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腫瘤微生物群促成基底樣亞型胰腺癌的侵襲性表型
Guo Wei et al. Tumor microbiome contributes to an aggressive phenotype in the basal-like subtype of pancreatic cancer.[J]. Communications biology, 2021, 4(1).
胰腺導管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是胰腺癌最常見的一種類型，是世界第三大致死癌癥。大多數(shù)PDAC患者預后不佳，5年總生存率只有9%。手術切除是PDAC治療的主要選擇，但復發(fā)率相對較高，大多數(shù)患者最終會因癌癥轉移而死亡。
在過去20年，胰腺癌已經被認為是一種炎癥驅動的腫瘤，先天性免疫和適應性免疫的不同細胞亞群通過各種機制共同促進腫瘤的發(fā)生，但是炎癥致病的確切機制還不清楚。此外，PDAC中的基底樣亞型，相對其他亞型預后更差、侵襲性更強；為探究炎癥致病機制和臨床表型的異質性，研究從胰腺癌腫瘤內微生物入手，從宿主遺傳因素、微生物組組成以及微生物組基因功能等方面，探究特定微生物組在誘導炎癥中的潛力以及對胰腺癌表型的影響。
本研究的樣本是62例手術切除的不同分子亞型的PDAC，對宿主遺傳特征和腫瘤微生物組進行了全面分析。
結果1：基底樣亞型PDAC顯示激活的抗菌免疫和炎癥反應
胰腺癌的分子分型已被多項研究證實，不同的腫瘤亞型具有不同的預后。為探究腫瘤進展異質性的原因，研究使用Chan-Seng-Yue等人（Chan-Seng-Yue, M. et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nat. Genet. 52, 231–240 (2020).）分型方案中的4個特征基因集對隊列中62個PDAC樣本的腫瘤亞型進行聚類（圖1a）。累積分布函數(shù)（Cumulative distribution function, CDF）顯示，聚類數(shù)k=2對數(shù)據(jù)集擬合不足，而k=4或5則過擬合（圖1b）。因此，最終選擇k=3作為最佳的聚類數(shù)，將隊列中的樣本劃分為三種主要的腫瘤亞型，即基底樣亞型、混合亞型和經典亞型。
Michelle等人將特征基因集2和10定義為基底樣型特征基因集，特征基因集1和6中的基因對應于Michelle等人和Moffitt等人描述的經典型特征基因集。為了驗證聚類的合理性，再次應用Moffitt等人的分型模型對樣本進行分類，得到了幾乎相同的分型結果（圖1c）。
通過比較基底樣亞型和經典亞型的基因表達，共發(fā)現(xiàn)2100個基因具有顯著差異，其中679個基因在基底樣亞型中表達上調（圖1d）。對差異表達基因進行GSEA分析顯示，基底樣亞型在DNA復制（E2F靶點、G2/M檢查點和MYC靶點）、TGF-β信號、上皮間質轉化（EMT）和炎癥反應等方面富集（圖1e）。這些發(fā)現(xiàn)表明基底樣亞型腫瘤具有更強的侵襲性表型。
另外，TNFα和干擾素-γ反應的增加反映機體處在激活的抗菌免疫狀態(tài)，為了解不同腫瘤亞型的免疫浸潤是否存在差異，研究使用CIBERSORTx評估每個樣本的免疫細胞分布，發(fā)現(xiàn)記憶B細胞、濾泡輔助性T細胞和激活的肥大細胞的水平在基底樣亞型的腫瘤中顯著升高（圖1f）。
這些數(shù)據(jù)結果提示基底樣亞型腫瘤的侵襲性可能與病原體引起的過度免疫反應和炎癥有關。
結果2：基底樣腫瘤具有獨特的微生物群落
為探究不同亞型腫瘤的異質性，采樣宏基因組測序對腫瘤內的微生物組進行研究。樣本隊列中共鑒定得到365個不同的微生物屬，菌群豐度較高的前15個類群在不同樣本和不同亞型中的相對豐度通過百分比堆積柱形圖進行了展示（圖2a, b）。不同亞型腫瘤中優(yōu)勢菌群組成相似，但豐度具有差異。其中最優(yōu)勢的假單胞菌屬（Pseudomonas）與感染相關，且已被證明與PDAC患者的短期生存有關。
為進一步研究不同腫瘤亞型的微生物組成，使用豐富度（觀察到的分類單位單元數(shù)目）、Shannon多樣性指數(shù)和Bray-Curtis多樣性度量距離來測量腫瘤微生物多樣性（圖2c）?；讟觼喰湍[瘤的微生物群落豐富度顯著高于經典型和混合型（p = 0.0017和p = 0.0026），而基底樣亞型的Shannon指數(shù)顯著低于經典型（p = 0.017）?；讟觼喰拓S富度增加，Shannon指數(shù)降低，說明雖然微生物群落組成豐富，但以少數(shù)豐富度極高的物種為主。此外，基底樣亞型的Bray-Curtis不相似性遠高于經典型和混合型。PCoA分析顯示，腫瘤樣本存在明顯的、不同亞型的聚類，即基底樣亞型和經典型/混合型。
基于這些數(shù)據(jù)結果，推斷腫瘤微生物可能在一定程度上促成了PDAC亞型的異質性。
結果3：基底樣亞型PDAC腫瘤微生物組顯著富集
腫瘤微生物組成與PDAC亞型之間的關系啟發(fā)研究者進一步探索相關微生物。在關注的屬水平上的微生物特征方面，經典型和混合型腫瘤的微生物組組成相似，但是基底樣亞型腫瘤具有相對差異的微生物組組成。共鑒定得到83個微生物屬在不同腫瘤亞型中豐度顯著不同，這些屬中，大多數(shù)在基底樣亞型腫瘤中顯著富集，可能是基底樣亞型的潛在微生物群落特征。相比之下，在經典型/混合型腫瘤中富集的微生物只有在特定病例中才高度富集，表明這兩個亞型沒有明顯的微生物組特征（圖3a, b）。熱圖可以清楚地表明基底樣亞型的腫瘤可以被區(qū)分。在基底樣亞型中豐富的微生物屬中，不動桿菌（Acinetobacter）、假單胞菌（Pseudomonas）和Sphingopyxis得到了關注（圖3c-e）。這三個屬的細菌在基底樣亞型腫瘤中明顯富集，提示它們可能影響腫瘤的進展。根據(jù)這三個細菌屬豐度將PDAC患者分為高組和低組，高組的PDAC患者預后更差（圖3f-h）。為進一步揭示在PDAC中發(fā)揮關鍵作用的關鍵物種，研究者對這3個屬細菌的種水平進行了探究，共鑒定得到4種不動桿菌、7種假單胞菌和5種Sphingopyxis，為預后的預測提供參考。
同時，補充了16S rRNA熒光原位雜交實驗（fluorescence in situ hybridization, FISH）、抗細菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）抗體免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC）實驗和16S rDNA PCR等實驗，驗證胰腺內細菌的存在不是實驗室污染物。
結果4：基底樣腫瘤中富集的微生物群落具有誘導炎癥的潛力
由于微生物基因組數(shù)據(jù)庫不完整，許多未知微生物無法被識別，研究人員嘗試構建胰腺腫瘤微生物基因目錄，以助于揭示PDAC患者腫瘤微生物組的潛在作用。基于非人讀序從頭組裝和構建宏基因組contigs，并進行基因預測，建立無冗余的微生物基因目錄。目錄包含229,282個基因，平均長度為530 bp。經過計算和檢驗，絕大多數(shù)差異基因在基底樣亞型腫瘤中特異性富集?；?960個基底樣亞型腫瘤富集的基因的熱圖顯示，基底樣亞型和經典亞型/混合亞型存在相對明顯的分層（圖4a）。
為進一步探究微生物基因在腫瘤進展中的作用，使用KEGG ortholog （KO）和eggNOG ortholog groups（OG）對基因進行功能鑒定。結果顯示，基底樣亞型的腫瘤微生物在代謝（氨基酸、核苷酸、碳水化合物和脂類的運輸和代謝）、能量生產和轉化、復制、防御機制和細胞膜/包膜生物發(fā)生等方面表現(xiàn)出富集(圖4b)；在2級KEGG功能分類下，基底樣亞型的腫瘤微生物富集到的基因在代謝水平、細胞運動性和抗微生物藥物耐藥性等功能中的表達水平提高（圖4c）；這反映出更高的致病性和更惡劣的微生物環(huán)境。這些發(fā)現(xiàn)揭示了基底樣亞型相關微生物具有誘發(fā)炎癥的潛力，有助于闡明特定微生物在癌變中的作用。
結果5：基底樣腫瘤中的微生物群與致癌基因表達程序相關
腸道微生物可以通過影響宿主基因的組織特異性表達來影響腸道生理功能和腸道疾病。為探究屬水平微生物與宿主基因功能模塊之間的關系，對此進行了相關性分型。首先將圖1d中鑒定到的差異表達基因構建成21個功能模塊，這些基因模塊在KEGG通路、GO類別或特征基因集中表現(xiàn)出顯著的富集。關聯(lián)分析表明，不動桿菌屬、假單胞菌屬、Sphingopyxis等微生物屬與菌源分子應答、脂多糖應答、補體系統(tǒng)應答功能模塊呈正相關，反映出宿主免疫的天然抗菌反應。此外，還發(fā)現(xiàn)許多癌癥相關功能，如Kras信號、EMT和MAPK信號通路也與上述細菌呈正相關。但這些細菌的豐度與膽汁酸代謝、胰腺β細胞和胰腺分泌相關的宿主功能呈負相關（圖5a）。
從這個初步結果中研究人員又提出一個精細化的相關網絡，概述4種宿主功能和3個關鍵細菌屬之間的關系，顯示宿主和細菌間明顯的相互作用。不動桿菌、假單胞菌和Sphingopyxis豐度增加，激活機體對細菌病原體的響應，且豐度增加與DNA復制、Kras信號轉導呈正相關，與膽汁酸代謝呈負相關（圖5b）。這些數(shù)據(jù)結果揭示了腫瘤微生物組對宿主細胞功能的影響，支持腫瘤微生物組在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。
結果6：宿主遺傳變異與微生物組組成具有相關性
人體內微生物的組成因個體而異，并已被證明與宿主遺傳變異密切相關。為探究PDAC患者遺傳因素對微生物組成的影響，根據(jù)DNA測序數(shù)據(jù)對每個個體進行全基因組基因分型。使用Jaccard距離估計個體之間的遺傳差異，Jaccard距離是一種衡量兩組基因差異程度的方法，范圍從0到1。并將微生物beta多樣性（Bray-Curtis度量距離）與遺傳不相似性（Jaccard距離）進行了相關性研究，二者顯著正相關（圖6a）。這表明具有相似遺傳變異的個體擁有相似的微生物組成，支持宿主遺傳因素可能在微生物組組成方面存在影響。
為進一步探究與微生物組調控相關的關鍵遺傳變異，研究人員對遺傳變異與屬水平微生物之間的關聯(lián)進行了有針對性的分析。共鑒定出134個關聯(lián)對，涉及97個SNV和29個屬（圖6b）。顯著性最強的變異位于21號染色體第10,440,242位，即BAGE基因的內含子區(qū)域，與Paucibacter屬的豐度有關。值得注意的是，一些與基因CXCL1相關的SNV與細菌豐度顯著相關。再使用較不嚴格的閾值重新篩選與微生物相關的SNV，共有39個基因從這些位點中鑒別出來。
以免疫應答相關基因作為背景，進行GO和KEGG富集分析。GO富集分析表明，潛在的調控微生物基因參與了干擾素-γ介導的信號通路和肽抗原結合；KEGG通路則主要富集在卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、自然殺傷細胞介導的細胞毒性和TNF信號通路（圖6c, d）。
為更好地將宿主與微生物的互作可視化，研究人員制作了一個由6個功能和25個微生物屬組成的相關網絡（圖6e）。
綜上發(fā)現(xiàn)表明免疫相關的功能改變可能與微生物組組成有關，遺傳變異可能也與微生物群落存在關系。
總結
本研究聚焦于PDAC中腫瘤微生物組誘導的持續(xù)性炎癥的作用，并提出基底樣亞型激活的炎癥反應在胰腺癌發(fā)生中起促進作用。詳細說明了宿主細胞功能和腫瘤微生物組之間的相互作用，提示特定微生物組組成可能存在致瘤作用。此外還證明了宿主遺傳因素對PDAC微生物組存在影響。本研究強調了PDAC異質性的微生物基礎，為患者預后預測指標和治療方法提供了新思路。
