6K)。
三、總結(jié)
這篇文章到這就分享結(jié)束了，小編認為有很多值得我們學習的地方?。?！隨著單細胞技術的火速興起，各種癌癥的單細胞數(shù)據(jù)越來越多，這正是我們大顯身手的時候！該研究，整合近年來發(fā)表的非小細胞肺癌單細胞數(shù)據(jù)，以及自產(chǎn)的新平臺單細胞測序數(shù)據(jù)對非小細胞肺癌腫瘤微環(huán)境進行了高精度的解析，并且發(fā)現(xiàn)了LUAD與LUSC中具有不同程度的中性粒細胞浸潤。隨后，對肺癌中的中性粒細胞進行了詳細表征，并且發(fā)現(xiàn)其與肺癌的免疫檢查點抑制劑治療療效差有關。為肺癌的免疫檢查點抑制劑的聯(lián)合治療提供了新的理論依據(jù)！
